CN110484973A - 一种烟草bac文库及其构建和质量检测方法 - Google Patents

一种烟草bac文库及其构建和质量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种烟草BAC文库及其构建和质量检测方法。所述烟草BAC文库以含有高抗黑胫病基因的烟草品种K236的近等基因系14‑60为材料提取基因组DNA，以pIndigoBAC536‑S为载体，大肠杆菌DH10B为宿主，包含414720个单克隆，插入的DNA片段大小为97‑160 kb，覆盖烟草基因组11倍以上。本发明所述的烟草BAC文库能够很好地覆盖烟草的基因组信息，可以作为提升和完善烟草基因组序列的重要资源，也为进一步克隆烟草重要功能基因与烟草新抗源的研究提供了重要资源。

Description

一种烟草BAC文库及其构建和质量检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种烟草BAC文库及其构建和质量检测方法。
背景技术
BAC文库是以细菌人工染色体载体为基础构建的一种插入片段在50~300 kb的基因组文库，每一个克隆都包含部分染色体的全部基因信息。BAC文库是基因组结构研究和功能基因分离的重要工具，在物理图谱构建、功能基因图位克隆、基因组全序列测定、比较基因组学分析等研究中发挥了重要作用。BAC文库已被广泛地应用于各物种的研究中，包括细菌, 动物和各种农作物。烟草BAC文库构建的报道较少，仅有烟草野生种绒毛状烟草，普通烟草Hicks Broadleaf和SR1。由于早期文库构建受到技术和成本限制，很少开展高质量、大容量的BAC文库构建工作，因此这些BAC文库的具体参数、检测标准以及质量评价鲜有报道。
在现有的BAC文库构建技术中，浓度适宜的基因组DNA是获得高质量大片段DNA的必要条件，低浓度的基因组DNA往往很难成功获得大片段DNA来构建BAC文库，基因组DNA浓度过高也会增加实验的难度，比如会导致大片段DNA在脉冲场中很难完全分离，很多小片段DNA与大片段DNA通过PFGE分不开，DNA堆积在一起。由于外源DNA片段越大，越难与BAC载体连接，而同样条件下小片段外源DNA却很容易与载体相连，所构建出来的BAC文库中会出现非常多的小片段，严重影响BAC文库的质量。高分子量的大小均一的插入片段也是构建BAC文库的关键环节之一，如果在实验中内切酶过量，会导致非特异性酶切，会产生很高比例的假阳性，从而导致整个文库空载率过高。
此外，黑胫病是土壤传播的真菌性病害，是烟草生产最具毁灭性病害之一，严重影响全世界烟叶生产安全。育种家利用自然或诱导变异培育抗病品种，种植抗病品种是解决黑胫病导致生产损失的最有效方法。因此，构建一个含有抗性基因的烟草BAC文库，可为挖掘抗性基因功能以及烟叶品质形成机理奠定重要基础。
为此，本发明研发了以携带抗性基因的烟草品种K326的近等基因系为材料，通过二次筛选DNA片段大小和浓度获得的烟草BAC文库及其构建和质量检测方法。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种烟草BAC文库，所述烟草BAC文库以含有高抗黑胫病基因的烟草品种K236的近等基因系14-60为材料提取基因组DNA，以pIndigoBAC536-S为载体，大肠杆菌DH10B为宿主，包含414720个单克隆，插入的DNA片段大小为97-160 kb，覆盖烟草基因组11倍以上。
本发明的第二目的在于提供一种烟草BAC文库的构建方法，所述构建方法包括以下步骤。
（1）烟草基因组大片段DNA提取：采用低熔点琼脂糖包埋技术提取基因组大片段DNA。
（2）DNA片段筛选：把步骤（1）提取得到的烟草DNA包埋块进行16次以上的酶切反应，所述的酶切反应体系为：25 μL H2O、10 μL10×buffer、10 μL 40 mmol/L亚精胺、5 μL1.0 U/μL HindIII酶和切碎的1/2烟草DNA包埋块，将反应体系置于37℃恒温水浴锅中，反应15 min；再通过脉冲电泳进行大片段DNA分离；电泳结束后，在点样孔两侧向内各0.5 cm的地方，将胶块切割成3份，用溴化乙锭溶液染色两边的胶块，漂洗后，放入凝胶成像仪进行成像分析，用透明直尺作为参照。根据凝胶成像的结果，从未染色胶块中间，切下100~250kb范围内、宽约2 cm的胶条，并将所述胶条再平均分成上下两个宽约1 cm的小胶条，并标记；将所述小胶条放在一起，倒入琼脂糖填满两块胶的周围，待凝固后，把整块胶放入电泳仪继续进行脉冲场电泳，电泳结束后，回收胶条中的大片段DNA，并检测洗脱液中的DNA含量，筛选含量1 ng/μL以上的DNA片段进行下一步的连接反应。
（3）pIndigoBAC536-S载体的制备：用HindIII限制性内切酶对pHZAUBAC1载体质粒进行酶切，把质粒分成pIndigoBAC536-S与pGEM-4Z两个片段，加入CIAP去磷酸化，再用氯仿/异戊醇抽提法回收，然后用脉冲场凝胶电泳分离两种载体片段，最后通过切胶回收与电洗脱的方法获得pIndigoBAC536-S载体。
（4）DNA片段插入载体并转入宿主细胞：用步骤（3）得到的pIndigoBAC536-S载体与步骤（2）筛选得到的DNA片段进行连接反应，反应完成后使连接酶失活并对产物进行脱盐，将产物与9~10倍体积的大肠杆菌混合后进行电转化并培养18 h，蓝白斑筛选出阳性克隆并保存。
本发明第三目的在于提供一种所述烟草BAC文库的质量检测方法，其特征在于，通过检测所述文库的插入片段大小、空载率、污染率和覆盖率来进行质量评价，具体检测步骤如下。
（1）从所述烟草BAC文库中随机挑取克隆，在含有12.5 mg/L氯霉素的LB液体培养基中培养过夜后提取质粒，用 I-SceI酶切3.5 h，然后进行脉冲场凝胶电泳，检测克隆的插入片段大小、空载率和克隆污染率。
（2）从所述烟草BAC文库中随机挑取克隆，用BAC末端测序引物对克隆进行末端序列，将测序结果与NCBI数据库中的烟草细胞器基因组数据库序列比对，计算细胞器污染率。
（3）建立BAC文库一级混合池，提取混合池的质粒DNA，从NCBI数据库选择烟草pvy基因、NtFT基因和hemA基因，设计相应引物来进行基因筛选，以混合池质粒DNA为模板，利用所述引物进行扩增，根据扩增结果验证所述文库的覆盖率。
附图说明
图1为烟草基因组DNA的第一次筛选图；
图中，红框为切胶位置；M 是 Marker λ ladder PFG（NEB）； 切取5.4cm -7.4cm 处胶图，分别标为 a 片段和 b 片段。
图2为烟草基因组DNA的第二次筛选图；
图中，红框为切胶位置；对回收的 a 片段和 b 片段进行二次筛选和回收， 标记为a1、 a2、 b1 和 b2。
图3为洗脱产物DNA的浓度检测图；
图中，第一至第四泳道分别加入 λ DNA 浓度标记 1 ng、 2 ng、 3ng、 4ng； 第五至第八泳道为洗脱产物 a1、 a2、 b1、 b2，分别加入 1µL。
图4为烟草BAC文库的平均插入片段检测图-1；
图中，泳道 1-20 分别为转化 a2-1 的 20 个克隆插入片段检测图；泳道 21 为Marker λ ladder PFG（ NEB）； 泳道 22-41 分别为转化 a2-2 的 20 个克隆插入片段检测图，载体带为pIndigoBAC536-S。
图5为烟草BAC文库的平均插入片段检测图-2；
图中，泳道 1-20 分别为转化 a2-2 的 20 个克隆插入片段检测图；泳道 21 为Marker λ ladder PFG（ NEB）；泳道 22-41 分别为转化 a2-3 的 20 个克隆插入片段检测图，载体带为pIndigoBAC536-S。
图6为烟草BAC文库的平均插入片段检测图-3；
图中，泳道 1-20 分别为转化 a1-1 的 20 个克隆插入片段检测图；泳道 21 为Maker λ ladder PFG（ NEB）；泳道 22-41 分别为转化 b1-1 的 20 个克隆插入片段检测图，载体带为pIndigoBAC536-S。
图7为hemA 基因筛选结果；
图中，Marker是Trans2K DNA Marker，从上到下依次是2000 bp，1000 bp，750 bp，500bp，250 bp，100 bp。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所做的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明提供的一种烟草BAC文库，其特征在于，所述烟草BAC文库以含有高抗黑胫病基因的烟草品种K236的近等基因系14-60为材料提取基因组DNA，以pIndigoBAC536-S为载体，大肠杆菌DH10B为宿主，包含414720个单克隆，插入的DNA片段大小为97-160 kb，覆盖烟草基因组11倍以上。所述含有高抗黑胫病基因的烟草品系为K236的近等基因系14-60是以高抗烟草黑胫病的Wz为供体亲本，通过回交方法将所述抗性基因导入K326中。
本发明提供的一种根据所述的烟草BAC文库的构建方法，其特征在于包括以下步骤。
（1）烟草基因组大片段DNA提取：采用低熔点琼脂糖包埋技术提取基因组大片段DNA。
（2）DNA片段筛选：把步骤（1）提取得到的烟草DNA包埋块进行16次以上的酶切反应，所述的酶切反应体系为：25 μL H2O、10 μL10×buffer、10 μL 40 mmol/L亚精胺、5 μL1.0 U/μL HindIII酶和切碎的1/2烟草DNA包埋块，将反应体系置于37℃恒温水浴锅中，反应15 min；再通过脉冲电泳进行大片段DNA分离。电泳结束后，在点样孔两侧向内各0.5 cm的地方，将胶块切割成3份，用溴化乙锭溶液染色两边的胶块，漂洗后，放入凝胶成像仪进行成像分析，用透明直尺作为参照。根据凝胶成像的结果，从未染色胶块中间，切下100~250kb范围内、宽约2 cm的胶条，并将所述胶条再平均分成上下两个宽约1 cm的小胶条，并标记；将所述小胶条放在一起，倒入琼脂糖填满两块胶的周围，待凝固后，把整块胶放入电泳仪继续进行脉冲场电泳，电泳结束后，回收胶条中的大片段DNA，并检测洗脱液中的DNA含量，筛选含量1 ng/μL以上的DNA片段进行下一步的连接反应。
（3）pIndigoBAC536-S载体的制备：用HindIII限制性内切酶对pHZAUBAC1载体质粒进行酶切，把质粒分成pIndigoBAC536-S与pGEM-4Z两个片段，加入CIAP去磷酸化，再用氯仿/异戊醇抽提法回收，然后用脉冲场凝胶电泳分离两种载体片段，最后通过切胶回收与电洗脱的方法获得pIndigoBAC536-S载体。
（4）DNA片段插入载体并转入宿主细胞：用步骤（3）得到的pIndigoBAC536-S载体与步骤（2）筛选得到的DNA片段进行连接反应，反应完成后使连接酶失活并对产物进行脱盐，将产物与9~10倍体积的大肠杆菌混合后进行电转化并培养18 h，蓝白斑筛选出阳性克隆并保存。
作为本发明的一种优选，连接反应体系为100 μL：体积分数为84%的大片段DNA、体积分数为4%的 pIndigoBAC536-S载体 、体积分数为2% 的T4 DNA连接酶、体积分数为10%的T4 DNA连接酶Buffer，16℃恒温水浴锅反应16 h。
所述的使连接酶失活并对产物进行脱盐的方法为将连接反应体系置于65℃干浴锅15 min使连接酶失活并把连接产物转移至脱盐胶内，脱盐不少于1 h后吸出。
本发明提供的一种烟草BAC文库的质量检测方法，其特征在于，通过检测所述文库的插入片段大小、空载率、污染率和覆盖率来进行质量评价，具体检测步骤如下。
（1）从所述烟草BAC文库中随机挑取克隆，培养过夜后提取质粒，用 I-SceI完全酶切，然后进行脉冲场凝胶电泳，检测克隆的插入片段大小、空载率和克隆污染率。
作为本发明的一种优选，挑取的克隆在含有12.5 mg/L氯霉素的LB液体培养基中培养过夜，酶切时间为3.5 h。脉冲场凝胶电泳相关参数为：以0.5×TBE为缓冲液，电泳条件为5 s-15 s，120°，6 V/cm，14℃，16 h。
（2）从所述烟草BAC文库中随机挑取克隆，用BAC末端测序引物对克隆进行末端序列，将测序结果与NCBI数据库中的烟草细胞器基因组数据库序列比对，计算细胞器污染率。所述末端测序为单末端测序，部分为双末端测序。
作为本发明的一种优选，所述BAC末端测序引物正向序列为SEQ ID No.1(BAC-F：5’-AACGACGGCCAGTGAATTG-3’)，反向序列为SEQ ID No.2（BAC-R： 5’-GATAACAATTTCACACAGG-3’）。
（3）建立BAC文库一级混合池，提取混合池的质粒DNA，从NCBI数据库选择烟草pvy基因、NtFT基因和hemA基因，设计相应引物来进行基因筛选，以混合池质粒DNA为模板，利用所述引物进行扩增，根据扩增结果验证所述文库的覆盖率。
作为本发明的一种优选，所述pvy基因相应引物的序列正向序列为SEQ ID No.3(5’-TGCATACGGTGGTCCAAACA-3’)，反向序列为SEQ ID No.4（5’-GCCTGAGGTTTGCTGAGAGT-3’）。
作为本发明的一种优选，所述NtFT基因相应引物的序列正向序列为SEQ ID No.5(5’-CGACATGTTTGTTCCGGTGG-3’)，反向序列为SEQ ID No.6（5’-TGAGAGGTTCTCCGTCCAGT-3’）。
作为本发明的一种优选，所述hemA基因相应引物的序列正向序列为SEQ ID No.7(5’-GGGATGCACTAGGATGGTCG-3’)，反向序列为SEQ ID No.8（5’-AGCATAAGCCCGCAGTTTCT-3’）。
与现有技术相比，本发明具有显著的技术效果：
（1）本发明在对烟草大片段DNA进行两次筛选后，找到了浓度最为适合的基因组DNA，避免了因不适宜的基因组DNA所造成的BAC文库质量的下降；
（2）本发明的通过筛选HindIII内切酶使用量，找到了酶切最适合的条件，降低了整个文库的空载率。
总之，本研究构建的烟草BAC文库能够很好地覆盖烟草的基因组信息，可以作为提升和完善烟草基因组序列的重要资源，也为挖掘Wz抗性基因功能，解析K326烟叶品质形成机理以及烟草数量性状相关功能基因的克隆提供基础材料。
实施例1：提取烟草大片段DNA。
以高抗烟草黑胫病的Wz为供体亲本，结合标记选择、通过回交方法将该抗性导入到我国主栽烤烟品种K326中，获得BC7F7，选取其中农艺性状表现优良的14-60作为该文库构建的材料。
烟草种子生长至4叶期，收集嫩叶，加入液氮研磨后分离出细胞核，再与等体积1％低熔点琼脂糖混匀后制成细胞核包埋块，并用蛋白酶K处理，然后存放于 4 ℃的TE中备用。
实施例2：DNA片段筛选。
第一次筛选：把得到的烟草DNA包埋块进行16次的酶切反应。酶切反应体系为：25μL H2O、10 μL10×buffer、0.4 nmol亚精胺、５μL 1.0 U/μL的HindIII酶和切碎的1/2烟草DNA包埋块，将反应体系置于37 ℃恒温水浴锅中，反应15 min。再通过脉冲电泳进行大片段DNA分离。
如图1所示：电泳结束后，在点样孔两侧向内各0.5 cm的地方，将胶块切割成3份，用溴化乙锭溶液染色两边的胶块，漂洗后，放入凝胶成像仪进行成像分析，用透明直尺作为参照。根据凝胶成像的结果，从未染色胶块中间，切下100~250 kb范围内、宽约2 cm的胶条，并将所述胶条再平均分成上下两个宽约1 cm的小胶条（图2），并标记；将所述小胶条放在一起，倒入琼脂糖填满两块胶的周围，待凝固后，把整块胶放入电泳仪继续进行脉冲场电泳，电泳结束后，回收胶条中的大片段DNA，并检测洗脱液中的DNA含量（图3），筛选含量1 ng/μL以上的DNA片段进行下一步的连接反应。
实施例3：pIndigoBAC536-S载体的制备。
用HindIII限制性内切酶对pHZAUBAC1载体质粒进行酶切，酶切反应体系为：2μL的pHZAUBAC1 载体DNA，15μL的 10×buffer R for HindIII，2μL 的HindIII限制性内切酶，1μL 的ddH2O 13。
酶切反应结束后，得到pIndigoBAC536-S与pGEM-4Z两个片段。在产物中加入CIAP去磷酸化，再用氯仿/异戊醇抽提法回收，然后用脉冲场凝胶电泳分离两种载体片段，最后通过切胶回收与电洗脱获得pIndigoBAC536-S载体。
实施例4：DNA片段插入载体并转入宿主细胞。
将实施例3得到的pIndigoBAC536-S载体与实施例2筛选得到的DNA片段进行连接反应。连接反应体系含有84 μL的大片段 DNA，4 μL的载体，2 μL 的T4 DNA连接酶，以及10μL的 T4 DNA连接酶Buffer，反应在16℃恒温水浴中进行16 h。反应结束后，连接体系置于65℃干浴锅15 min。连接产物在脱盐胶（1％琼脂糖和2％葡萄糖）内脱盐1h。将2 μL脱盐后的产物与18 μL大肠杆菌DH10B感受态细胞充分混合，之后进行电转化，转化产物置于500 μL SOC培养基中、37℃复苏55 min。吸取复苏产物100 μL，均匀涂布于LB固体培养基上，LB固体培养基含有12.5 mg/L氯霉素、100 mg/L IPTG、80 mg/L X-gal，将培养皿倒置于恒温37℃培养箱内，培养18 h。培养结束后，随机从每个培养皿上各挑取一定数量的白斑，检测插入外源DNA片段的大小，若达到目标，则挑拣白斑至含有冰冻培养基的384孔板中、37℃培养，并复制1份，培养好的细胞保存于-80℃冰箱中。
反应完成后，将连接反应体系置于65℃干浴锅15 min使连接酶失活并把连接产物转移至脱盐胶内，脱盐不少于1 h后吸出。再将产物与9~10倍体积的大肠杆菌DH10B混合后进行电转化并培养18 h，蓝白斑筛选出阳性克隆并保存。
实施例5：烟草BAC文库质量检测。
（1）随机从文库中挑取120个克隆，在含有12.5 mg/L氯霉素的LB液体培养基中培养过夜，用碱裂解法提取质粒，用I-SceI内切酶进行酶切3.5 h，通过脉冲场凝胶电泳，脉冲场凝胶电泳缓冲液为0.5×TBE，电泳条件为5 s-15 s，120°，6 V/cm，14℃，16 h。
结果如图4-6所示。图4显示：40 个克隆的平均插入片段大小为 124.7 kb，无空载。图5显示40 个克隆的平均插入片段大小约为 128.3 kb，无空载。图6显示40 个克隆的平均插入片段大小约为 117.6 kb，无空载。烟草 BAC 文库平均插入片段大小约为 123kb，空载率小于 2%。
（2）从BAC文库中随机挑取40个克隆，提取高纯度和浓度的质粒DNA，进行BAC单末端测序（部分克隆进行双末端测序）。末端测序引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.1，查询NCBI数据库中的烟草细胞器基因组数据库序列，与末端序列（BES）比对，估测该文库的细胞器污染率。
结果共得到 143 条末端序列（BES）。 BES 序列信息与基因库序列比对，检测到1条叶绿体序列，叶绿体 DNA 的污染率小于 1%；没有检测到线粒体和细菌基因组污染。按烟草基因组4,500 Mb计算，该文库覆盖度约为11倍基因组。
(3) 建立BAC文库一级混合池，提取混合池的质粒DNA，
在已构建好的 BAC 文库基础上，构建 BAC 文库 384 板混合池和提取混合池 DNA。每个 384 孔板混为 1 个混合池， 储存在 50mL 离心管中， 共 1,080 个混合池，于-80℃冰冻保存。每个 384 板混合池提取一份质粒 DNA， 共 1,080 个混合池 DNA。每份混合池DNA 用 50μL TE 溶解，于-80℃冰冻保存。 随机挑取了部分混合池 DNA 进行质粒检测，检测结果显示提取的混合池 DNA 质量稳定、浓度高。
从NCBI数据库选择烟草pvy基因、NtFT基因和hemA基因，以混合池质粒DNA为模板，使用相应引物来进行基因筛选，根据扩增结果验证所述文库的覆盖率。
所述pvy基因相应引物的序列正向序列为SEQ ID No.3 (5’-TGCATACGGTGGTCCAAACA-3’)，反向序列为SEQ ID No.4（5’-GCCTGAGGTTTGCTGAGAGT-3’）；所述NtFT基因相应引物的序列正向序列为SEQ ID No.5 (5’-CGACATGTTTGTTCCGGTGG-3’)，反向序列为SEQ ID No.6（5’-TGAGAGGTTCTCCGTCCAGT-3’）；所述hemA基因相应引物的序列正向序列为SEQ ID No.7(5’-GGGATGCACTAGGATGGTCG-3’)，反向序列为SEQ ID No.8（5’-AGCATAAGCCCGCAGTTTCT-3’）。
如图7所示，hemA基因引物的扩增条带约500 bp，在烟草BAC文库一级混合池共筛选到26个阳性克隆。测序结果表明，这26个克隆的序列与NCBI中hemA基因序列结果一致。另外，pvy基因共筛选到11个阳性克隆，NtFT基因共筛选到13个阳性克隆，表明所构建的烟草BAC文库覆盖度达到理论覆盖度11倍以上，质量可靠。
综上所述，本发明构建的BAC文库烟草 BAC 文库总共有 414,720 个克隆，保存在1,080 块 384 板中， 平均插入片段大小为 123 kb，均一性好， 约 11 倍基因组覆盖度（按照烟草基因组 4500 Mb 计算得到）， 空载率小于 2%， 叶绿体 DNA 污染率小于 1%，无线粒体和细菌基因组污染。
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Claims (9)

1.一种烟草BAC文库，其特征在于，所述烟草BAC文库以含有高抗黑胫病基因的烟草品种K236的近等基因系14-60为材料提取基因组DNA，以pIndigoBAC536-S为载体，大肠杆菌DH10B为宿主，包含414720个单克隆，插入的DNA片段大小为97-160 kb，覆盖烟草基因组11倍以上。
2.根据权利要求1所述的烟草BAC文库，其特征在于，所述含有高抗黑胫病基因的烟草品种K236的近等基因系14-60是以高抗烟草黑胫病的Wz为供体亲本，通过回交方法将所述抗性基因导入K326中。
3.一种根据权利要求1所述的烟草BAC文库的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）烟草基因组大片段DNA提取：采用低熔点琼脂糖包埋技术提取基因组大片段DNA；
（2）DNA片段筛选：把步骤（1）提取得到的烟草DNA包埋块进行16次以上的酶切反应，所述的酶切反应体系为：25 μL H2O、10 μL10×buffer、10 μL 40 mmol/L亚精胺、5 μL 1.0U/μL HindIII酶和切碎的1/2烟草DNA包埋块，将反应体系置于37℃恒温水浴锅中，反应15min；再通过脉冲电泳进行大片段DNA分离；
电泳结束后，在点样孔两侧向内各0.5 cm的地方，将胶块切割成3份，用溴化乙锭溶液染色两边的胶块，漂洗后，放入凝胶成像仪进行成像分析，用透明直尺作为参照；
根据凝胶成像的结果，从未染色胶块中间，切下100~250 kb范围内、宽约2 cm的胶条，并将所述胶条再平均分成上下两个宽约1 cm的小胶条，并标记；将所述小胶条放在一起，倒入琼脂糖填满两块胶的周围，待凝固后，把整块胶放入电泳仪继续进行脉冲场电泳，电泳结束后，回收胶条中的大片段DNA，并检测洗脱液中的DNA含量，筛选含量1 ng/μL以上的DNA片段进行下一步的连接反应；
（3）pIndigoBAC536-S载体的制备：用HindIII限制性内切酶对pHZAUBAC1载体质粒进行酶切，把质粒分成pIndigoBAC536-S与pGEM-4Z两个片段，加入CIAP去磷酸化，再用氯仿/异戊醇抽提法回收，然后用脉冲场凝胶电泳分离两种载体片段，最后通过切胶回收与电洗脱的方法获得pIndigoBAC536-S载体；
（4）DNA片段插入载体并转入宿主细胞：用步骤（3）得到的pIndigoBAC536-S载体与步骤（2）筛选得到的DNA片段进行连接反应，反应完成后使连接酶失活并对产物进行脱盐，将产物与9~10倍体积的大肠杆菌混合后进行电转化并培养18 h，蓝白斑筛选出阳性克隆并保存。
4.一种权利要求1所述烟草BAC文库的质量检测方法，其特征在于，通过检测所述文库的插入片段大小、空载率、污染率和覆盖率来进行质量评价，具体检测步骤如下：
（1）从所述烟草BAC文库中随机挑取克隆，在含有12.5 mg/L氯霉素的LB液体培养基中培养过夜后提取质粒，用 I-SceI酶切3.5 h，然后进行脉冲场凝胶电泳，检测克隆的插入片段大小、空载率和克隆污染率；
（2）从所述烟草BAC文库中随机挑取克隆，用BAC末端测序引物对克隆进行末端序列，将测序结果与NCBI数据库中的烟草细胞器基因组数据库序列比对，计算细胞器污染率；
（3）建立BAC文库一级混合池，提取混合池的质粒DNA，从NCBI数据库选择烟草pvy基因、NtFT基因和hemA基因，设计相应引物来进行基因筛选，以混合池质粒DNA为模板，利用所述引物进行扩增，根据扩增结果验证所述文库的覆盖率。
5.根据权利要求9所述的烟草BAC文库的质量检测方法，其特征在于，步骤（2）所述BAC末端测序引物正向序列为SEQ ID No.1，反向序列为SEQ ID No.2。
6.根据权利要求9所述的烟草BAC文库的质量检测方法，其特征在于，步骤（2）所述末端测序为单末端或者双末端测序。
7.根据权利要求9所述的烟草BAC文库的质量检测方法，其特征在于，步骤（3）所述pvy基因相应引物的序列正向序列为SEQ ID No.3，反向序列为SEQ ID No.4。
8.根据权利要求9所述的烟草BAC文库的质量检测方法，其特征在于，步骤（3）所述NtFT基因相应引物的序列正向序列为SEQ ID No.5，反向序列为SEQ ID No.6。
9.根据权利要求9所述的烟草BAC文库的质量检测方法，其特征在于，步骤（3）所述hemA基因相应引物的序列正向序列为SEQ ID No.7，反向序列为SEQ ID No.8。
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