CN116462743A - 鲍曼不动杆菌翻译延伸因子重组蛋白、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了鲍曼不动杆菌翻译延伸因子重组蛋白、制备方法及应用，涉及生物技术领域，该重组蛋白包括EF‑Ts蛋白，所述EF‑Ts蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明的EF‑Ts组蛋白的制备流程简单、成本低廉、易于重复，适合大规模生产。本发明产物成分单一，纯度高，相对而言安全性较高；本发明的EF‑Ts重组蛋白对动物具有显著的保护作用，且能诱导动物产生较高效价特异性抗体。本发明将鲍曼不动杆菌EF‑Ts作为重组蛋白亚单位疫苗的研究不但为研制高效预防感染或治疗性疫苗奠定了基础，同时也开拓了对鲍曼不动杆菌疫苗研究的新思路。

Description

鲍曼不动杆菌翻译延伸因子重组蛋白、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种鲍曼不动杆菌翻译延伸因子重组蛋白、制备方法及应用。
背景技术
鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）属于非发酵、需氧的革兰氏阴性杆菌，能够定植于人体，是一种重要的医院病原菌，在医院感染中占比17%，对于免疫低下个体具有更强的感染性和致病性。鲍曼不动杆菌造成的感染在不同组织和器官中表现为多种临床形式，其中以呼吸道感染和败血症最为常见，其次是继发性脑膜炎以及泌尿系统感染，特别是进展为菌血症和肺炎的患者，可能会进一步引发死亡。鲍曼不动杆菌能耐受多种环境条件，并迅速获得多重耐药性，抗生素的广泛使用导致鲍曼不动杆菌的耐药性逐渐增强，根据美国疾控中心数据显示，大部分的临床菌株具有耐药性，且占重症监护病房感染的20%。因此，急需新的药物来加强鲍曼不动杆菌的预防，但是在近几年的研究中基本没有得到效力和安全性均让人满意的抗生素，因此，开发其他预防和治疗鲍曼不动杆菌的药物至关重要。疫苗作为一种常见的预防手段，其对于感染非常有效，不会引起耐药性，且在预防细菌感染和减少抗生素的使用方面临床数据较为良好。因此开发新型、安全、有效的疫苗将对于多重耐药鲍曼不动杆菌相关感染的临床管理产生积极的影响。
重组蛋白亚单位疫苗具有成分明确、杂质含量少以及细菌内毒素含量易于控制等优点，是具有转化前景的疫苗形式。因此，获得鲍曼不动杆菌重组蛋白，可用于鲍曼不动杆菌重组蛋白亚单位疫苗的开发。
发明内容
本发明的目的在于提供鲍曼不动杆菌翻译延伸因子（translation elongationfactor Ts，EF-Ts）重组蛋白、制备方法及应用，本申请提供的鲍曼不动杆菌EF-Ts 重组蛋白能够用于制备鲍曼不动杆菌亚单位疫苗。
本发明的EF-Ts是利用反向疫苗学，从鲍曼不动杆菌基因组序列中筛选出来的可作为疫苗候选抗原的靶点蛋白之一。EF-Ts主要是在mRNA翻译过程中促进多肽链延伸的蛋白质因子，对于生物蛋白的合成具有重要作用，对于维持细菌的生长功能也具有重要作用。编码EF-Ts的基因表达出291个氨基酸的序列，分子量约31 kDa，该蛋白易于制备，且动物实验显示出较高的保护率和稳定的保护效果。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，本发明提供的鲍曼不动杆菌翻译延伸因子重组蛋白，包括EF-Ts蛋白，所述EF-Ts蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
根据一种优选实施方式，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
第二方面，本发明还提供了编码所述的鲍曼不动杆菌翻译延伸因子重组蛋白的多核苷酸。
第三方面，本发明还提供了所述的鲍曼不动杆菌翻译延伸因子重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）根据鲍曼不动杆菌的EF-Ts蛋白氨基酸序列设计PCR引物，以鲍曼不动杆菌的全基因组为模板，根据所设计的PCR引物对编码EF-Ts 蛋白氨基酸序列的目的基因片段进行PCR扩增，并回收PCR产物；其中：正向引物：5`-CGCGGATCCATGACTGCAATTACTGCAAGC-3`；反向引物：5`-TTATGCGGCCGCTTACTTCGCAGCAGCTTGAG-3`；
（2）将步骤（1）所得的PCR产物克隆至含有GST标签的表达载体，并转化至原核表达系统中进行诱导表达含有GST标签的EF-Ts融合蛋白；
（3）使用酶切方法将目的蛋白和GST标签分开，获得EF-Ts重组蛋白。
第四方面，本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包括编码所述的鲍曼不动杆菌EF-Ts 重组蛋白的多核苷酸，所述表达载体为pGEX-6P-2质粒。
第五方面，本发明还提供了一种宿主细胞，包括所述的表达载体。
根据一种优选实施方式，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。
第六方面，本发明提供了所述的鲍曼不动杆菌翻译延伸因子重组蛋白在制备治疗或预防鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。
根据一种优选实施方式，所述药物为鲍曼不动杆菌疫苗。
第七方面，本发明提供了所述的鲍曼不动杆菌翻译延伸因子重组蛋白在制备鲍曼不动杆菌检测试剂盒中的应用。
基于上述技术方案，本发明的鲍曼不动杆菌翻译延伸因子重组蛋白、制备方法及其应用至少具有如下有益效果：
（1）本发明的鲍曼不动杆菌EF-Ts重组蛋白包括鲍曼不动杆菌EF-Ts蛋白，鲍曼不动杆菌EF-Ts蛋白目前未用于重组亚单位疫苗领域。
（2）EF-Ts 蛋白的表达质粒在原核表达系统（大肠杆菌）中诱导表达，表达量高，质量安全可控。
（3）本发明选择pGEX-6P-2表达载体，EF-Ts 重组蛋白以融合蛋白可溶形式表达，最大限度保持了其原有的空间构象。
（4）本发明所表达的融合蛋白中以GST 标签作为蛋白纯化的标记，使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。
（5）利用本发明EF-Ts重组蛋白制备的亚单位疫苗可通过肌肉注射途径进行免疫接种，激发机体产生特异性高效价IgG抗体。并经动物实验证实，所述基因工程重组亚单位疫苗具有良好的抗鲍曼不动杆菌感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多价亚单位融合疫苗研究打下基础，同时为防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为EF-Ts基因片段的PCR扩增结果图；
图2为表达载体pGEX-6P-2-EF-Ts的酶切鉴定结果图；
图3为重组质粒pGEX-6p-2-EF-Ts测序与目的蛋白的DNA序列比对结果图；
图4为pGEX-6P-2-EF-Ts/BL21（DE3）表达菌株经16℃小量诱导表达后，鉴定GST-EF-Ts重组蛋白的表达情况图；
图5为pGEX-6P-2-EF-Ts/BL21（DE3）表达菌株在诱导表达后，上清中获得含GST融合蛋白，即GST-EF-Ts，用蛋白酶将GST标签切除后获得的EF-Ts重组蛋白图；
图6 为诱导表达的重组蛋白EF-Ts经过阴离子交换柱纯化后的蛋白电泳结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
1. 菌株
鲍曼不动杆菌菌株ATCC17978购自美国ACTT。
2. 试剂
质粒pGEX-6p-2（购于GE公司）、大肠杆菌菌株BL21（DE3）（购于擎科公司）；
2× High Fidelity PCR Master Mix、DNA Marker、DNA Ligation Mix购买于北京擎科生物公司；限制性内切酶BamH I和Not I购于美国NEB公司；蛋白Marker为伯乐公司产品。
质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、细菌基因组提取试剂盒、显色液为天根公司产品；
谷胱甘肽-琼脂糖凝胶Glutathione Sepharose 4B为上海生工公司产品。
实施例1：鲍曼不动杆菌EF-Ts 蛋白表达工程菌克隆。
1. 首先在NCBI数据库检索鲍曼不动杆菌EF-Ts氨基酸序列（GenBank:AIY36492.1），其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，并检索获得编码EF-Ts的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示
2. 根据序列设计PCR引物，提取鲍曼不动杆菌全基因组DNA为模板，PCR扩增编码EF-Ts蛋白的基因片段，步骤如下：
1）设计PCR引物如下，用正向引物和反向引物扩增DNA片段；
（下划线示酶切位点碱基序列）
正向引物（SEQ ID NO：4）：
5`-CGCGGATCCATGACTGCAATTACTGCAAGC-3`；
BamH I
反向引物（SEQ ID NO：5）：
5`-TTATGCGGCCGCTTACTTCGCAGCAGCTTGAG-3`；
Not I
本实施例将编码SEQ ID NO.1所示EF-Ts 蛋白氨基酸序列的DNA序列SEQ ID NO.2作为目的基因片段进行PCR扩增。但本领域技术人员应该理解，可以选择衍生自SEQ IDNO.2所示DNA序列、在其对应编码蛋白氨基酸序列氨基端缺失多个密码子后所获得的任意序列作为目的基因片段。
2）将鲍曼不动杆菌冻存菌株以划线法涂布于TSA固体培养基上，于37℃恒温孵育过夜，第二天挑取单菌落接种于TSB液体培养基中，220rpm/37℃震荡培养6小时，参照细菌基因组抽提试剂盒说明书抽提全基因组DNA。
3）以鲍曼不动杆菌全基因组DNA为模板，PCR扩增EF-Ts蛋白基因片段。
其中，PCR体系：
组分 体积（μL）
鲍曼不动杆菌基因组DNA （150 ng/μL） 2.5
正向引物 （1μM） 1
反向引物（1μM） 1
2×High Fidelity PCR Master Mix 20
总体积（用无菌去离子水补齐） 40
PCR扩增反应条件：98℃预变性10s，98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸1 min，25个循环，72℃完全延伸5 min。反应结束后用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，结果示于图1中，其中，泳道M：核酸（DNA）分子量标准（Marker）；泳道1：EF-Ts基因片段（876 bp）的PCR扩增产物，显示扩增出EF-Ts基因。
4）使用凝胶回收试剂盒回收PCR产物。
3. 原核表达质粒的连接，步骤如下：
1）BamH I和Not I酶切pGEX-6P-2质粒，BamH I和Not I酶切EF-Ts基因PCR产物。
其中，酶切反应体系：
组分 体积或质量
BamH I 2μL
Not I 2μL
10×CutSmart Buffer 4μL
PCR 产物/质粒 1μg
总体积（用无菌去离子水补齐） 40μL
37℃酶切1h。
2）使用DNA产物纯化试剂盒回收步骤1）中的两个反应液。
3）连接和转化。
通过紫外分光光度计测定步骤2）中回收产物的核酸浓度，载体与外源片段摩尔比为1:3，进行连接反应。
其中，连接反应体系：
组分 体积（μL）
T4 DNA Ligase 0.5
目的基因酶切回收产物 0.8
pGEX-6P-2酶切回收产物 4.2
10×ligation buffer 1
总体积（用无菌去离子水补齐） 10
混匀，16℃连接1 h。
4）从-80℃冰箱取3管大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，第一管加入pGEX-6P-2质粒1μL，作阳性对照；第二管加入DNA连接产物10μL；第三管不加外源DNA，作阴性对照。轻弹混匀后冰浴静置30 min，42℃水浴中热激60s，迅速放至冰浴静置5min。加入600μL LB培养基，放入摇床中，220 rpm/37℃振荡复苏1h。
各管以4000 rpm室温离心3 min，弃去400μL上清，再重悬菌体，取100μL涂布于Amp抗性LB平板，于37℃培养箱中倒置培养18 h。
5）pGEX-6P-2-EF-Ts阳性重组质粒的筛选、鉴定。
①阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落，说明感受态细胞制作正确，结果可信。挑取连接产物转化的平板上形态良好的单菌落，接种于含氨苄青霉素（工作浓度100μg/ml）的LB培养基中，220 rpm/37℃振荡培养过夜；
②质粒抽提：参照质粒提取试剂盒说明书进行；
③质粒DNA进行BamH I和Not I双酶切；
其中，双酶切反应体系 ：
组分 体积或质量
BamH I 1μL
Not I 1μL
10×CutSmart Buffer 2μL
质粒 1μg
总体积（用无菌去离子水补齐） 20μL
37℃酶切1 h；
④1%的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，结果如附图2，其中，泳道M：核酸（DNA）分子量标准（Marker）；泳道1：重组表达质粒pGEX-6P-2-EF-Ts经酶切后的鉴定结果，酶切后的片段大小分别约5000 bp和876 bp，可见泳道1样品酶切后产生的片段与EF-Ts基因片段大小相符，为构建成功的pGEX-6P-2-EF-Ts重组质粒。
⑤pGEX-6P-2-EF-Ts重组质粒送往生工生物公司进行核酸测序，经比对，测序结果与目的蛋白核酸序列完全相符，如图3所示，结果显示重组工程菌的序列正确。
实施例2：鲍曼不动杆菌EF-Ts 蛋白在原核表达系统-大肠杆菌中诱导表达及表达形式的鉴定。
1.目的蛋白诱导表达。
取双酶切鉴定正确的pGEX-6P-2-EF-Ts/BL21（DE3）菌液1μL加入10 ml含氨苄青霉素钠（工作浓度100mg/ml）的LB培养基中，220 rpm/37℃振荡培养过夜。第二天取过夜培养的菌液2 ml加入18 ml含氨苄青霉素钠的LB培养基中（余下的菌液保存在4℃冰箱中备用），220 rpm/37℃振荡培养2-3 h，待OD600为0.8-1.0时，加入1M IPTG 10μL使其终浓度为500μM，220rmp/16℃过夜诱导表达，诱导时间约16h。
2.电泳检测蛋白表达结果及表达形式。
将诱导后的菌液取出2ml，12000rpm离心1min，弃去上清，加入1 ml PBS缓冲液混匀取40μL进行制样；剩余菌悬液在冰水浴上进行超声裂解，条件设置为150W，4s on/4soff，总时间10 min；超声结束后，13000 rpm/4℃离心15 min，取上清进行制样，破菌沉淀用1 ml PBS重悬后进行制样。
本步骤的制样方法：取40μL样品与10μL 5×SDS 蛋白上样缓冲液（碧云天）混匀，100℃金属浴煮样10min。
3. SDS-PAGE电泳检测。
将制好的样品取10μL上样至蛋白胶，进行SDS-PAGE电泳。待溴酚蓝前沿迁移至胶板下沿约1 cm时停止电泳，将胶取出置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于去离子水中，微波炉加热至微沸后放至室温振荡脱色，反复脱色至凝胶背景干净透明。电泳结果示于附图4，包括是否成功表达以及其是否为可溶（即破菌上清中有一定目的蛋白含量）：泳道M为蛋白marker，泳道1为加IPTG诱导前的全菌蛋白，泳道2为诱导后的全菌蛋白，泳道3为诱导表达后破菌后的离心上清中的蛋白。
分析电泳结果得知，pGEX-6P-2-EF-Ts/BL21（DE3）在16℃条件下能成功诱导表达分子量大小约56 kDa的含有GST标签的EF-Ts融合蛋白（见图4，泳道2），并且部分蛋白为可溶表达形式即破菌上清中表达，目的蛋白如箭头所示（见图4，泳道3）（其氨基酸序列如SEQID NO.3所示）。
实施例3：EF-Ts蛋白抗原的制备。
1．放大培养获取融合蛋白GST-EF-Ts。
取保存在-80℃冰箱中的pGEX-6P-2-EF-Ts/BL21（DE3）菌种接种于LB固体培养基平板，37℃培养过夜；挑取单菌落接种于50ml LB培养基，220rpm/37℃培养过夜；取10ml菌液加入到1L LB培养基中进行二次活化，37℃培养3-4 h至OD600为0.8-1.0时，加入1M 浓度的IPTG储存液 0.5ml使其终浓度为500μM，220rmp/16℃过夜诱导表达，诱导时间约12h；6000rpm离心15min收集菌体沉淀，加100 ml PBS重悬菌体，用高压均质仪破碎菌体，离心收集上清与10ml GST填料 4℃旋转过夜结合，获得大量的含有GST标签的EF-Ts融合蛋白。
本步骤的LB固体和液体培养基均含100mg/ml氨苄青霉素。
本步骤的高压均质仪条件设置为压力800bar，循环温度4℃，流速40ml/min。
本步骤的GST填料全称GST 4FF琼脂糖纯化树脂。
2．使用酶切方法，将目的蛋白和GST标签分开，获取EF-Ts重组蛋白。
向已结合目的蛋白的GST填料中加入5ml 20mM PB（pH8.0）和1ml PreScissionprotease（PP酶），4℃旋转酶切过夜，收集酶切后的液体，分别用2ml 20mM PB（pH8.0）洗涤2次，取40μL制样，进行SDS-PAGE电泳，在成像系统下观察结果；酶切后获得EF-Ts蛋白分子量在31 kDa左右，与预期蛋白分子量大小相符合，电泳结果示于图5，泳道M为蛋白分子量标准（Marker），泳道1为诱导表达的全菌，泳道2为破菌上清与琼脂糖凝胶过夜结合后酶切前与GST填料结合的蛋白（主要是GST-EF-Ts融合蛋白和部分杂蛋白），泳道3为融合蛋白酶切GST标签后收集的蛋白（主要是EF-Ts重组蛋白），泳道4为酶切以及洗脱后残留在GST填料上的蛋白（主要是酶以及酶切后残留的GST标签）。
3.使用离子交换柱对EF-Ts重组蛋白进行进一步纯化，获取高纯度的EF-Ts重组蛋白。
在蛋白纯化仪上安装阴离子交换柱，用去离子水冲洗交换柱5-6个柱体积，用A液对柱进行充分平衡；对保存于A液中样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合，5% B液和10% B液先后进行洗杂；拉线性梯度至100% B液对目的蛋白进行洗脱，根据A280nm值收集洗脱液进行电泳检测，如图6所示，利用Image J软件扫描蛋白胶中目的蛋白条带灰度值占整个泳道的蛋白总灰度值的比例，计算得到其蛋白纯度达到97%以上。泳道M：蛋白分子量标准；泳道1：经离子交换层析精纯后的重组蛋白EF-Ts，纯度达到97%以上。
本步骤的A液为20mM PB（pH8.0），B液为20mM PB+1M NaCl（pH8.0），均用0.45μm滤膜过滤后使用。
4.将步骤3中获得的蛋白洗脱液用Sephadex G25脱盐柱置换缓冲液为PBS。
5.按照BCA法蛋白浓度测定试剂盒说明书测定蛋白浓度，最终测得浓度为0.65mg/ml。
实施例4：小鼠鲍曼不动杆菌感染模型的构建。
将鲍曼不动杆菌用三线法接种于TSA固体培养基平板，37℃恒温孵育16小时；在平板上挑取单菌落，接种于10ml TSB液体培养基中，置于37℃恒温摇床中220rpm震荡培养。5小时后收集菌体，用无菌PBS稀释15倍后测其OD600的值，并以1.5×109CFU/ml/OD600进行计算，将菌液稀释至1×108CFU/ml、2×108CFU/ml、3×108CFU/ml，4×108CFU/ml三种不同浓度，再将各组菌液经静脉注射入C57Bl/6雌性小鼠尾静脉（100μL/只）。6-8周龄、体重为18-20g的小鼠最佳。设置每组5只小鼠，连续观察7天并统计各组小鼠的死亡率。最终得到鲍曼不动杆菌感染剂量为3×107CFU/只小鼠，后续小鼠模型构建均选用此剂量。
表1：鲍曼不动杆菌致死剂量的确定
感染剂量（CFU/mouse） 小鼠（只） 七天内死亡数（只） 死亡率
1 x 107 5 0 0
2 x 107 5 2 40%
3 x 107 5 5 100%
4 x 107 5 5 100%
实施例5：EF-Ts重组蛋白亚单位疫苗的制备。
将重组EF-Ts蛋白与不同的佐剂进行吸附做预实验并检测吸附效果，发现氢氧化铝佐剂吸附效率最好，后续主要氢氧化铝作为佐剂成分，进行吸附制备亚单位疫苗。经摸索后的方法如下：量取氢氧化铝佐剂用pH6.0的组氨酸稀释液调整浓度到5 mg/ml，充分混匀，得溶液A；用pH6.0的组氨酸稀释液将EF-Ts重组蛋白稀释至200 μg/mL，得溶液B；取等体积的溶液A和溶液B于4℃条件下旋转混悬吸附1小时后获得疫苗。 同样条件将重组抗原溶液用疫苗稀释液替代制备不含抗原的佐剂对照制剂。
实施例6：免疫动物。
1. 免疫动物。
1）首次免疫，将蛋白抗原与Al（OH）3佐剂混合，使蛋白最终抗原浓度调节为100μg/ml，并置于4℃旋转吸附过夜制成疫苗；用胰岛素针头，于小鼠大腿内侧进行肌肉注射，每只C57Bl/6小鼠注射量为200μL，左右大腿各100μL，并设置阴性对照组（PBS-Al（OH）3佐剂组）；
2）第14天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量与首次免疫的相同，免疫途径同上，本次免疫肌肉注射小鼠大腿外侧；
3）第21天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量与首次免疫的相同，免疫途径同上，本次免疫肌肉注射小鼠大腿内侧；
2．第三次免疫后第7天，采集C57 Bl/6小鼠的静脉血，凝固后离心分离血清，用ELISA检测小鼠免疫后IgG水平。
实施例7：ELISA检测EF-Ts重组蛋白特异性抗体。
1. ELISA试剂盒的制备。
1）配置试剂：包被液：0.05 M碳酸盐缓冲液（NaHCO3 1.6g/L，Na2CO3 2.9g/L，pH9.6）；洗涤液为PBST（PBS+0.05%吐温-20，pH7.4）；封闭液为含PBS（pH7.4）+3% BSA；血清及抗体稀释液为PBS（pH7.4）+1% BSA +0.05%吐温-20，终止液为2M H2SO4。
2）包被抗原：用包被液将纯化后的EF-Ts重组蛋白稀释为4μg/ml；将稀释好的重组蛋白加入酶标板，100μL/孔，4℃孵育过夜后用洗涤液洗涤4遍；
3）封闭：酶标板加封闭液，100μL/孔，37℃孵育2小时，洗涤4遍即获得检测抗体用ELISA试剂板；
4) 配以HRP标记的兔抗小鼠IgG抗体以及抗体稀释液，TMB显色液及终止液即为EF-Ts抗体检测试剂盒。
2. EF-Ts重组蛋白特异性抗体的检测。
1）将蛋白免疫后的血清及对照组血清分别进行倍比稀释，稀释梯度设置为1:1000、1:5000、1:25000、1: 125000；
2）取ELISA检测试剂盒中封闭好的酶标板，依次加入不同稀释浓度的血清，100μL/孔，同时设置PBS空白孔置于37℃孵育箱2h，洗涤3遍，控干；
3）将HRP标记的兔抗小鼠IgG抗体储存液以1:10000稀释，制成抗体工作液；
4）加入稀释抗体工作液，100μL/孔，置于37℃孵育箱45min，洗涤5遍，控干；
5）加入底物显色液TMB，100μL/孔，室温避光反应10-15 min；
6）加入终止液50μL/孔，置于酶标仪上以450 nm波长处测定OD值；
7）结果判断：A样品∕A阴性值≧2.1为阳性。
表2：ELISA 检测重组蛋白免疫后抗体效价（OD450）
稀释倍数 佐剂免疫血清 EF-Ts 免疫血清
125000 0.038 0.232
25000 0.035 0.694
5000 0.034 1.656
1000 0.035 2.767
结果：PLPFP蛋白ELISA检测试剂盒及检测方法建立成功，可以用于EF-Ts蛋白特异性抗体的检测。用此试剂盒检测EF-Ts蛋白抗体效价，结果显示检测EF-Ts蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价大于1:125000，说明本发明构建的EF-Ts重组蛋白免疫小鼠后能够激发小鼠产生高效价的特异性抗体，具有很好的免疫原性和免疫刺激性。
实施例8：通过免疫小鼠确定EF-Ts重组蛋白免疫动物的攻毒保护。
同实施例6的免疫方案，第三次免疫后第14天采用致死剂量，经尾静脉注射鲍曼不动杆菌活菌进行攻毒，每只小鼠注射菌量为3×107CFU，注射体积为100μl，观察7天，统计各组小鼠的存活率。结果示于下表3。
表3 重组蛋白免疫保护效果
组别 免疫组分 小鼠（只） 死亡小鼠数量 死亡率（%） 保护率（%）
EF-Ts免疫组 EF-Ts-+Al(OH)3佐剂 10 5 50 50
佐剂对照组 Al(OH)3佐剂 10 10 100 0
表3为动物免疫试验结果，显示佐剂对照组的死亡率为100%，疫苗免疫组死亡率50%，根据公式计算免疫保护率：[免疫保护率=（对照组发病率-接种组发病率）/对照组发病率×100%]，EF-Ts免疫组的保护率为50%。
通过本发明所制备的 EF-Ts 重组蛋白，具有纯度高（如图6所示，通过ImageJ软件计算后得到蛋白纯度为97%），对鲍曼不动杆菌感染保护效果好，在小鼠实验中，EF-Ts重组蛋白辅以Al(OH)3佐剂组的免疫保护率为50%，且无毒副作用的优点。因此，本发明EF-Ts 重组蛋白具有良好的免疫原性，能够激发机体产生IgG抗体，能够对鲍曼不动杆菌感染起到良好的免疫保护效果。
本发明所制备的重组蛋白能够与其他相关试剂，例如检测抗体、显色剂、终止剂等制备相关试剂盒。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.鲍曼不动杆菌翻译延伸因子重组蛋白，其特征在于，包括EF-Ts蛋白，所述EF-Ts蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.编码权利要求1所述的鲍曼不动杆菌翻译延伸因子重组蛋白的多核苷酸。
3.权利要求1所述的鲍曼不动杆菌翻译延伸因子重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）根据鲍曼不动杆菌EF-Ts蛋白基因序列设计PCR引物，以鲍曼不动杆菌的全基因组为模板，根据所设计的PCR引物对编码EF-Ts蛋白氨基酸序列的目的基因片段进行PCR扩增，并回收PCR产物；其中：正向引物：5`-CGCGGATCCATGACTGCAATTACTGCAAGC -3`；反向引物：5`-TTATGCGGCCGCTTACTTCGCAGCAGCTTGAG-3`；
（2）将步骤（1）所得的PCR产物克隆至含有GST标签的表达载体，并转化至原核表达系统中进行诱导表达含有GST标签的EF-Ts融合蛋白；
（3）使用酶切方法将目的蛋白和GST标签分开，获得EF-Ts重组蛋白。
4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括编码权利要求1所述的鲍曼不动杆菌翻译延伸因子重组蛋白的多核苷酸，所述表达载体为pGEX-6P-2质粒。
5.一种宿主细胞，其特征在于，包括权利要求4所述的表达载体。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。
7.权利要求1所述的鲍曼不动杆菌翻译延伸因子重组蛋白在制备治疗或预防鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物为鲍曼不动杆菌疫苗。
9.权利要求1所述的鲍曼不动杆菌翻译延伸因子重组蛋白在制备鲍曼不动杆菌检测试剂盒中的应用。
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