CN117384892A - 一种蛋白酶k突变体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种蛋白酶K突变体及其制备方法，所述蛋白酶K突变体的氨基酸序列是在亲本蛋白酶K氨基酸序列的基础上第244位的甲硫氨酸(Met)替换为苯丙氨酸(Phe)。适宜条件下，本发明蛋白酶K突变体发酵液酶活力高达4325.54±51.76U/mL，与其亲本(3276.24U/mL)对比酶活力提高了32.03％左右。

Description

一种蛋白酶K突变体及其制备方法
技术领域
本发明属于基因工程与酶工程技术领域，具体涉及一种蛋白酶K突变体及其制备方法。
背景技术
蛋白酶K(EC 3.4.21.64)，是一种来自于林伯氏白色念球菌(Tritirachium albumlimber)的丝氨酸蛋白酶，具有典型的催化三联体结构Asp39-His69-Ser224，是已知的内肽酶中最有活性的之一，能非特异性水解天然的和变性的蛋白质，能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和肽键。成熟蛋白酶由279个氨基酸组成，两个二硫桥和两个键合的钙离子使得紧密结构稳定。一般条件下，蛋白酶K使用的pH范围是7-10.0之间，在20-60℃之间蛋白酶K的活性都可以达到80％以上。在科研方面，该酶被广泛应用于核酸的提取过程，是重要的工具酶。随着核酸检测技术的发展，蛋白酶K作为降解蛋白质，提取RT-qPCR模板的重要酶类，市场需求量激增。同时该酶对SDS、尿素等具有良好的抗性，因此在洗涤业、饲料行业，以及污水处理、造纸、食品等领域均展现出良好的应用效果。
早期商业化供应的蛋白酶K主要由林伯氏白色念球菌获得。林伯氏白色念球菌生长缓慢，难以高密度培养，蛋白酶K的产量较低，林伯氏白色念球菌还会分泌其他的蛋白酶，增加了下游分离纯化的难度。后来罗氏诊断等公司(US7368274B2，WO2002072634A2)利用毕赤酵母表达体系实现了蛋白酶K的分泌表达，降低了纯化成本，提高了蛋白酶K的产量。但是该酶与国外商品化蛋白酶相比，活性还有一定差距。因此如何对蛋白酶K进行改造，以提高其表达水平和酶活性具有重要意义。Yang H等(Yang H,Zhai C,Yu X,et al.High-levelexpression of Proteinase K from Tritirachium album Limber in Pichia pastorisusing multi-copy expression strains[J].Protein Expression and Purification,2016:38-44.)以毕赤酵母GS115作为宿主重组表达T.album Limber蛋白酶K的突变体，该突变体携带6个突变，具有比野生型蛋白更高活性。
发明内容
针对当前产业需求和现有技术不足，本发明目的在于提供一种酶活力提高的蛋白酶K突变体及其制备方法。本发明主要通过易错PCR构建蛋白酶K突变库，筛选获得了蛋白酶K酶活力提高的突变体。
为了实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：
本发明提供一种蛋白酶K突变体，所述蛋白酶K突变体的氨基酸序列是在亲本蛋白酶K氨基酸序列的基础上第244位的甲硫氨酸(Met)替换为苯丙氨酸(Phe)，所述亲本蛋白酶K氨基酸序列如SEQ ID NO：1、2或3所示。
根据本发明一种实施方式，所述蛋白酶K突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明还提供上述蛋白酶K突变体的编码基因。
本发明还提供包含上述编码基因的载体、重组载体或表达载体。
本发明还提供包含上述编码基因或重组载体的宿主细胞。
本发明还提供上述蛋白酶K突变体的应用，其用于酶解蛋白质，优选的，用于分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和/或肽键。
本发明还提供制备上述蛋白酶K突变体的方法，该方法通过利用本发明所述蛋白酶K突变体的编码基因或包含编码基因的表达载体进行基因重组和表达。
本发明还提供一种酶解蛋白质的方法，该方法包括使蛋白质与本发明所述蛋白酶K突变体接触的步骤，在能够通过所述蛋白酶K突变体催化酶解蛋白质的条件下进行。
本发明还提供一种提高蛋白酶K酶活力的方法，该方法是通过在亲本蛋白酶K中引入M244F取代，所述亲本蛋白酶K具有如SEQ ID NO：1、2或3所示的氨基酸序列。
本发明有益效果：
本发明利用易错PCR技术，在体外对林伯氏白色念球菌来源蛋白酶K进行定向进化，获得酶活力提高的蛋白酶K突变体M244F及其重组菌株TCCC 31261，适宜条件下，本发明蛋白酶K突变体发酵液酶活力高达4325.54±51.76U/mL，与其亲本(3276.24U/mL)对比酶活力提高了32.03％左右。
附图说明
图1：亲本TCCC 31259与突变体TCCC 31261的酶活力。
图2a和2b：亲本TCCC 31259与突变体TCCC 31261的最适温度。
图3a和3b：亲本TCCC 31259与突变体TCCC 31261的最适pH。
图4a和4b：亲本TCCC 31259与突变体TCCC 31261的温度稳定性。
图5a和5b：亲本TCCC 31259与突变体TCCC 31261的pH稳定性。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案进一步叙述本发明。除非特别说明，以下实施方案所涉及的技术手段、材料等均可以是本领域技术人员所公知的，可以在已知的能解决相应技术问题的手段和材料中选择合适的。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明提供一种蛋白酶K突变体，所述蛋白酶K突变体的氨基酸序列是在亲本蛋白酶K氨基酸序列的基础上第244位的甲硫氨酸(Met)替换为苯丙氨酸(Phe)，所述亲本蛋白酶K氨基酸序列如SEQ ID NO：1、2或3所示。
根据本发明一种实施方式，所述蛋白酶K突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明还提供上述蛋白酶K突变体的编码基因。
根据本发明一种实施方式，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
本发明还提供包含上述编码基因的载体、重组载体或表达载体，例如载体质粒pPIC9K与本发明所述编码基因构成的重组载体。
本发明还提供包含上述编码基因或重组载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是适合于从本发明的基因或载体生产本发明的蛋白酶K突变体的任何宿主，例如毕赤酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。
本发明还提供上述蛋白酶K突变体的应用，其用于酶解蛋白质，优选的，用于分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和/或肽键。
本发明上述蛋白酶K突变体相比其亲本蛋白酶K具体提高的酶活力，例如：提高了20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、100％以上。
本发明还提供制备上述蛋白酶K突变体的方法，该方法通过利用本发明所述蛋白酶K突变体的编码基因或包含编码基因的重组载体进行基因重组和表达。可以使用本领域技术人员已知的基因重组方法和表达宿主，并选择适合于宿主表达的培养基和培养条件。所述方法还可以包括回收所述蛋白酶K突变体的步骤，该回收步骤可能涉及了将蛋白酶K突变体从宿主的培养物或表达产物中进行分离或纯化的步骤，可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行。
本发明还提供一种酶解蛋白质的方法，该方法包括使蛋白质与本发明所述蛋白酶K突变体接触的步骤，在能够通过所述蛋白酶K突变体催化酶解蛋白质的条件下进行。
本发明还提供一种提高蛋白酶K酶活力的方法，该方法是通过在亲本蛋白酶K中引入M244F取代，所述亲本蛋白酶K具有如SEQ ID NO：1、2或3所示的氨基酸序列。
本发明中采用如下定义：
1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法
氨基酸残基使用公认IUPAC命名法，用三字母缩写或单字母符号形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
2、蛋白酶K突变体的标识
采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示蛋白酶K突变体中突变的氨基酸。例如M244F(或Met244Phe)，表示第244位的氨基酸由亲本蛋白酶K的甲硫氨酸(M)替换成苯丙氨酸(F)。本发明蛋白酶K氨基酸的编号方式是基于SEQ ID NO：2所示序列。
3、亲本蛋白酶K的定义
术语“亲本”或“亲本序列”指本发明突变之前就存在的序列，本发明在此基础上针对特定位置氨基酸进行替换以产生新的突变体。本发明亲本蛋白酶K的氨基酸序列如SEQID NO：1、2或3所示。SEQ ID NO：1来源于林伯氏白色念球菌(Tritirachium album limber)GenBank:P06873.2，并在其基础上已经携带6个位点的突变(Y151A，K208H，S273T，G293A，K332R，S337N)，其中，第1-15位表示信号肽，第16-105位表示前导肽，第106-384位表示成熟肽。SEQ ID NO：2是不含信号肽的蛋白酶K氨基酸序列，即SEQ ID NO：1的第16-384位。SEQID NO：3是蛋白酶K的成熟肽序列，即SEQ IDNO：1的第106-384位。
除非另外定义，本发明所使用的技术和科学术语都具有与本发明所属领域技术人员常规理解相同的意思。
以下将通过具体的实施例对本发明进行更详细描述。如无特别说明，以下实施例中：
本发明所用培养基及酶活测定方法如下：
LB培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
MD固体培养基：YNB 26.8，葡萄糖40.0，8×10-5％生物素。
YPD培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖10g/L，固体培养基加入琼脂18g/L。
YPG培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，丙三醇20g/L。
干酪素培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，琼脂粉15g/L，干酪素10g/L。配制方法为：以100mL的干酪素培养基为例，先将称取好的1g酵母粉、2g蛋白胨溶解于50mL水中，加入1.5g琼脂粉为A溶液；向50mL pH 9.0的缓冲液中加入1g干酪素加热成乳浊分散状态后为B溶液，混合A和B溶液后进行110℃灭菌15min，到入平板凝固后即可。
BMGY培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g溶于700mL水，使用时加入100mL pH 6.01mol/L磷酸钾缓冲液，100mL 10×YNB，2mL 500×生物素，10mL丙三醇。
BMMY培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g溶于700mL水，使用时加入100mL pH 6.01mol/L磷酸钾缓冲液，100mL 10×YNB，2mL 500×生物素，2.5mL甲醇。
蛋白酶K的活性测定方法：
(1)酶活定义
在一定温度和pH条件下，在1min内水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活单位，以U表示。测定方法主要参考国标GB/T 23527-2009。
(2)试剂配置
试剂I：0.4M碳酸钠溶液：42.4g Na2CO3固体溶解于1000mL水中。
试剂II：硼酸缓冲液：四硼酸钠固体9.54g，氢氧化钠固体1.6g，800mL去离子水溶解后，使用NaOH溶液调pH为10.59.±0.05，去离子水定容至1000mL。
试剂III：0.4M三氯乙酸溶液：65.4g三氯乙酸溶解于1000mL水中，避光保存。
试剂IV：福林酚试剂：福林试剂：去离子水＝1:2，4℃避光保存
试剂V：1％酪蛋白溶液：1g干酪素加入80mL硼酸缓冲液，沸水浴至干酪素溶解，NaOH溶液调pH至9，使用硼酸缓冲液定容至100mL。
(3)测定方法
试管中加入1mL稀释酶液，65℃预热2min，加入同样预热的酪蛋白溶液1mL，摇匀后65℃水浴10min，加入2mL三氯乙酸溶液，摇匀(空白对照先加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液)。取出冷却至室温，12000rpm离心2min。取上清液0.5mL，加碳酸钠溶液2.5mL，加福林试剂0.5mL，40℃显色20min，680nm波长下用酶标仪测定吸光度。
实施例所涉及的质粒见于表1：
表1
注：其中pPIC9K质粒为商业性质粒。
实施例所涉及的引物信息如表2所示：
表2
实施例1：蛋白酶K突变体的获得
(1)突变基因的获取
以文献报道的亲本蛋白酶K(SEQ ID NO：2)合成其基因序列，并以其基因为模板，以tprk-R、tprk-F引物构建亲本蛋白酶K在pPIC9K上的质粒，同时用EP-tprk-F、EP-tprk-R结合0.05mM，0.1mM，0.2mM，0.3mM，0.4mM，0.5mM不同浓度的Mn2+，通过易错PCR进行扩增，扩增反应体系如下：
Mn2+ 21μL
模板 1μL
Taq酶 25μL
引物tprk-F 2μL
引物tprk-R 2μL
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，蛋白酶K电泳条带大小在1000-1500bp之间，再由小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，获得混合突变体片段PRKMn。
(2)重组载体的构建
1)提取pPIC9K质粒，经EcoR I和Not I双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，再由DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到了线性化载体序列。
双酶切体系如下：
ddH2O 25μL
质粒模板 15μL
Q.cut Buffer 5μL
限制性内切酶EcoR I 2.5μL
限制性内切酶Not I 2.5μL
2)将酶切获得的线性载体片段和混合的目的基因片段通过无缝克隆连接形成重组质粒pPIC9K-PRK(亲本)、pPIC9K-PRKMn(突变体)。
无缝克隆酶反应体系如下：
无缝克隆酶 5μL
线性载体 xμL
插入片段 yμL
混合均匀后，50℃水浴反应15min。
PS：首先使用NanoDrop 2000C超微量分光光度计测量线性载体和目的基因的DNA浓度，根据公式：
pmols＝质量ng/(片段长度bp×0.65kDa)，
x：y＝1：2；x+y＝5，
此外，x、y的添加量应在0.01～0.25pmols之间，由此计算线性载体和插入片段的添加量。
3)提取重组pPIC9K质粒，其提取过程参照试剂盒的操作手册。经Sal I单酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，再由DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到了线性化重组质粒。
单酶切体系如下：
ddH2O 27μL
质粒模板 15μL
Q.cut Buffer 5μL
限制性内切酶Sal I 3μL
混匀后，37℃水浴酶切2h，反应完成后将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，再由小量DNA回收试剂盒回收酶切产物：线性重组质粒pPIC9K-PRK和混合pPIC9K-PRKMn。
实施例2：重组蛋白酶K突变体质粒在毕赤酵母中的转化及筛选
取15μL线性片段与80μL GS115酵母感受态细胞混匀，转移至冰预冷的电转杯(两极间隙2mm)中，放入电转仪中电击，电击参数：1500V，25μF，200Ω；之后迅速向电转杯中加入200μL，1M的山梨醇溶液1mL，再加入800μLMD培养基，混匀后转至1.5mL EP管中，30℃摇床活化2h；将菌体悬液离心去上清，加入80μL MD培养基重悬，涂布于MD平板，倒置于30℃培养箱中，培养至出现单菌落。
将转化得到的酵母单菌落点到1％酪素平板上，每12h加入200μL甲醇于培养皿盖子上进行诱导；诱导48-60小时后观察酪素平板上的水解圈，出现水解圈对应的单菌落即为蛋白酶K重组菌落。筛选结果为获得一突变株单菌落，提取质粒，送至生物公司进行测序，并将突变株命名为TCCC 31261，亲本原始菌株命名为TCCC 31259。经过测序可知，获得的蛋白酶K突变体第244位氨基酸甲硫氨酸Met突变为苯丙氨酸Phe，突变体氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示：
APAVEQRSEAAPLIEARGEMVANKYIVKFKEGSALSALDAAMEKISGKPDH
VYKNVFSGFAATLDENMVRVLRAHPDVEYIEQDAVVTINAAQTNAPWGLA
RISSTSPGTSTYYYDESAGQGSCVYVIDTGIEASHPEFEGRAQMVKTYYASSR
DGNGHGTHCAGTVGSRTYGVAKKTQLFGVKVLDDNGSGQYSTIIAGMDFV
ASDHNNRNCPKGVVASLSLGGGYSSSVNSAAARLQSSGVFVAVAAGNNNA
DARNYSPASEPSVCTVGATDRYDRRSSFSNYGSVLDIFAPGTSILSTWIGGST
RSISGTSMATPHVAGLAAYLMTLGRTTAANACRYIADTANKGDLSNIPFGTVNLLAYNNYQA；
突变体基因序列如SEQ ID NO：5所示：
gctccagccgttgaacaaagatctgaagctgctccattgattgaagctagaggtgaaatggttgcaaacaagtacattgtta
agtttaaggaaggttctgctctatccgctctggacgctgctatggaaaagatttctggaaagccagatcatgtttacaaaaa
cgtcttttctggttttgctgccactcttgatgaaaacatggttagagttttgagagctcatcctgacgttgaatacattgagcaa
gatgccgttgtgactataaacgctgcacaaactaacgctccatggggattggctagaatttcttctacttctccaggtacttc
aacatactactatgatgaatctgcaggtcagggtagttgtgtttacgttattgatactggtattgaggcttctcatccagaattt
gaaggtagggctcaaatggtgaagacttattacgcttcatcaagagatggtaacggtcatggtactcattgtgctggtacc
gttggttctaggacttacggtgttgctaagaagactcaactgtttggtgttaaggttttggatgataatggcagtggtcaatatt
ctactattattgcaggtatggattttgttgcatctgatcataacaacagaaactgtccaaagggtgttgttgcttctttgtctttgg
gcggtggttactcttcttctgtgaactctgccgcagcccgtttgcagtctagtggtgtatttgtcgctgttgcagcaggtaaca
acaacgcagatgctagaaattactctcccgcttctgagccatctgtatgcacggttggagccactgacagatacgatagac
gttctagtttttctaactacggctctgttcttgacatttttgctccaggaacttctattttgtctacttggattggaggctctacaag
gtctatatcaggtacatctatggctactccacacgttgccggtttggctgcctacttaatgactttgggtagaactactgctgc
taacgcttgcagatatattgccgatacagctaataagggtgatttgagtaacattccatttggtactgtcaatttgttggcttac
aataactaccaagcttaa
实施例3：蛋白酶K及其突变体在毕赤酵母中表达和酶学性质测定
摇瓶发酵：将基因工程菌株TCCC 31259、TCCC 31261在YPD平板上进行三区划线，30℃倒置培养，挑取活化的单菌落于5mL YPG培养基中，30℃，220r/min振荡培养24h，以2％的接种量转接于50mL BMGY液体培养基至OD600达2-6，再转接于50mL BMMY液体培养基中，30℃，220r/min振荡培养每隔12h补加0.5％的甲醇诱导表达6d，取144h发酵液，经4℃、12000r/min离心2min，取发酵液上清液，适当稀释后按照国标法测定蛋白酶K活力。结果表明，经144h摇瓶发酵，突变株发酵液酶活力高达4325.55±51.76U/mL，以出发菌株3276.24U/mL为对比酶活提升32.03％左右。
最适温度测试：分别将突变体重组菌TCCC 31259、亲本重组菌TCCC 31261发酵液上清，在不同温度(45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃)，pH 9.0的条件下测定蛋白酶K的酶活。以所测的不同反应温度下最高酶活力为100％，突变体TCCC 31261(图2b)和亲本TCCC 31259(图2a)所表达的蛋白酶K最适温度均为65℃，但是在45-70℃范围内突变体TCCC31261所表达的蛋白酶K活力保持在60％以上，而亲本TCCC 31259所表达的蛋白酶K在50-70℃范围内活力保持在60％以上。
最适pH测试：分别将突变体重组TCCC 31259、亲本重组菌TCCC 31261发酵液上清在不同pH值(7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)下，于65℃分别测定其酶活，以所测的不同反应pH值下最高酶活力为100％，突变体TCCC 31261(图3b)和亲本TCCC 31259(图3a)所表达的蛋白酶K最适pH均为9.0，但是突变体TCCC 31261在pH 8.0-10.0范围内相对酶活力能保持在95％左右，较亲本TCCC 31259具有更高的催化活性(在pH 8.0-10.0范围内相对酶活力在90％以上)。
温度稳定性测试：分别将突变体重组TCCC 31259、亲本重组菌TCCC 31261发酵液置于不同温度(45℃、55℃、65℃、70℃)下保温100min，以未经保温处理的活力为100％，计算残余酶活力。突变体TCCC 31261(图4b)在65℃条件下保温100min，其残余酶活力维持在41.27％，较亲本TCCC 31259(图4a)残余酶活力高出7.74％。
pH稳定性测试：分别将突变体重组TCCC 31259、亲本重组菌TCCC 31261发酵液置于不同的pH值(7.0、9.0、11.0)的条件下于室温保存8d，以未经保温处理的活力为100％，计算残余酶活力。突变体TCCC 31261(图5b)在pH9.0的条件下于室温保存8d后，其残余酶活力为65.52％，较亲本TCCC 31259(图5a)残余酶活力高出10.07％。
虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和原理的情况下，可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。

Claims (10)

1.一种蛋白酶K突变体，其特征在于，所述蛋白酶K突变体的氨基酸序列是在亲本蛋白酶K氨基酸序列的基础上第244位的甲硫氨酸替换为苯丙氨酸，所述亲本蛋白酶K氨基酸序列如SEQ ID NO：1、2或3所示。
2.根据权利要求1所述蛋白酶K突变体，其特征在于，所述蛋白酶K突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
3.权利要求1或2所述蛋白酶K突变体的编码基因。
4.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求3所述编码基因。
5.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求3所述编码基因或权利要求4所述重组载体。
6.如权利要求5所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是毕赤酵母细胞。
7.权利要求1或2所述蛋白酶K突变体用于酶解蛋白质的应用，优选的，用于分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和/或肽键。
8.一种制备权利要求1或2所述蛋白酶K突变体的方法，其特征在于，该方法包括：在适宜条件下培养权利要求5所述宿主细胞并使其表达权利要求3所述编码基因，然后从其培养物或表达产物中分离得到蛋白酶K突变体。
9.一种酶解蛋白质的方法，其特征在于，该方法包括使蛋白质与权利要求1或2所述蛋白酶K突变体接触的步骤，在能够通过所述蛋白酶K突变体催化酶解蛋白质的条件下进行。
10.一种提高蛋白酶K酶活力的方法，其特征在于，该方法是通过在亲本蛋白酶K中引入M244F取代，所述亲本蛋白酶K具有如SEQ ID NO：1、2或3所示的氨基酸序列。
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