CN112522125A - 一种透明质酸酶工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种透明质酸酶工程菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种透明质酸酶工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明以优化改造后的透明质酸酶基因pl‑8为目的基因，构建重组质粒pPIC9K‑PL‑8，导入毕赤酵母X33感受态细胞中获得转化子X33/pPIC9K‑PL‑8，将转化子与融合载体pPICZB/PDI融合，获得重组菌株X33/pPIC9K‑PL‑8&PDI。本发明获得的透明质酸酶工程菌在发酵罐的放大培养中，可有效提高发酵上清液中透明质酸酶的含量和酶活。

Description

一种透明质酸酶工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种透明质酸酶工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
透明质酸酶(Hyaluronidase，HAase)广泛存在于哺乳动物，无脊椎动物及微生物中，是一种重要的生理活性物质，而且也是一种糖苷水解酶，主要用来降解透明质酸(Hyalurinan，HA)，是一类主要降解透明质酸的糖苷酶。自从上个世纪前半叶被人类发现，透明质酸酶在医药产业中起到了非常重要的作用。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质。
不同来源的HAase具有不同的结构特点和生物特性。随着HAase广泛的应用，该酶自身特有的生理功能和作用亟待研究和阐明，其不同来源的HAase的结构特点和底物HA的生理作用的研究也在不断的深入。根据氨基酸序列同源性比对的结果，可以将HAase分为两大家族，即真核生物来源的HAase以及原核生物来源的HAase。而根据催化机理的不同，HAase又被分为三类，这种分类方法主要基于HAase的底物专一性、生物化学分析以及反应产物。第一类为来源于哺乳动物的透明质酸-4-糖基水解酶家族(EC3.2.1.35)，具有水解和转糖苷活性，通过水解透明质酸的β-1,4糖苷键，产物主要为四糖，也可作用于硫酸软骨素或软骨素产生硫酸皮肤素产物。这一类的HAase中，比较被人熟知的是来源于睾丸、溶酶体以及蜜蜂毒液的HAase。第二类最具代表性的为来源水蛭的透明质酸-3-糖基水解酶家族(EC3.2.1.36)，通过水解透明质酸的β-1,3糖苷键，产物主要为四糖或六糖，对底物的专一性较强，对软骨素与硫酸软骨素不具有活性，并且不具有转糖苷活性。第三类为来源于微生物的透明质酸裂解酶(EC 4.2.2.1)，通过β-消除反应裂解透明质酸的β-1,4糖苷键，产物主要为4,5-不饱和双糖。此类透明质酸裂解酶可从许多种微生物中获得，如梭菌、微球菌、链球菌及链霉菌，并且它们的底物专一性也不同。
目前，商品化的透明质酸酶(动物组织提取制备)价格昂贵，动物来源的透明质酸酶主要用于临床中，促进药物扩散和吸收，由于此法生产透明质酸酶的成本高，所以不适合应用于工业化制备小分子HA。而且人们担心疯牛病的风险，多家提取法制备透明质酸酶制剂的厂家已停止该制剂的生产，人们希望使用更安全价廉的透明质酸酶。微生物来源的透明质酸酶不受来源限制，提取容易，纯度高，可以满足人们的这种需求，因此多家研究机构致力于研究微生物发酵法制备透明质酸酶。自透明质酸酵发现以来，人们已发现多种微生物可以产生透明质酸酶，但是迄今为止，文献中报道的微生物产的透明质酸酶酶活较低。微生物发酵液的酶活低限制了发酵法制备透明质酸酶及酶法制备和的工业化生产。因此，构建一种可以高效表达、分泌高酶活的基因工程菌，以提高透明质酸酶的质量和产量成为本领域迫切需要解决的一个技术问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种透明质酸酶工程菌及其构建方法与应用，以提高透明质酸酶的产量和酶活。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种透明质酸酶工程菌，所述工程菌为在毕赤酵母中导入透明质酸酶基因pl-8和分子伴侣pdi基因。
优选的，所述透明质酸酶基因pl-8来源于美国国家生物技术信息中心登录号为CP032266.1的链霉菌。
优选的，所述毕赤酵母为X33。
优选的，所述透明质酸酶基因pl-8的表达载体为pPIC9K。
优选的，所述分子伴侣pdi基因的载体为pPICZB。
本发明还提供了上述透明质酸酶工程菌的构建方法，包括：构建透明质酸酶基因pl-8的重组表达载体，将所述重组表达载体转入毕赤酵母感受态细胞中，再融合分子伴侣pdi得到工程菌。
优选的，所述重组表达载体的构建方法包括：去掉透明质酸酶基因pl-8的信号肽序列，设计引物对，导入克隆模板进行PCR扩增，纯化回收目的片段，连接表达载体。
优选的，所述引物对序列为：
F:GGAATTCCTCGCCAACACCGCGGA；
R:TGACCCTGCGGGGCTGAGCGGCCGCATTCTTAT。
优选的，上游引物添加限制性内切酶EcoRI识别位点，下游引物添加限制性内切酶NotI识别位点。
本发明还提供了上述透明质酸酶工程菌或上述方法构建得到的透明质酸酶工程菌用于发酵生产透明质酸酶的应用。
与现有技术相比，本发明的技术方案的有益效果如下：
本发明首次构建得到一种在毕赤酵母X33中高表达链霉菌透明质酸酶pl-8基因的基因工程菌，可显著提高工业生产中透明质酸酶的产量和酶活。
附图说明
图1为pl-8基因片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
图2为表达载体pPIC9k-PL-8构建流程图；
图3为重组质粒pPIC9K-PL-8线性化酶切产物琼脂糖凝胶电泳图，1：pPIC9K-PL-8质粒；
图4为不同毕赤酵母转化子酶活；
图5为重组蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图，M：Protein Marker；1、2：诱导后蛋白；3：诱导前空白；
图6为重组菌株X33/pPIC9K-PL-8&PDI放大培养时酶活变化，各点分别为诱导6h，12h，24h，48h，72h，96h，120h，144h小时的酶活；
图7为不同时间点发酵上清液聚丙烯酰胺凝胶电泳图，1～8：诱导6h，12h，24h，48h，72h，96h，120h，144h小时后的上清液。
具体实施方式
本发明提供了一种透明质酸酶工程菌，所述工程菌为在毕赤酵母中导入透明质酸酶基因pl-8和分子伴侣pdi基因。
本发明选择的透明质酸酶基因pl-8来源于美国国家生物技术信息中心登录号为CP032266.1的链霉菌(Streptomycesfradiae)。链霉菌透明质酸酶pl-8基因全长2607bp，编码869个氨基酸，其中包含信号肽序列(1-114)，信号肽序列如SEQ ID NO：1所示：
GGAATTCATGGAGATCACCCGCAGACGCCTGCTGACGGCCCTGGCGGCCACCGGACTCCTGGCGGTGGTGCCGCGGGGCCTCGCGGTGGCCGCCAGGGCCGCCGAGGGCCGCGC；
本发明对透明质酸酶基因pl-8进行优化改造：去掉上述链霉菌透明质酸酶pl-8基因的信号肽序列(SEQ ID NO：1)。本发明发现，pl-8基因自身信号肽分泌效果较差，将其去掉后，链霉菌透明质酸酶pl-8基因可以在毕赤酵母中高表达。
本发明针对去掉信号肽后的链霉菌透明质酸酶pl-8基因设计引物对：上游引物添加限制性内切酶EcoRI识别位点，具体序列如SEQ ID NO：2所示；下游引物添加限制性内切酶NotI识别位点，具体序列如SEQ ID NO：3所示。本发明利用该引物对进行PCR扩增，可以得到优化改造后的透明质酸酶基因pl-8。
本发明以优化改造后的透明质酸酶基因pl-8为目的基因，以pPIC9K为载体，构建重组表达载体pPIC9K-PL-8。pPIC9K载体大小9276bp，是融合表达载体，可以在毕赤酵母中高拷贝。本发明对pPIC9K载体的购买途径不作限定。
本发明将构建得到的重组表达载体pPIC9K-PL-8导入毕赤酵母X33中，得到重组菌X33/pPIC9K-PL-8。毕赤酵母X33属于真核细胞，可以表达外源蛋白，是基因工程中常用菌株。本发明对毕赤酵母X33的购买途径不作限定。
本发明构建分子伴侣pdi基因载体，根据伴侣蛋白PDI基因序列设计引物对：上游引物具体序列如SEQ ID NO：4所示；下游引物具体序列如SEQ ID NO：5所示。
本发明将伴侣蛋白基因pdi与载体pPICZB连接，构建克隆载体pPICZB-PDI。pPICZB载体大小3328bp，为毕赤酵母蛋白载体，可以甲醇的诱导下高水平表达融合蛋白。本发明对pPICZB载体的购买途径不作限定。
本发明将构建得到的分子伴侣pdi基因载体pPICZB-PDI与上述得到的重组菌X33/pPIC9K-PL8感受态细胞融合，得到融合分子伴侣PDI的重组工程菌X33/pPIC9K-PL-8&PDI。本发明发现，重组菌X33/pPIC9K-PL-8&PDI通过转化分子伴侣，可以进一步提高透明质酸酶表达量以及透明质酸酶酶活。
在本发明具体实施过程中，所述试剂、表达载体、菌株采用本领域常规市售产品即可；所述pPET30a-PL-8模板由河北农业大学赵国刚老师赠送；所述内切酶购于NEB。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例的目的是为了得到优化改造后的透明质酸酶基因pl-8。
(1)以美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)登录号为CP032266.1的链霉菌(Streptomycesfradiae)透明质酸酶基因pl-8为基础，对其进行优化改造：
针对透明质酸酶基因pl-8不含信号肽的基因序列，设计引物对：
F：GGAATTCCTCGCCAACACCGCGGA；
R：TGACCCTGCGGGGCTGAGCGGCCGCATTCTTAT。
上述引物对中，上游引物添加限制性内切酶EcoRI识别位点，上游引物具体序列如SEQ ID NO：2所示；下游引物添加限制性内切酶NotI识别位点，下游引物具体序列如SEQ IDNO：3所示。
以质粒pPET30a-PL-8为模板克隆，反应体系为(50μL)：质粒DNA 1ng，引物各0.2μmol/L，dNTPs 250μmol/L，5×Q5 High-Fidelity DNA Polymerase Buffer 10μL，Q5 High-Fidelity DNAPolymerase 0.5μL，ddH2O补足50μL。反应条件为：98℃5min，98℃30s，65℃30s，72℃60s，共30个循环；72℃10min。
反应完成后取PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到在2kb～3kb之间的范围内有明显的条带(详见图1)，表明优化改造后的pl-8基因克隆成功。
(2)用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带：
1)在紫外灯下将目的DNA片段切下，尽量切除多余的胶块，称重为0.1g。按照每1g/mL加入Binding Buffer 0.1mL，在60℃水浴中放置10min，期间涡旋振荡3次，至胶块完全溶解；
2)吸取700μL步骤1)中的溶解液到Hibinding DNA结合柱中，将结合柱放入收集管内，12000rpm离心1min，弃去液体；
3)将结合柱放回收集管中，加入300μL Binding Buffer，12000rpm离心1min，弃去液体；
4)将结合柱放回收集管中，加入700μL SPWWash buffer，12000rpm离心1min，弃废液；
5)将结合柱放回收集管中，加入700μL SPWWash buffer，12000rpm离心1min，弃废液：
6)将结合柱放回收集管中，12000rpm离心1min，弃废液；
7)把结合柱放入无菌的1.5mL离心管中，加入20μL ddH2O，12000rpm离心1min，将所得的DNA溶液保存于-20℃。
实施例2
在本实施例中，基于实施例1中纯化回收得到的PCR产物，构建工程菌X33/pPIC9K-PL-8。
(1)构建重组质粒pPIC9K-PL-8
将纯化回收的PCR产物和分泌型表达载体pPIC9K分别用EcoRI和NotI双酶切，酶切产物经纯化后混匀，于16℃连接12～16h得到重组质粒pPIC9K-PL-8。pPIC9K-PL-8构建流程图详见图2。
将构建好的pPIC9K-PL-8转化导入大肠杆菌E.coli DH5α，并随机挑选具有抗性的转化子菌落，经LB液体培养基培养扩增后，提取质粒。通过EcoRI和NotI双酶切验证重组质粒pPIC9K-PL-8是否构建成功。
(2)构建工程菌X33/pPIC9K-PL-8
将酶切正确的重组质粒pPIC9K-PL-8利用SacI进行线性化酶切，10μL酶切线性化体系如下：
表1线性化酶切体系
Figure BDA0002864445220000061
Figure BDA0002864445220000071
上述体系在37℃水浴锅中反应3h，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测是否已经酶切完全(电泳图详见图3)，可见，在大于10000bp处有明显的条带，且条带无明显拖尾现象，表明重组质粒pPIC9K-PL-8已经酶切完全。
回收酶切产物并纯化。取纯化产物8μL一并加入毕赤酵母X33感受态细胞中，转入电转杯，选好电击程序(1.5kv，5ms)，电击结束后立即加入1mLYPDS液体培养基，混匀后转到无菌离心管中，30℃静置培养2～6h，5000rpm离心2min，弃上清，用1mL过滤除菌的饱和生理盐水洗3次，取200μL涂布于YPDS平板(含100μg/mL G418)上，静置培养3d后获得转化子X33/pPIC9K-PL-8。
实施例3
本实施例的目的是为了构建分子伴侣pdi基因载体。
根据伴侣蛋白PDI基因序列设计寡核苷酸链，合成引物(详见表2)，通过PCR技术利用引物Pl和P2以毕赤酵母的基因组为模板扩增出PDI基因序列，两端均分别含有BstBI和NotI酶切位点。
表2分子伴侣基因PCR扩增引物列表
Figure BDA0002864445220000072
引物P1序列如SEQ ID NO：4所示；引物P2序列如SEQ ID NO：5所示。
按表3中的反应体系进行PCR扩增，PCR反应条件为：98℃5min；98℃30s，65℃30s，72℃60s，72℃10min，30个循环。
表3 PCR反应体系
Figure BDA0002864445220000073
Figure BDA0002864445220000081
将PCR产物和pPICZB载体分别用BstBI和NotI双酶切，酶切产物经纯化后混匀，连接得到克隆载体pPICZB-PDI。将构建好的pPICZB-PDI转化导入E.coli T1感受态细胞，挑取单克隆进行PCR，进行酶切鉴定和基因测序，获得正确的融合载体pPICZB-PDI。
实施例4
在本实施例中，进行融合分子伴侣PDI工程菌株的构建。
将实施例3中测序正确的重组质粒pPICZB-PDI用SfoI限制内切酶进行线性化后，电击实施例2中构建得到的转化子X33/pPIC9K-PL-8感受态细胞，电击程序为1.5kv，5ms。然后再加入预冷的YPDS 30℃静置培养2～6h后，涂布在终浓度100μg/mL G418和50μg/mLZeocin的YPD双抗平板上，置于30℃培养3天后获得转化子X33/pPIC9K-PL-8&PDI。
实施例5
在本实施例中，对实施例2和实施例4中得到的毕赤酵母转化子进行筛选。
将重组菌株X33/pPIC9K-PL-8和X33/pPIC9K-PL-8&PDI分别挑取单菌落18组，并分别接种到5mL含100μg/mLG418的YPCS液体培养基的试管中，在温度为30℃、转速为200r/min的条件下振荡培养3天，培养期间每隔24h按照体积比1％添加甲醇进行诱导，72h收菌，12000r/min离心5分钟收集上清。采用DNS法测定透明质酸酶的活力，并以此来确定重组子是否为阳性，保存酶活较高的菌株。
取18组重组菌株X33/pPIC9K-PL-8中活性最高的一组标记为P-0，重组菌株X33/pPIC9K-PL-8&PDI中的18组分别标记为P-1～P-18，保存酶活较高的菌株P-1、P-5、P-6、P-10、P-14、P-16、P-17、P-18(详见图4)，可知，重组菌株融合分子伴侣PDI后的酶活显著提高。
对酶活较高的P-1、P-5、P-6、P-16、P-18菌株再次进行验证：将上述菌株分别接种到5mL含100μg/mLG418的YPCS液体培养基的试管中，在温度为30℃、转速为200r/min的条件下振荡培养3天，培养期间每隔24h按照体积比1％添加甲醇进行诱导，72h收菌，12000r/min离心5分钟收集上清，采用DNS法测定透明质酸酶的活力。每组菌株的酶活进行三次平行实验。重组菌株X33/pPIC9K-PL-8&PDI菌株筛选结果见表4。
表4菌株筛选结果
Figure BDA0002864445220000091
由表4可知，P-1、P-5、P-6、P-16、P-18菌株在三次平行实验中均表现出高酶活的特点，具有高度稳定性。证明本发明构建得到的重组菌株X33/pPIC9K-PL-8&PDI具有高酶活，且稳定性高。
注：透明质酸酶活测定方法—DNS法
DNS在碱性溶液中被HAase降解HA产物中的还原糖还原为氨基化合物，沸水浴中显色时间5min，冷却后立即测定540nm处的吸光度A540。将0.5mL 0.5％的HA溶液与0.5mL样品液混合，37℃水浴30min，煮沸5min停止反应，离心沉淀变性蛋白，取上清液0.4mL，加0.8mLDNS溶液。DNS被HAase降解HA产物中的还原糖还原为氨基化合物，煮沸5min使之充分显色，冷却后立即测定。
实施例6
在本实施例中，对重组菌株X33/pPIC9K-PL-8&PDI进行重组蛋白的诱导表达和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析
将重组菌株X33/pPIC9K-PL-8&PDI挑取单菌落接种于5mL含100μg/mL G418的YPCS液体培养基的试管中，15h后加1％(v/v)甲醇进行诱导表达，之后24h和48h后均各加1％(v/v)甲醇诱导，72h收菌，12000r/min离心5min收集上清，经中空纤维柱(10kD)浓缩得到粗酶液，进行SDS-PAGE检测：
(1)取重组毕赤酵母浓缩液稀释10倍后，分别与5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液充分混匀，煮沸15min。室温冷却后将3组样品以及蛋白质分子量Marker分别进行加样；
(2)将电泳槽置于冰上，80V电泳20min后，将电压调至200V，继续电泳1h，当指示剂与分离胶底部约距离约l cm时，断开电源；
(3)将凝胶放入考马斯亮蓝染色液中，室温摇床振荡1h；
(4)将凝胶放入考马斯亮蓝脱色液中，室温摇床振荡，并经常更换脱色液，直至凝胶脱色，蛋白条带清晰。
经SDS-PAGE检测目的蛋白分子量在85kD左右(见图5)，与预测大小相符，表明重组菌株X33/pPIC9K-PL-8&PDI可以诱导表达透明质酸酶。
实施例7
在本实施例中，对重组菌株X33/pPIC9K-PL-8&PDI进行上罐发酵。
将重组菌X33/pPIC9K-PL-8&PDI在10L发酵罐中进行放大培养：将含有分子伴侣PDI的X33/pPIC9K-PL-8&PDI菌株按3％接种量接种到3mL YPD的一级试管种子液中，30℃，250rpm，培养12h；按3％接种量转接到装液量100mLBMGY(1％酵母浸出物，2％蛋白胨，1.34％YNB，400生物素，1％甘油，100MmpH6.0的磷酸钾缓冲液)的二级种子液摇瓶中(500mL)，30℃，250rpm，培养12h后，OD600到10；按10％的接种量接种到10L的发酵罐中，发酵罐初始装5.6LBSM培养基，初始发酵控制温度30℃，用浓氨水(28％)控制pH为5.0，通过调节搅拌转速和通气量控制罐上溶氧在20％以上。待BSM中甘油耗尽溶氧上升后，以18.15mL/h/L的速率流加含有1.2％(v/v)PTM 1的50％(w/v)甘油，待OD600到150以上时停止流加甘油，饥饿培养1.5h，以6g/h/L的速率流加含有1.2％(v/v)PTM1的100％甲醇，调节搅拌转速和通气量控制溶氧在20％以上。
在10L发酵罐中，重组菌在甘油补料阶段生长速度很快，在甘油耗尽时(30h)生物量OD600已近200；此时添加甲醇进行诱导，细胞生长繁殖放缓，但菌体量仍持续增加。随着甲醇添加，透明质酸酶酶活不断提升，诱导144h时酶活达到198U/mL，诱导144h后酶活开始降低，表明重组菌株X33/pPIC9K-PL-8&PDI在放大培养中可达到的最大酶活为198U/mL(见图6)。此外，对不同时间点的发酵上清液进行SDS-PAGE电泳分析(见图7)，结果显示各上清液在SDS-PAGE图中85kD处有一条清晰条带，该条带随发酵时间增加而变得浓重清晰，表明发酵上清液中透明质酸酶含量随着发酵时间增加而显著提高，与酶活增长趋势保持一致。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 河北省微生物研究所
<120> 一种透明质酸酶工程菌及其构建方法与应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaattcatg gagatcaccc gcagacgcct gctgacggcc ctggcggcca ccggactcct 60
ggcggtggtg ccgcggggcc tcgcggtggc cgccagggcc gccgagggcc gcgc 114
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaattcctc gccaacaccg cgga 24
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgaccctgcg gggctgagcg gccgcattct tat 33
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctatttcgaa acgatgcaat tcaactggga tattaaaact g 41
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ataagaatgc ggccgctaaa gctcgtcgtg agcgtctgcc tc 42

Claims (10)

1.一种透明质酸酶工程菌，其特征在于，所述工程菌为在毕赤酵母中导入透明质酸酶基因pl-8和分子伴侣pdi基因。
2.根据权利要求1所述的透明质酸酶工程菌，其特征在于，所述透明质酸酶基因pl-8来源于美国国家生物技术信息中心登录号为CP032266.1的链霉菌。
3.根据权利要求1所述的透明质酸酶工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母为X33。
4.根据权利要求1所述的透明质酸酶工程菌，其特征在于，所述透明质酸酶基因pl-8的表达载体为pPIC9K。
5.根据权利要求1所述的透明质酸酶工程菌，其特征在于，所述分子伴侣pdi基因的载体为pPICZB。
6.如权利要求1～5任意一项所述的透明质酸酶工程菌的构建方法，其特征在于，构建透明质酸酶基因pl-8的重组表达载体，将所述重组表达载体转入毕赤酵母感受态细胞中，再融合分子伴侣pdi得到工程菌。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述重组表达载体的构建方法包括：去掉透明质酸酶基因pl-8的信号肽序列，设计引物对，导入克隆模板进行PCR扩增，纯化回收目的片段，连接表达载体。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述引物对序列为：
F:GGAATTCCTCGCCAACACCGCGGA；
R:TGACCCTGCGGGGCTGAGCGGCCGCATTCTTAT。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，上游引物添加限制性内切酶EcoRI识别位点，下游引物添加限制性内切酶NotI识别位点。
10.如权利要求1～5任意一项所述透明质酸酶工程菌或权利要求6～9任意一项所述方法构建得到的透明质酸酶工程菌用于发酵生产透明质酸酶的应用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115820694A (zh) * 2022-12-30 2023-03-21 天津科技大学 一种新型透明质酸酶编码基因及其高产工程菌、构建方法与应用
CN117887691A (zh) * 2023-12-27 2024-04-16 山东福瑞达医药集团有限公司 一种透明质酸酶融合蛋白、酵母工程菌及构建方法与应用
TWI844975B (zh) 2021-10-09 2024-06-11 大陸商華熙生物科技股份有限公司 一種高產透明質酸酶的工程酵母菌株及其應用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100172892A1 (en) * 2007-06-19 2010-07-08 Uvarkina Tamara P Hyaluronidase and method of use thereof
CN102154405A (zh) * 2011-01-13 2011-08-17 云南省微生物发酵工程研究中心有限公司 一种透明质酸的制备方法
CN104263707A (zh) * 2014-10-08 2015-01-07 江南大学 一种提高毕赤酵母重组表达透明质酸酶的方法
US20160168554A1 (en) * 2013-06-17 2016-06-16 Fidia Farmaceutici S.P.A. Bacterial hyaluronidase and process for its production

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100172892A1 (en) * 2007-06-19 2010-07-08 Uvarkina Tamara P Hyaluronidase and method of use thereof
CN102154405A (zh) * 2011-01-13 2011-08-17 云南省微生物发酵工程研究中心有限公司 一种透明质酸的制备方法
US20160168554A1 (en) * 2013-06-17 2016-06-16 Fidia Farmaceutici S.P.A. Bacterial hyaluronidase and process for its production
CN104263707A (zh) * 2014-10-08 2015-01-07 江南大学 一种提高毕赤酵母重组表达透明质酸酶的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
OHYA等: "Novel hyaluronidase from Streptomyces", 《BIOCHIM. BIOPHYS. ACTA》 *
刘勇等: "细菌来源透明质酸酶的研究进展", 《国外医药(抗生素分册)》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI844975B (zh) 2021-10-09 2024-06-11 大陸商華熙生物科技股份有限公司 一種高產透明質酸酶的工程酵母菌株及其應用
CN115820694A (zh) * 2022-12-30 2023-03-21 天津科技大学 一种新型透明质酸酶编码基因及其高产工程菌、构建方法与应用
CN117887691A (zh) * 2023-12-27 2024-04-16 山东福瑞达医药集团有限公司 一种透明质酸酶融合蛋白、酵母工程菌及构建方法与应用

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