CN111004312B

CN111004312B - 水稻基因OsT5H在参与金属离子浓度响应中的应用

Info

Publication number: CN111004312B
Application number: CN201911151972.XA
Authority: CN
Inventors: 芦海平; 肖洁; 谭瑗瑗
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-11-22
Filing date: 2019-11-22
Publication date: 2021-04-02
Anticipated expiration: 2039-11-22
Also published as: CN111004312A

Abstract

本发明公开了水稻基因OsT5H在参与金属离子浓度响应中的应用，第一次发现水稻基因OsT5H在根部有着更高的表达量，而且OsT5H基因的表达强度与环境中的三价铁离子和二价铜离子以及它们的浓度之间存在相关性，可用于指示环境中金属离子污染物的浓度。本发明还通过构建OsT5Hpro：：GUS载体获得了能够在根部显示OsT5H基因表达量的转基因水稻材料，该材料可用作指示材料来反应环境中金属离子污染物浓度。

Description

水稻基因OsT5H在参与金属离子浓度响应中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程和环境污染技术领域，尤其涉及水稻基因OsT5H在参与金属离子浓度响应中的应用。

背景技术

水稻是一种重要的粮食作物，也是植物分子生物学领域的模式植物。水稻基因OsT5H属于单加氧酶P450家族基因，按P450家族分类系统，此基因命名为CYP71A1；从功能角度来说，由于能够以色胺为底物，催化其芳环5'位置进行羟化反应，形成5 羟色胺。因此，又命名为OsT5H(Oryza Sativa Tryptamine 5 Hydroxylation)。

授权公告号为CN107217061B的发明专利文献中公开了水稻基因CYP71A1(即OsT5H)在调控水稻植株抗虫性中的应用，该发明通过对γ射线诱变获得的突变体与野生型进行害虫抗性实验，发现基因CYP71A1突变的水稻植株相比野生型具有更高地抗虫性，验证了抑制基因CYP71A1表达在提高水稻植株抗虫性中的应用。

在进一步探究OsT5H基因组织特异性表达过程中，发现OsT5H在根部有着更高的表达量，而且表达模式与溶液中的化合物种类和浓度有关。

因此，有望建立OsT5H基因的表达强度与环境中化合物浓度及种类之间的相关性。

发明内容

本发明提供了水稻基因OsT5H在参与金属离子浓度响应中的应用，第一次发现水稻基因OsT5H在根部有着更高的表达量，而且OsT5H基因的表达强度与环境中的三价铁离子和二价铜离子以及它们的浓度之间存在相关性，可用于指示环境中金属离子污染物的浓度。

具体技术方案如下：

本发明公开了水稻基因OsT5H在参与金属离子浓度响应中的应用，所述水稻基因OsT5H的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述金属离子为Fe³⁺或Cu²⁺。

本发明公开了水稻基因OsT5H编码的蛋白在参与金属离子浓度响应中的应用。

本发明还公开一种参与金属离子浓度响应的转基因水稻材料的制备方法，包括：

(1)构建包含水稻基因OsT5H启动子和报告基因GUS的目的基因；

(2)将所述目的基因连接进原始载体中，形成OsT5Hpro：：GUS载体；

(3)再将所述OsT5Hpro：：GUS载体转入水稻植株中，筛选获得阳性且纯合的转基因水稻材料。

常规的水稻植株中虽然含有OsT5H基因且该基因也能够在水稻植株的根本进行表达，但是，其表达量的多少无法通过肉眼或仪器轻易判断，通过上述制备方法获得转基因水稻材料利用GUS报告基因能够有效显示转基因水稻植株根部OsT5H基因的表达情况。

进一步地，所述水稻基因OsT5H启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，步骤(2)中，所述原始载体为pCAMBIA1300。

进一步地，步骤(3)中，采用农杆菌转化法将所述OsT5Hpro：：GUS载体转入水稻植株中。

本发明还公开了转基因水稻材料作为指示材料在响应环境中金属离子污染物浓度的应用，所述金属离子为Fe³⁺或Cu²⁺。

进一步地，所述环境为含FeCl₃的水溶液，含CuCl₂的水溶液或含CuSO₄的水溶液。

进一步地，本发明所述转基因水稻材料的指示部位为根部。

通过试验发现，当水溶液中不含有Fe³⁺、Cu²⁺或者Fe³⁺、Cu²⁺的浓度小于1mmol 时，转基因水稻材料的根部经GUS染液染色后会出现蓝色；而当Fe³⁺、Cu²⁺的浓度＞ 10mmol/L时，转基因水稻材料的根部经GUS染液染色后不会变色。

本发明通过多个角度，即：RNA水平，蛋白水平和化合物水平，证明了OsT5H 基因在水稻根部有表达并发挥着一定的功能。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明第一次发现水稻基因OsT5H在根部有着更高的表达量，而且OsT5H 基因的表达强度与环境中的三价铁离子和二价铜离子以及它们的浓度之间存在相关性，可用于指示环境中金属离子污染物的浓度。

(2)本发明通过构建OsT5Hpro：：GUS载体获得了能够在根部显示OsT5H基因表达量的转基因水稻材料，该材料可用作指示材料来反应环境中金属离子污染物浓度。

附图说明

图1为水稻组织部位根，茎，叶中5羟色胺的含量(a)以及蛋白质OsT5H在茎秆和根部中的含量(b)；

其中，@HSP90表示抗内参蛋白HSP90；@OsT5H表示水稻基因OsT5H编码的蛋白；14天和28天是指生长不同时间的水稻。

图2为对转基因水稻材料OsT5H：：GUS进行组织特异性染色的结果；

其中，a为叶鞘，b为叶，c为茎，d为花穗小枝，e为小花的颖壳，为子房，g为种子幼胚。

图3为对转基因水稻材料OsT5Hpro：：GUS的根部进行组织特异性染色的结果以及对化合物5羟色胺在根部组织的分布进行原位杂交的情况；

其中，a-d为根部；e～f为a～d相应位置处的截面图；i为野生型水稻的髓部；j为ost5h突变体的髓部。

图4为水稻材料OsT5Hpro：：GUS对各种溶液以及溶液浓度的响应程度图。

图5为在图4基础上进一步稀释FeCl₃，CuCl₂，CuSO₄三种溶液的浓度后，对转基因水稻材料OsT5Hpro：：GUS的根部进行组织特异性染色的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

下列实施例中所涉及的未详细说明技术方法均为常规技术手段。

实施例1

1、水稻组织部位根、茎、叶中5羟色胺含量的测定

取1克叶片，茎秆或者根部组织在液氮中充分研磨至粉末，加入9mL甲醇，10℃下，180rpm摇床混匀，充分浸提30min，13,500×g，10℃离心15min，可以抽出8mL 的上清液，按照1:4的比例，加入2mL蒸馏水，混匀。C18固相萃取小柱用三倍柱床体积的甲醇活化，之后用蒸馏水冲洗。将已加水的样品过小柱，流出液回收；再用10 mL 80％的甲醇冲洗，冲洗出来的溶液也回收，与之前的流出液合并；最后，旋转蒸发，加入500μL 50％的甲醇溶解待测。

高效液相色谱(HPLC)测定：分离柱为C18小柱，流动相为10％甲醇、0.3％三氟乙酸，流速控制在0.8mL/min，流动相分离30分钟之后，用100％甲醇冲洗5min，再用流动相跑平基线10min，以保证柱子中的其余杂质冲洗干净。检测器波长设置为 280nm。

结果如图1a所示，水稻在根部富集较高含量的5羟色胺。

2、水稻组织部位根、茎中蛋白质OsT5H含量的测定

将OsT5H序列构建pET28a载体中，在菌株BL21中表达，分离纯化获得OsT5H 蛋白。之后将蛋白送至华大蛋白公司(http://www.proteomics.org.cn/)，注射进兔子体内进行免疫，收集血液，离心获得上清，即OsT5H蛋白抗体

在SDS-PAGE(30％Acrlamide，3.3ml；1.5M Tris-HCl，2.5ml；10％SDS，100μL；10％AP，100μL；TEMED，4μL)上完成电泳，电压设置在100V，然后设定定时时间为90～120min。准备3～4层滤纸2份和PVDF膜一张。PDVF浸入甲醇液中浸泡10s (快速激活PDVF膜)，去离子水处理5min，1×转移缓冲液处理10min以上。滤纸用转移液缓冲液浸泡后待用。转膜：①将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中：由正极侧开始，依次为海绵垫片→滤纸→PVDF膜→样品胶→三层滤纸(排除气泡) →海棉垫片，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中。正确连接转移电泳连线，使电荷由负极向正极流动。接通电源，恒压状态下，80V转膜2h(此操作在 4℃冰箱中进行)。将膜转移至封闭液5％脱脂牛奶(用TTBS配置)，封闭过夜最好。封闭结束后，将膜转移至一抗中，4度过夜孵育或者室温孵育3小时。膜在TTBS缓冲液洗3次，每次5-10min，约半个小时。不可洗膜时间过长。二抗孵育。将膜转至二抗，孵育12小时。TTBS洗膜三次，每次5-10min。ECL Plus检测液曝光。

结果如图1b所示，水稻植株中根部富含有高水平的OsT5H蛋白。在蛋白质水平上同样体现出了根部比叶片具有更高的OsT5H蛋白，与化合物水平结果一致。

实施例2

构建OsT5H启动子(启动子序列如SEQ ID NO.2所示)驱动下的报告基因GUS 并进行转基因。截取基因OsT5H上游2500bp作为启动子区域，通过PCR的方法扩增获得并连接进载体pCAMBIA1300，形成OsT5Hpro：：GUS载体，以GUS作为报告基因，并以农杆菌转化法将片段转入水稻植株内，并筛选获得阳性且纯合植株。

对获得的OsT5Hpro：：GUS转基因植株进行组织特异性表达的GUS染色。

具体方法如下：

GUS染色缓冲液如下：50mM NaH₂PO₄·2H₂O，50mM Na₂HPO₄·12H₂O， Na₂-EDTA10mM,372mg，TritonX-100(0.1％V/V)，K₃[Fe(CN)₆]铁氰化钾0.5mM， K₄[Fe(CN)₆]亚铁氰化钾0.5mM。X-Gluc母液(20mM):染色缓冲液＝1:9。37温度下，反应12小时，即可观察到蓝色染色。

结果如图2所示，基因OsT5H在水稻的很多组织都有表达，例如叶鞘(a)，叶(b)，茎(c)，花穗小枝(d)，小花的颖壳(e)，子房(f)及种子幼胚(g)。该结果说明了 OsT5H及其产物5羟色胺除了在水稻-褐飞虱互作上面有一定的功能之外，还有很多其他至今并没有解释清楚的新的功能。

同样的，OsT5H在水稻根部也有很强的表达水平，根部较短的时候(尤其是刚萌发出来的种子根)，整个根部都显示蓝色；而随着根的生长，则表达信号主要集中在离根尖近的部位。我们进一步通过切片发现：OsT5H主要在水稻中间(髓部)表达，距离根尖越远则表达强度减弱，但侧根还是表现出很强的信号。新生成的侧根就如同主根一样，表达水平很高。

实施例3

将实施例2获得的切片与5羟色胺抗体进行孵育，进行原位杂交。

具体操作如下：

1)制备植株组织样本切片，进行石蜡包埋，切取薄片；

2)脱蜡：将组织60℃恒温箱中烘烤20分钟，置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟。依次无水乙醇中浸泡5分钟，95％乙醇中浸泡5分钟，75％乙醇中浸泡5分钟；

3)抗原修复：在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液(ph6.0)至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次；

4)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体；

5)滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时；

6)4℃过夜后需在37℃复温45分钟；

7)PBS洗3次每次2分钟；

8)滴加二抗45-50μl,室温静置或37℃1小时；

9)二抗中可加入0.05％的tween-20；

10)PBS洗3次各5分钟；

11)DAB显色5-10分钟，在显微镜下观察。

结果如图3所示，OsT5H主要在水稻中间(髓部)表达，距离根尖越远则表达强度减弱，但侧根还是表现出很强的信号(a-d)。切片与5羟色胺抗体进行孵育，进行原位杂交。野生型水稻的5羟色胺也同样富集在髓部(棕黄色部分)(i)，而ost5h突变体则没有表现出5羟色胺富集(j)。

通过上述结果，证实了基因OsT5H在水稻根部有着强烈的表达信号。

为了进一步探究基因OsT5H在根部组织中可能发挥的功能。用不同的化合物溶液对OsT5Hpro：：GUS小苗植株进行培养，通过观察GUS染色的深浅来判断基因OsT5H 对不同外界环境的响应程度。

将种子OsT5Hpro：：GUS在蒸馏水中进行浸种，萌发，待长出胚根之后，将小苗移栽至各个不同化合物的溶液中，并设置三个浓度梯度，依次是1mol/L，100mmol/L， 10mmol/L。在上述溶液中培养2小时之后，用90％丙酮进行固定10分钟，蒸馏水洗净之后置于GUS染液中染色12小时。

通过染色，我们发现植株OsT5Hpro：：GUS对各种溶液以及溶液浓度的响应程度并不一样(如图4)。发现具有以下规律：①一般而言，溶液中金属离子的浓度越高，那么基因T5H的响应程度就越弱，表现出无色的特征；②无金属离子或者低分子量金属离子化合物对OsT5H的表达水平没有影响；③对Fe³⁺，Cu²⁺则表现得更加敏感，即使在10mmol/L的情况依旧能够抑制基因的表达。

结果表明，FeCl₃，CuCl₂，CuSO₄三种溶液的处理都能抑制OsT5H基因的表达，而这三者恰巧属于重金属类离子。

我们进一步稀释这三种溶液的浓度，当溶液浓度在0.1mmol/L的情况下基因OsT5H又能被激活，表现出GUS染色阳性。说明可以用OsT5Hpro：：GUS材料作为环境中Fe³⁺，Cu²⁺两种重金属离子的指示材料，就有很大的应用价值。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 水稻基因OsT5H在参与金属离子浓度响应中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2026

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 1

gttcatacca acacatctcc attgctgctt aagtttcttg gaccaaacgt gcaccccaag 60

tgttcgacga tatggagctc accatggcgt cgacgatgtc gctcgcgctg ctcgtgctct 120

ccgcggcgta cgtgttggtc gcgttgagga ggagccggtc gtcgtcgtca aagccacggc 180

ggctgccgcc gtcgccgccg gggtggccgg tgatcgggca cctccacctc atgtccggca 240

tgccgcacca cgcgctggcc gagctggcgc gcaccatgcg cgcgccgctg ttccggatgc 300

ggctggggag cgtgccggcg gtggtgatct ccaagccgga cctcgcccgc gccgcgctca 360

ccaccaacga cgccgcgctg gcgtcgcggc cgcacctgct ctccggccag ttcctgtcgt 420

tcggctgctc cgacgtgacg ttcgcgccgg cggggccgta ccaccggatg gcgcgccgcg 480

tggtggtgtc ggagctcctg tcggcgcgtc gcgtcgccac gtacggcgcc gtcagggtca 540

aggagctccg ccgcctgctc gcgcacctca ccaagaacac ctcgccggcg aagcccgtcg 600

acctcagcga gtgcttcctc aacctcgcca acgacgtgct ctgccgcgtc gcgttcggcc 660

gccggttccc gcacggcgag ggcgacaagc tcggcgcggt gctcgccgag gcgcaggacc 720

tcttcgccgg gttcaccatc ggcgacttct tccccgagct cgagcccgtc gccagcaccg 780

tcaccggact ccgccgccgc ctcaagaagt gcctcgccga cctccgcgag gcctgcgacg 840

tgatcgtgga cgaacacatc agcggcaacc gccagcgcat ccccggcgac cgcgacgagg 900

acttcgtcga cgtcctcctc cgcgtccaga aatcccccga cctcgaggtc cccctaaccg 960

acgacaatct caaggccctc gtcctggtac gccattaata cccaccatta aaactctcga 1020

attgactcgc cgccattgtt gctcctcctc tgatcttgac atgacgtgac aacaaccacc 1080

aggacatgtt cgtcgccggc acggacacca cgttcgcgac gctggagtgg gtgatgacgg 1140

agctagtccg ccacccacgg atcctcaaga aggcgcagga ggaggtccgg cgagtcgtcg 1200

gcgacagcgg ccgcgtcgag gagtcccacc tcggcgagct ccactacatg cgcgccatca 1260

tcaaggagac gttccggctg cacccggcgg tgccgttgct agtgccgcgc gagtccgtcg 1320

cgccgtgcac gctgggcggc tacgacatcc cggcgaggac gcgggtgttc atcaacacgt 1380

tcgccatggg gcgcgacccg gagatctggg acaacccgct ggagtactcg ccggagaggt 1440

tcgagagcgc cggcggcggc ggcgagatcg acctcaagga cccggactac aagctgctgc 1500

cgttcggcgg cgggcggcga gggtgccccg gctacacgtt cgcgctcgcc accgtgcagg 1560

tgtcgctcgc cagcttgctc taccacttcg agtgggcgct gcccgccggc gtgcgcgccg 1620

aggacgtcaa cctcgacgag acgttcggcc tcgccacgag gaagaaggag ccgctcttcg 1680

tcgccgtcag gaagagcgac gcgtacgagt ttaagggaga ggagcttagt gaggtttaag 1740

ttaaattaag taatgattag cgatagatag atttttatta tttttattat gttttgggat 1800

aataataagg gttaaagttt tgtgcttgct aagtaacctg gaggctggag ctggtaatat 1860

tgtgactaag cagagaagca agcctgtgtg atttcgatgt aaaagtacag gatatggtgc 1920

ctaatgaata aaagaagtca ataagtggcg tatttctctt gtaacttgta agctatatcg 1980

aattttaaac tttagagatt aatttatggt tctttttgtt atgatt 2026

<210> 2

<211> 2500

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 2

atattgatgt gacatatatg ccacatggaa ttcaaatatg gttccgtacc actgaacttg 60

tggtatttaa atgtttgtct tttcatggtg tattcaaagt ggctgctact tcgggggcag 120

cgaacttaac tcgtgcatgc agtgccaccg aagtccaagt gattcagctt ccacgcacac 180

agtacatctg aacgctgttg tcatttgata acattggcct tcccgacacc tccttccatg 240

ctcttaagtc acagcgcgtg cacatgaatt agcggcgacg ctgcgagtgc cacacgtttt 300

tcaagcttgg agagactgga gagggatgga ggagatggag agatggagga gagaagctga 360

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gtttagattc ttcaaacttt taacttttct atcacattaa aacttttcta cacacataaa 960

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aaactgcaag acaaatttat taaacctaat taatccgtca ttagcaaata tttacggtag 1320

catcatatca aatcatggcg taattaggct cgaaagattc gtttcgtaat ttacatgcaa 1380

attgtgcaat tggttttttc cccacattta atgcctcatg catgtgtcca aacatttaat 1440

gtaatgtttt tggccaaaat tgtttgggat ctaaacaaag cctttgtgct ttatatgtaa 1500

catctgtgac tgtaaagtgg gcatattata ctcccttcgt ttaatattgt aagttgtttt 1560

gatttttttc tctagctaaa ctttttaagt ttgataattt tttatagaaa aatatagtaa 1620

cattttcaac gtaaaacgaa catattatca aaatatatat tcaattttat atttaaaaga 1680

aataatttgg tgttgtggaa gttgttaatt ttttttataa attcagtgaa acctaactac 1740

ggttgtttag aaaagaacgg cttatagtat aaaacaaagg gagaacatat aaagtataaa 1800

atatagaggt cagacctctc tggttggtag ttggggcatg cttgactgag ccgtggcaac 1860

caattttaaa cttcagaaat tagggctttg aattgcttca ttaatcagtt tgggcttttg 1920

gatctctaca ttaactcacg tgtgctaatg atagattaat taagtttaat aaatttatct 1980

cgtgatttcc agacaaatta tgaaattatt tttttcattc gtattcgaaa acctcttccg 2040

atatccggtc aaacgtccca tgtgacatta aaaaaattct tttcgcgaac tagacacagg 2100

agtataggag gagcgtgctt ggtcgatacg cacttcacac gtgccatctt tctatcacat 2160

tactgttcat gccgtcaata ttaatttcct tatcttggat ggtagcaact aatgcaatca 2220

tgcatgatga ttatatattt ctgtctacag tagtctatgc ataaataatt tgatgcaatt 2280

aattccacat taattcgctg tttcaacatc catcttacta gttagagtac tacacaagta 2340

tacactatct gtcgcattcc acaccttgat ctcagataac gttgatctct tcaactcatg 2400

tgataaatct aatgaaaatc ttcagtgccc aacgtgtgca tctacctctc ctccaaccaa 2460

ccacccacta tataaaccct tccccactta accacggtta 2500

Claims

1.水稻基因OsT5H在参与金属离子浓度响应中的应用，其特征在于，所述水稻基因OsT5H的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述金属离子为Fe³⁺或Cu²⁺。

2.水稻基因OsT5H编码的蛋白在参与金属离子浓度响应中的应用，其特征在于所述水稻基因OsT5H的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述金属离子为Fe³⁺或Cu²⁺。

3.一种参与金属离子浓度响应的转基因水稻材料的制备方法，其特征在于，包括：

(1)构建包含水稻基因OsT5H启动子和报告基因GUS的目的基因；

所述水稻基因OsT5H启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；(2)将所述目的基因连接进原始载体中，形成OsT5Hpro：：GUS载体；所述原始载体为pCAMBIA1300；

(3)再将所述OsT5Hpro：：GUS载体转入水稻植株中，筛选获得阳性且纯合的转基因水稻材料；所述金属离子为Fe³⁺或Cu²⁺。

4.如权利要求3所述的参与金属离子浓度响应的转基因水稻材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，采用农杆菌转化法将所述OsT5Hpro：：GUS载体转入水稻植株中。

5.如权利要求3～4任一项所述的制备方法制得的转基因水稻材料作为指示材料在响应环境中金属离子污染物浓度的应用，其特征在于，所述金属离子为Fe³⁺或Cu²⁺。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述环境为含FeCl₃的水溶液，含CuCl₂的水溶液或含CuSO₄的水溶液。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述转基因水稻材料的指示部位为根部。