CN104861049A - 鲍曼不动杆菌1a1s_1969重组蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种1A1S_1969的重组蛋白及其制备方法和应用，该重组蛋白包含A1S_1969的第46-414位氨基酸序列，该重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。该重组蛋白表达量高，便于分离纯化，高效安全，可以直接与佐剂配合使用，用于制备抗鲍曼不动杆菌感染的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。经动物实验证实，所述基因工程重组单价亚单位疫苗具有良好的抗鲍曼不动杆菌感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多亚单位融合疫苗研究打下基础，同时对防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。

Description

鲍曼不动杆菌1A1S_1969重组蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种鲍曼不动杆菌1A1S_1969蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)为非发酵革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界的水及土壤、医院环境及人体皮肤、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，为条件致病菌。感染的病人多是老年患者、危重疾病及机体抵抗力弱的患者，以及使用各种侵入性操作和长期使用广谱抗生素治疗的患者。国内资料表明，鲍曼不动杆菌约占临床分离的不动杆菌的70％以上。鲍曼不动杆菌对第三代和第四代头孢菌素的耐药率已达63.0％～89.9％。对四种氨基糖苷类(阿米卡星、庆大酶素、奈替米星、妥布霉素)和环丙沙星的耐药率菌达96.3％。随着鲍曼不动杆菌耐药性的发展，且治疗鲍曼不动杆菌引起的感染性疾病也变得日益复杂，因此研发安全有效的预防性和治疗性疫苗已经成为预防和治疗鲍曼不动杆菌引起的感染性疾病的重要趋势。

目前在国内外还没有鲍曼不动杆菌进入临床研究，在疫苗的研发中优势抗原的选择十分重要，传统的全菌疫苗所含疫苗成分复杂，并且有一定的毒副作用，因此安全性不高。目前国外一些学者对鲍曼不动杆菌外膜复合物疫苗进行了初步研究，但是外膜复合物成分复杂，同时含有大量的内毒素，对机体的毒副作用较大。因此研发一种质量可控，安全有效的鲍曼不动杆菌疫苗是必然的趋势。

在以往的疫苗研发中细菌外膜蛋白是一种较好的候选抗原，细菌外膜含有丰富的抗原，外膜抗原在早细菌感染初期具有粘附定植等作用，同时也能与机体产生相互作用，刺激机体产生免疫反应。在Burkholderia multivorans疫苗研究中，采用的外膜蛋白疫苗能防止细菌早期的定植和感染；在脑膜炎奈瑟菌疫苗研究中，外膜蛋白疫苗能激发机体产生较高的血清抗体水平；同样在Francisella tularensis疫苗研究中证实膜外蛋白对哺乳动物具有良好的保护性；同时在绿脓假单胞杆菌疫苗早期人体试验中，显示外膜蛋白就有良好的安全性和免疫原性；以上研究均证实了在革兰氏阴性菌中，外膜蛋白含有多种抗原可以激发机体产生抗体并与细菌表面抗原产生抗体中和作用，从而使外膜蛋白有望成为疫苗候选抗原。

发明内容

本发明提供一种鲍曼不动杆菌1A1S_1969重组蛋白及其制备方法和应用，该重组蛋白表达量高，便于分离纯化，高效安全，可以直接与佐剂配合使用，用于制备抗鲍曼不动杆菌感染的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。

本发明利用反向疫苗学筛选出一种外膜蛋白，A1S_1969蛋白是存在于鲍曼不动杆菌细胞壁上的一种蛋白，结构和功能未知。编码A1S_1969的基因表达出855个氨基酸的序列，通过信号肽分析，该蛋白含43个氨基酸的信号肽序列，如图5所示。通过三维结构预测，该成熟蛋白(44-855)可以分为主要含alpha螺旋部分(44-414)及主要含beta折叠部分(415-855)，如图6所示。因此，本发明利用基因工程技术分别构建表达表达这两部分，得到的重组蛋白分别被命名为1A1S_1969及2A1S_1969。

鉴于A1S_1969蛋白含有一个信号肽，本发明截去A1S_1969(SEQ ID NO.3)氨基端1～45位氨基酸后并选取A1S_1969的第46～414位氨基酸序列(SEQ IDNO.1)和第415～855位氨基酸(SEQ ID NO.7，其DNA序列如SEQ ID NO.8所示)分别利用SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.8作模板进行克隆、表达和酶切，优选地，获得1A1S_1969重组蛋白(SEQ ID NO.5)，再进行免疫保护性的评价。

本发明优选1A1S_1969重组蛋白，其制备时质量可控，纯化工艺简单快捷。该重组蛋白在抵抗鲍曼不动杆菌致死性感染中有较高的免疫保护性，可用作制备抗鲍曼不动杆菌感染的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。

本发明的技术方案具体如下：

1A1S_1969的重组蛋白，包含A1S_1969的第46-414位氨基酸序列的成熟肽，该重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

所述成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

所述重组蛋白通过标签蛋白GST融合表达，所述标签蛋白融合于所述1A1S_1969蛋白的N端。

该重组蛋白由融合表达并酶切后在成熟肽的氨基端加入GPLGS五个氨基酸形成。

编码1A1S_1969重组蛋白的多核苷酸。

所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.6所示或紧密结合在其的一端或两端添加或缺失若干个核苷酸得到的编码与SEQ ID NO.5所示蛋白具有相同或相似功能的重组蛋白的序列。

A1S_1969重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1)根据编码1A1S_1969蛋白的核酸序列设计正向引物P1A1S1969B1(SEQ IDNO.9)和反向引物P1A1S1969N2(SEQ ID NO.10)；根据编码2A1S_1969蛋白的核酸序列设计正向引物P2A1S1969B1(SEQ ID NO.11)和反向引物P2A1S1969N2(SEQ ID NO.12)；

2)使用步骤1设计的正向引物和反向引物，通过PCR扩增出编码1A1S_1969蛋白及2A1S_1969的基因片段；

3)步骤2)所得的基因片段克隆至表达载体，然后转化至宿主菌；

4)诱导转化后的宿主菌表达1A1S_1969重组蛋白和2A1S_1969融合蛋白；

5)纯化重组蛋白。

表达载体或宿主细胞，包含编码1A1S_1969重组蛋白的多核苷酸或宿主细胞。

所述载体是pGEX-6P-2表达载体；所述宿主细胞是大肠杆菌，所述大肠杆菌是XL1-Blue。

抗1A1S_1969蛋白的抗体。

1A1S_1969蛋白在制备预防或治疗鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。

1A1S_1969蛋白在制备鲍曼不动杆菌检测试剂盒中的应用。

本发明所述1A1S_1969蛋白，主要包含SEQ ID NO.1的氨基酸，由于融合表达并酶切后在氨基端加入GPLGS五个氨基酸形成如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

本发明用于表达1A1S_1969蛋白的重组表达载体，其包含编码所述1A1S_1969蛋白的DNA序列以及载体序列。

所述编码1A1S_1969蛋白的DNA序列可以是SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.6，或在紧密结合它们的的一端或两端添加或缺失若干个核苷酸后得到的编码与SEQ ID NO.5所示蛋白具有相同或相似功能蛋白的序列。

本发明优选采用pGEX-6p-2质粒来构建重组表达载体，表达1A1S_1969融合蛋白，其主要特点是所表达的融合蛋白中的氨基端接有一个26kDa的GST标签，该标签可作为蛋白纯化标记。与其他融合载体相比，pGEX系列载体具有纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。

本发明采用基因工程技术克隆表达此保护性抗原1A1S_1969重组蛋白，表达量高，便于分离纯化，而且高效安全。1A1S_1969重组蛋白可以直接与佐剂(如Al(OH)₃佐剂、AlPO₄佐剂、MF59、AS0₃、AS0₄、不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂、等)配合使用，优选AlPO₄佐剂用于肌肉注射免疫。

本发明的基因工程重组蛋白的表达方法具有以下6个优点：

1、A1S_1969蛋白及1A1S_1969蛋白均未用于重组亚单位疫苗领域；

2、1A1S_1969蛋白的表达质粒在原核表达系统(大肠杆菌)中诱导表达，表达量高，质量安全可控；

3、选择pGEX-6p-2表达载体，1A1S_1969重组蛋白以融合蛋白形式表达，最大限度保持了其原有的空间构象；

4、所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签就成为蛋白纯化的标记，使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性；

5、1A1S_1969融合蛋白表达率约为30％，纯化后的1A1S_1969融合蛋白纯度大于95％；

6、1A1S_1969融合蛋白能够诱导动物产生特异性的抗体。

利用本发明1A1S_1969融合蛋白制备的亚单位疫苗可通过皮下(肌肉)注射途径进行免疫接种，激发机体产生IgG抗体和细胞免疫应答。并经动物实验证实，所述基因工程重组单价亚单位疫苗具有良好的抗鲍曼不动杆菌感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多亚单位融合疫苗研究打下基础，同时为防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。

为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

附图说明

图1是1A1S_1969基因片段的PCR扩增结果，其中，泳道M：核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道1：1A1S_1969基基因片段(1107bp)的PCR扩增产物；

图2为表达载体pGEX-6p-2-1A1S_1969的酶切鉴定结果：其中，泳道M：核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道1-6：重组表达质粒pGEX-6p-2-1A1S_1969经酶切后的鉴定结果，其中泳道5-6均表示酶切后分离的片段4000bp和1107bp；

图3表示不同温度下诱导蛋白表达结果：其中，泳道M：蛋白分子量标准(Marker)泳道1：pGEX-6p-2-1A1S_1969/XL-1blue表达菌载体在16℃下诱导表达后，在上清中获得的GST融合蛋白，泳道2：pGEX-6p-2-1A1S_1969/XL-1blue表达菌在30℃下诱导表达后，在上清中获得的GST融合蛋白，泳道3：pGEX-6p-2-1A1S_1969/XL-1blue表达菌在16℃下诱导表达后，在沉淀中获得的GST融合蛋白，泳道4：pGEX-6p-2-1A1S_1969/XL-1blue表达菌在30℃下诱导表达后，在沉淀中获得的GST融合蛋白。

图4表示pGEX-6p-2-1A1S_1969/XL-1blue表达菌在30℃下诱导表达后，上清中获得含的GST融合蛋白，并用蛋白酶将GST标签切除后获得的1A1S_1969重组蛋白：其中，泳道M：蛋白分子量标准(Marker)；泳道1：酶切后，获取的1A1S_1969重组蛋白；泳道2：酶切后，获取的1A1S_1969重组蛋白；泳道3：酶切后，获取的1A1S_1969重组蛋白；

图5利用在线信号肽分析软件http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/对A1S_1969蛋白信号肽预测结果图，结果表明1-43位氨基酸为信号肽序列。

图6利用http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/在线软件对A1S_1969蛋白三维结构的预测结果，结果表明该成熟蛋白(44-855)可以分为主要含alpha螺旋部分(44-414)及主要含beta折叠部分(415-855)。

图7是重组表达载体测序后与1A1S_1969蛋白的核酸序列对比结果，结果表明，获得的序列与理论序列完全一致。

具体实施方式

本发明所使用的菌株与各种试剂如下：

1.菌株

鲍曼不动杆菌17978国际标准株由美国ACTT提供；

2.试剂

质粒pGEX-6p-2(购于GE公司)、pET-22b(购于Novagen公司)和大肠杆菌菌株XL-1 blue(购于普如汀公司)由申请人微生物教研室保存；

primeSTAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、DNA Ligat ion Mix、限制性内切酶BamH I和Not I、蛋白Marker为大连TakaRa公司产品；

质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品；

细菌基因组提取试剂盒、超薄回收试剂盒以及显色液为天根公司产品；

谷胱甘肽-琼脂糖凝胶Glutathione Sepharose 4B为美国GE Healthcare公司产品。

实施例1：鲍曼不动杆菌A1S_1969蛋白的克隆

1.首先根据鲍曼不动杆菌17978标准株A1S_1969基因序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。应用生物信息软件进行结构分析，其信号肽序列如图5所示，其空间结构分析如图6所示。

2.根据分析结果，采用PCR方法以鲍曼不动杆菌17978全基因组为模板(SEQ ID NO.4)分别扩增A1S_1969蛋白两个片段的基因片段，扩增步骤如下：

1)设计PCR引物如下，用正向引物P1A1S1969B1(SEQ ID NO：9)、反向引物P1A1S1969N2(SEQ ID NO：10)扩增第一个片段，正向引物P2A1S1969B1(SEQ ID NO：11)、反向引物P2A1S1969N2(SEQ ID NO：12)扩增第二个片段(用下划线示酶切位点碱基序列)。

正向引物P1A1S1969B1：SEQ ID NO.9

5'-CGCGGATCCGATTTCGTTGTTAGAGATATTCGTGT-3'

       BamH Ⅰ

反向引物P1A1S1969N2：SEQ ID NO.10

5'-TTATGCGGCCGCCTTAACGCTCTAAACGAACTTTAG-3'

         Not Ⅰ

正向引物P2A1S1969B1：SEQ ID NO.11

5'-CGCGGATCCACAGGTTTCTTTAAAACCGTTGATAT-3'

        BamH Ⅰ

反向引物P2A1S1969N2：SEQ ID NO.12

5'-TTATGCGGCCGCTTAGAAAGTACGACCAATTTCAA-3'

         Not Ⅰ

本实施例将编码SEQ ID NO.1所示A1S_1969蛋白氨基酸序列的DNA序列SEQ ID NO.2作为目的基因片段进行PCR扩增，但本领域技术人员应该理解，可以选择衍生自SEQ ID NO.2所示DNA序列、在其对应编码蛋白氨基酸序列氨基端缺失多个密码子后所获得的任意序列作为目的基因片段(如SEQ ID NO.6所示)。

2)-80℃冷冻库中取出保存的鲍曼不动杆菌17978菌株涂布于专用LB固体培养基上，于37℃培养过夜，再挑取单菌落接种于LB液体培养基中培养8个小时，参照细菌基因组抽提试剂盒抽提全基因组。

3)以鲍曼不动杆菌17978全基因组DNA为模板PCR扩增A1S_1969蛋白基因片段(以扩增第一个片段为例)。

PCR体系：

模板(179ng/μl)	1μl
		P1A1S1969B1(1μM)	2μl
P1A1S1969N2(1μM)	2μl
		Taq酶	0.5μl
dNTP	4μl
		Buffer	10μl
灭菌双蒸水	30.5μl
		总体积	50μl

PCR扩增反应条件98℃预变性20s，94℃变性30s，68℃退火40s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃完全延伸10min。反应完毕后使用1％的琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果，PCR扩增结果示于图1中。

4)使用凝胶回收试剂盒回收A1S_1969PCR产物。

3.PCR产物的鉴定与克隆，步骤如下：

1)BamH I和Not I酶切pGEX-6P-2质粒和A1S_1969PCR产物

酶切反应体系：

BamH I	3μl
		Not I	3μl
10×K Buffer	3μl
		0.1％BSA	6μl
Product	45μl
		总体积	60μl

37℃酶切3h。

2)使用超薄回收试剂盒回收pGEX-6P-2质粒和经BamH I和Not I酶切的PCR产物。

3)连接和转化

通过紫外分光光度计测定目的基因酶切回收产物核酸浓度：58ng/μl，pGEX-6P-2酶切回收产物核酸浓度：48ng/μl，根据载体与外源片段摩尔数一般比为1：2-10，设计以下连接反应体系。

连接反应体系：

DNA Ligation Mix	5μl
		目的基因酶切回收产物	4.5μl
PGEX-6P-2酶切回收产物	0.5μl
		总体积	10μl

混匀，16℃连接1h。

4)从-80℃冰箱取3管大肠杆菌XL-1blue感受态细胞，第一管加入pGEX-6P-2质粒，作阳性对照；第二管加入DNA连接产物；第三管不加外源DNA，作阴性对照。冰浴30min，42℃金属浴中热击90s，迅速冰浴2min。加入600μl LB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中200rp振摇1h。

各管以5000rpm室温离心5min.，弃去400μl上清，再重悬菌体，取100μl涂布于Amp抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。

5)pGEX-6p-2/1A1S_1969阳性重组质粒的筛选、鉴定

①阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落，说明感受态细胞制作正确，结果可信。挑取转化平板上分隔良好的菌落，接种于Amp抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜；

②质粒抽提：参照质粒提取试剂盒说明书进行；

③质粒DNA进行BamH I和Not I双酶切；

双酶切反应体系：

BamH I	0.5μl
		Not I	0.5μl

10×K Buffer	0.5μl
		0.1％BSA	1μl
重组质粒	8μl
		总体积	12.5μl

37℃酶切2h；

④1％的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，结果如图2，可见泳道1-4样品为构建成功的pGEX-6p-2/1A1S_1969重组质粒；

⑤pGEX-6p-2/1A1S_1969重组质粒送往北京华大基因公司测序，测序结果比对结果示于图7，可见重组质粒的目的基因片段的序列是正确的。

实施例2：鲍曼不动杆菌-17978 1A1S_1969蛋白在原核表达系统－大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定

1.目的蛋白诱导表达

1)取双酶切鉴定正确的pGEX-6P-2-1A1S_1969/XL-1blue菌液100μL加入10mL Amp抗性的TB培养基中，100rpm 37℃过夜培养，分别取过夜培养的菌液2ml加入18mL Amp抗性的TB培养基中(余下的菌液保存在4℃冰箱中备用)，37℃培养2-3h，转速250rpm，二次活化至OD600为0.8-1.2时，加入IPTG 4.4μL，使其终浓度为200μM，再置于摇床诱导表达30℃3h，16℃过夜诱导表达。

2)将诱导表达后的菌液取出，以1000rpm离心2min，弃去上清，加入1mLPBS缓冲液混匀，超声裂解3min，再4℃14000rpm离心15min,收集上清。

2.处理上清和沉淀

取谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B 20μl，用PBS洗涤3次后，将准备好的上清加入谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B中，4℃旋转过夜结合(或室温结合1h)。在4℃下以5000rpm离心3min后，使用PBS-0.25％吐温20洗涤2次，PBS洗涤一次。向结合后的谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B加入5μl 5×蛋白质上样buffer，加入处理5min，10000rpm离心2min。

沉淀用500μl PBS重悬，取20μl样加入5μl 5×蛋白质上样buffer，加入处理5min，10000rpm离心2min。

3.SDS-PAGE电泳，将5％浓缩胶灌入制胶版中，在加入蒸馏水将胶压平，室温放置30min使其凝固，将上层的蒸馏水倒干，再灌入10％分离胶，立即插上梳子，室温放置30min使其凝固备用。

4.将处理好的上清和沉淀样品分别取10μL上样，进行SDS-PAGE电泳。电压先80V电泳30min，再调至200V，电泳45min后，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果，结果示于图3，PGEX-6P-2-1A1S_1969/XL-1blue有在30℃、16℃条件下均能表达出分子量大小约为68kDa的含有GST标签的1A1S_1969蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)，且重组蛋白均在超声裂解的上清中，因此所述重组蛋白在各诱导温度条件均为可溶性蛋白，并且在30℃诱导温度目的蛋白的表达量高，其纯度达到95％。

实施例3：1A1S_1969蛋白抗原的制备

1.放大培养获取蛋白

取保存在-80℃冰箱中的pGEX-6P-2-1A1S_1969/XL-1blue菌种接种于LB氨苄抗性平板，37℃培养过夜；挑取单菌落接种于100ml LB氨苄抗性培养基，37℃，200rpm培养过夜；将活化的100ml菌液加入到2L含Amp抗性的LB培养基中进行二次活化，37℃培养3-4h至OD600为1.2时，加入420ml IPTG(终浓度为200uM)置于30℃摇床中诱导3h后，6000rpm离心5min收集菌体,再加80mlPBS重悬菌体后，将菌液进行超声裂解30min，同上离心收集上清与4ml谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B结合；获得大量的含有GST标签的1A1S_1969融合蛋白。

2.使用酶切方法，将目的蛋白和GST标签分开，获取1A1S_1969重组蛋白

向已结合目的蛋白的谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B中加入4ml PBS和120μLPreScission protease(PP酶)，4℃垂直旋转酶切过夜，离心吸取上清后，分别用2ml PBS洗涤2次，取10μL样品变性处理后，上样10μL进行SDS-PAGE蛋白电泳，在呈相系统下观察结果，酶切后获得A1S_1969蛋白分子量在42kDa左右，与预期蛋白分子量大小相符合，电泳结果示于图4，泳道1表示酶切后，第一次洗涤凝胶珠获取的目的蛋白；泳道2表示酶切后，第二次洗涤凝胶珠获取的的目的蛋白；泳道3表示酶切后，第三次洗涤凝胶珠获取的的目的蛋白。

3.置换缓冲液，将目的蛋白保存于组氨酸缓冲液中(10μm组氨酸，pH6.0)。

4.BCA法测定蛋白浓度，浓度为2.0mg/mL。

实施例4：感染用鲍曼不动杆菌(国际标准株17978)标准定量曲线的建立

将菌株接种于MH平板置于37℃孵育24小时；在平板上挑取单菌落，接种于MH液体培养基中，置于37℃恒温摇床中震荡培养6小时后6000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤菌体2次；再将菌液进行10倍和1.25倍稀释，并在紫外分光系统下测定各菌液的在600nm处的吸光度(OD600)，并取各个稀释度的菌液100μl涂布于MH平板，置于37℃孵育24小时后计数菌落；根据各个平板菌落数和菌液的OD600值绘制标准定量曲线。

结果：标准曲线公式为Y＝3.012X+0.0051(10⁹CFU/ml)，相关系数为0.9998。

实施例5：脓毒血症动物模型的构建

1.将菌株接种于MH平板置于37℃孵育24小时；在平板上挑取单菌落，接种于MH液体培养基中，置于37℃恒温摇床中震荡培养6小时后收集菌体，并利用标准曲线公式进行定量，再将菌液稀释(或浓缩)为2.0×10⁹CFU/mL、2.1×10⁹CFU/mL、4×10⁹CFU/mL不同浓度组，再用各组菌液通过腹腔注射6-8周龄、体重为18-20g的BALB/C小鼠(100μl/只)进行全身感染，同时设置生理盐水对照组，观察7天并统计各组小鼠的死亡率；

2、感染后计时在每隔24h(观察7天)采用菌落计数法对细菌定植量进行检测：从各感染组和对照组中随机选取3只小鼠，利用眼球摘除法，取小鼠血样100μl涂于平板，置于37℃，24h后计数克隆数；取完血样后将小鼠处死放入75％酒精中浸泡消毒后，取出将其四肢固定，将其解剖，取出脾、肾、肝脏，置于1mL无菌的PBS中，于洁净的玻璃匀浆器中进行匀浆，取100μl均浆按照1:10、1:100、1:1000比例进行稀释；每稀释度各取100μL轻轻涂布于固体培养基上，置于37℃，培养24h，做菌落计数。

结果显示于表1：

表1 鲍曼不动杆菌-17978感染剂量与致死剂量的确定

2.0×10⁸CFU剂量组7天内小鼠死亡率为0；2.2×10⁸CFU剂量组48h内小鼠死亡率为20％；4.2×10⁸CFU剂量组48h内小鼠死亡率为90％；由此可见鲍曼不动杆菌-17978感染剂量为2.2×10⁸CFU，亚致死剂量为4.2×10⁸CFU。

3.鲍曼不动杆菌-17978感染BALB/C小鼠后在血液和各脏器中的定植量：

感染后肺中细菌的在24h时达到峰值，最大定植量达到2.0×10⁴CFU/ml，在48h时肺中细菌量开始减少，到72h时肺中未检测出细菌；感染后肾脏中细菌的在24h时达到峰值，最大定植量达到1.0×10³CFU/ml，在48h时肺中细菌量开始减少，到72h时肺中未检测出细菌；感染后血液、脾、心脏、肝脏中定植的细菌均未检测到；对照组小鼠的血液、脾、肾、肝脏中的细菌定植检测结果均为零。

以上结果针对小鼠的生存率和血液、脾、肾、肝脏主要器官细菌定植量进行了动物模型的评价，为鲍曼不动杆菌单个亚单位疫苗和鲍曼不动杆菌亚单位融合疫苗的成功研制及鲍曼不动杆菌感染的发病机制的研究奠定了基础。

实施例6：免疫动物及抗体的检测

1.免疫动物

1)首次免疫，将1A1S_1969蛋白抗原与AlPO₄佐剂物理混合，用蛋白保存液将抗原浓度调节为200μg/ml，并置于4℃旋转吸附过夜制成疫苗；用5号半型针头，双侧腹股沟注射，每只BALB/C小鼠注射量为150μl，并设置阴性对照组(AlPO₄佐剂组)和空白对照组(蛋白保存液组)；

2)第二次免疫，第14天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量与首次免疫的相同，免疫途径同上；

3)第三次免疫，第21天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量与首次免疫的相同，免疫途径同上；

2.第三次免疫后第7和14天，采集BALB/C小鼠的血，用ELISA检测小鼠免疫后IgG体液应答水平。

1)制备液体

①包被液的配制：称取NaHCO₃ 1.6g，Na₂CO₃ 2.9g，溶于1L ddH₂O，用PH计将pH调至9.6；

②封闭液的配制：1g牛血清Ⅴ，溶于100mL抗体稀释液(1:100)；

③抗体稀释液的配制：将磷酸盐溶于1L ddH₂O，再加入500μl Tween 20，再用PH计将pH调至7.4；

④洗涤液的制备：称取2.42g Tris溶于1L ddH₂O，再加入500μl Tween 20，再用PH计将pH调至7.4；

⑤显色液(TMB)，为天根公司产品；

⑥终止液(2M H₂SO₄)的制备：将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mL ddH₂O中。

2)ELISA检测1A1S_1969重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价

①用包被液将纯化后的1A1S_1969重组蛋白稀释为10μg/mL；

②包被：将重组蛋白稀释液加入酶标板，200μl/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍；

③封闭：酶标板加封闭液100μl/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3遍；

④将血清进行1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000等倍比稀释；

⑤取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100μl/孔，,置于37℃孵育箱30min，洗涤3遍，空干；

⑥将加HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体保存液，稀释1：5000，制成抗体工作液；

⑦加入稀释抗体工作液，100μl/孔，置于37℃孵育箱45min，洗涤三遍，空干；

⑧加入底物显色液(TMB)100μl/孔，室温避光反应5min；

⑨加入终止液(2M H₂SO₄)，立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值；

⑩结果判断：A_样品A_阴性值≧2.1为阳性(阴性对照为小鼠免疫前血清)。

结果：检测1A1S_1969蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价达到1:64000；免疫后第14天的抗体阳性率达到100％；说明本发明构建的1A1S_1969重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗体。

实施例7：通过免疫小鼠确定1A1S_1969重组蛋白免疫动物的攻毒保护

同实施例6的免疫方案，第三次免疫小鼠后，在第14天采用致死剂量，腹腔注射鲍曼不动杆菌-17978活菌进行攻毒实验，每只BALB/C小鼠注射菌液量为4×10⁸CFU，观察10天，统计各组小鼠的存活率。结果示于表2。

表2

表2显示：为四次动物免疫试验(每次实验为10只小鼠)结果，表中结果显示阴性对照组和空白对照组的平均免疫保护率分别为16.66％和10％，1A1S_1969重组蛋白辅以AlPO₄佐剂组的平均免疫保护率为50％。

因此，本发明的1A1S_1969重组蛋白具有良好的免疫原性，并且能够对鲍曼不动杆菌-17978感染起到免疫保护性作用，能够诱导机体产生免疫应答，可以例如辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防鲍曼不动杆菌的感染。

通过以上实施例，本领域技术人员利用本领域普通技术知识可以显而易见地应用本发明所制备的重组蛋白与其他相关试剂，例如包被试剂、检测抗体、显色剂、终止剂等制备相关试剂盒，例如检测试剂盒，用于诊断是否感染鲍曼不动杆菌、确定预后等。

本领域技术人员可以将本发明1A1S_1969重组蛋白用于其他任何适用的用途。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。

Claims (12)

1.一种1A1S_1969的重组蛋白，其特征在于：包含A1S_1969的第46-414位氨基酸序列，所述的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于：该重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

3.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白通过标签蛋白GST融合表达，所述标签蛋白融合于所述1A1S_1969蛋白的N端。

4.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于：该重组蛋白由融合表达并酶切后在权利要求1所述的氨基端加入GPLGS五个氨基酸形成。

5.编码权利要求1所述的1A1S_1969重组蛋白的多核苷酸。

6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.6所示或紧密结合在其的一端或两端添加或缺失若干个核苷酸得到的编码与SEQ ID NO.5所示蛋白具有相同或相似功能的重组蛋白的序列。

7.权利要求1所述的1A1S_1969重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)设计PCR的引物如下：

正向引物

5'-CGCGGATCCGATTTCGTTGTTAGAGATATTCGTGT-3'

BamHⅠ

反向引物

5'-TTATGCGGCCGCCTTAACGCTCTAAACGAACTTTAG-3'

NotⅠ

2)使用步骤1)设计的引物通过PCR扩增出编码1A1S_1969蛋白目的基因片段；

3)步骤2)所得的基因片段克隆至表达载体，然后转化至宿主菌；

4)诱导转化后的宿主菌表达1A1S_1969重组蛋白；

5)纯化重组蛋白。

8.一种表达载体或宿主细胞，其特征在于：包含编码权利要求1所述重组蛋白的多核苷酸或宿主细胞。

9.根据权利要求8所述的载体或宿主细胞，其特征在于：所述载体是pGEX-6P-2表达载体；所述宿主细胞是大肠杆菌，所述大肠杆菌是XL1-Blue。

10.抗权利要求1所述的1A1S_1969蛋白的抗体。

11.权利要求1所述的1A1S_1969蛋白在制备预防或治疗鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。

12.权利要求1所述的1A1S_1969蛋白在制备鲍曼不动杆菌检测试剂盒中的应用。