CN115820694A - 一种新型透明质酸酶编码基因及其高产工程菌、构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型透明质酸酶编码基因hylP，所述基因hylP来源于链霉菌菌株StreptomycesindicusCGMCC4.5727，其基因序列为SEQ ID NO.1，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明新型链霉菌透明质酸酶编码基因hylP，该基因与已知的透明质酸酶基因同源性低(低于50％)，编码的透明质酸酶具有优异的透明质酸(HA)降解功能。

Description

一种新型透明质酸酶编码基因及其高产工程菌、构建方法与 应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是一种新型透明质酸酶编码基因及其高产工程菌、构建方法与应用。

背景技术

透明质酸酶是一类具催化透明质酸(Hualuronic Acid,HA)降解功能的酶。在医药(药物扩散剂)、医疗美容(HA填充物降解)、化妆品(制备小分子量透明质酸)及制革等领域具有广泛的应用。根据来源的不同，透明质酸酶分为哺乳动物透明质酸酶、动物毒液透明质酸酶和微生物透明质酸酶三种类别。其中微生物来源的透明质酸酶不受来源限制，而且微生物已有成熟的异源表达模式，表达的酶提取容易，可高度纯化，因此微生物透明质酸酶，以及使用微生物异源表达来生产透明质酸酶更加具有市场潜力。已发现多种微生物可以产生透明质酸酶，但是目前仍存在酶活性相对较低、产量少、安全性未知、降解产物复杂及不明确等问题，限制了微生物来源透明质酸酶的工业化应用。因此，对于新型高效的微生物透明质酸酶市场仍具有迫切需求。

来源于链霉菌的透明质酸酶与动物来源的透明质酸酶相比具有热稳定性、蛋白酶抗性、pH宽泛性、底物特异性和高活性等特点。与其它细菌来源的透明质酸酶相比，链霉菌透明质酸酶一般以随机的内切作用模式作用于HA并产生不同大小的不饱和HA产物(包括HA二糖、HA四糖和六糖等)，而其他来源的一些透明质酸酶作用于β-1,3糖苷键或者β-1,4糖苷键，降解得到的终产物主要是四糖。

在透明质酸酶重组酶的研究中，酵母菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌都可用于重组透明质酸酶的宿主。并且目前已经实现了水蛭透明质酸酶、人透明质酸酶和链霉菌等透明质酸酶的重组表达。专利公开文献CN102439144B和CN 105473607A中公开了一种来源于链霉菌的透明质酸酶，该透明质酸酶来源于链霉菌koganeiensis(Streptomyceskoganeiensis,ATCC31392)，分子量为21.6kDa，等电点(pI)在4.4-4.8之间，在大肠杆菌中的重组表达达到了87000U/ml。且该透明质酸酶在水溶液中高度稳定，对蛋白水解酶类亦不敏感，HPLC纯度高于98％，这些均为治疗用所必需之特性，因此，该酶可单独使用或与其他活性成分联用，以制备人用或兽用药物组合物，用于降解器官或组织中的透明质酸，以达到治疗某些疾病的需要。相比于迄今为止已知的其他透明质酸酶，来源于链霉菌koganeiensis (Streptomyces koganeiensis,ATCC31392)的透明质酸酶已被证实能够水解存在于间质基质中的透明质酸，增加结缔组织的可渗透性并促进皮下局部给药药物以极度稳定性向周围组织的扩散和分散，而没有被存在于该结缔组织中的蛋白水解酶消化的可能性。

来源于链霉菌koganeiensis(Streptomyces koganeiensis,ATCC31392)的透明质酸酶是唯一商业化的链霉菌透明质酸酶，但是其在链霉菌中表达产量低。koganeiensis链霉菌透明质酸酶尽管已在在大肠杆菌中获得成功的异源表达。但是如下原因仍使得生产成本居高不下：

大肠杆菌双层膜结构使得目标分泌蛋白仍累积在周质空间，分离纯化需要细胞收集、破碎等工序；另外外膜中含有脂多糖LPS内毒素，进一步增加了下游分离提取的成本。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术上存在的问题，提供一种新型透明质酸酶编码基因及其高产工程菌、构建方法与应用。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一种新型透明质酸酶编码基因hylP，所述基因hylP来源于链霉菌菌株Streptomyces indicus CGMCC 4.5727，其基因序列为SEQ ID NO.1，其氨基酸序列为SEQID NO.2。

如上所述的基因hylP编码的透明质酸酶。

进一步地，所述透明质酸酶具有28.25kDa的分子量，属于透明质酸裂解酶类(Hyaluro nate Lyase，EC 4.2.2.1)。

一种高产透明质酸酶的链霉菌工程菌株，所述工程菌株应用了链霉菌高拷贝载体pKC 1139载体，应用了gapdh启动子驱动透明质酸酶编码基因hylP的表达，采用xlnc信号肽控制成熟透明质酸酶的分泌，以及采用变铅青链霉菌(Streptomyces lividans TK24)clpP2基因敲除突变株(S.lividans clpP2KO)作为底盘细胞。

进一步地，所述gapdh启动子来自于迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5；所述xlnc信号肽来自于S.lividans中的木聚糖酶C(xylanase C)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.6。

如上所述的高产透明质酸酶的链霉菌工程菌株的构建方法，包括如下步骤：

a.重组质粒的构建及异源表达；

b.分泌信号肽优化；

c.宿主细胞改造。

进一步地，包括如下步骤：

步骤1，蛋白酶基因clpP2突变株(S.lividans clpP2KO)的构建：该菌株在模式菌株S.lividans TK24中对蛋白质量控制系统clpP2基因进行了敲除而获得；该菌株较野生型TK24菌株相比，胞外蛋白的整体分泌量都有明显提高；

步骤2，构建透明质酸酶高表达质粒：以Streptomyces indicus CGMCC 4.5727基因组为模板，通过PCR反应分别扩增hylP基因及gapdh启动子、xlnc信号肽，通过goldengate连接克隆到pUC质粒载体获得中间质粒pUC57::Pgapdh-SPxlnc-hylP；最后通过限制性内切酶和T4 DNA连接酶将完整的表达元件Pgapdh-SPxlnc-hylP克隆到pKC1139载体，构建成透明质酸酶表达质粒pKC1139::Pgapdh-SPxlnc-hylP；

步骤3，高产透明质酸酶链霉菌工程菌株的获得：将步骤2高表达质粒pKC1139::Pgapdh-SPxlnc-hylP转入至S.lividans clpP2KO菌株，即获得高产透明质酸酶的基因工程菌。

如上所述的链霉菌工程菌株在生产透明质酸酶方面中的应用。

利用如上所述的链霉菌工程菌株发酵生产透明质酸酶的方法，包括如下步骤：

将链霉菌工程菌株接种到种子培养基中，28℃,200rpm发酵培养，种子液发酵48h后，可见菌体浓度较高。以2％的接种量转接发酵培养基中进行发酵4天，取发酵上清液，得到透明质酸酶；

其中，种子培养基TSB的配方为：酪蛋白胨：17g/L，大豆蛋白胨:3g/L,NaCl：5g/L,K2HPO4：2.5g/L，葡萄糖：2.5g/L；

发酵培养基TSB的配方为：酪蛋白胨：17g/L,大豆蛋白胨:3g/L,NaCl：5g/L,K2HPO4:2.5g/L,葡萄糖：2.5g/L。

利用如上所述的链霉菌工程菌株制备不同分子量透明质酸的方法，包括如下步骤：

将链霉菌工程菌株接种到种子培养基中，28℃,200rpm发酵培养，种子液发酵48h后，以2％的接种量转接发酵培养基中进行发酵4天，取发酵上清液进行HA的酶切处理；

稀释发酵液至不同透明质酸酶浓度即酶活力分别为40U/ml、20U/ml、10U/ml、8U/ml、4U/ml，酶切处理条件：每1ml不同浓度的透明质酸酶与10ml 15g/L的透明质酸混合，37℃200rpm摇床处理1h，获得不同分子量的透明质酸；

其中，种子培养基TSB的配方为：酪蛋白胨：17g/L，大豆蛋白胨:3g/L,NaCl：5g/L,K2HPO4：2.5g/L，葡萄糖：2.5g/L；

发酵培养基TSB的配方为：酪蛋白胨：17g/L,大豆蛋白胨:3g/L,NaCl：5g/L,K2HPO4:2.5g/L,葡萄糖：2.5g/L。

本发明取得的有益效果是：

1、本发明新型链霉菌透明质酸酶编码基因hylP，该基因与已知的透明质酸酶基因同源性低(低于50％)，编码的透明质酸酶具有优异的透明质酸(HA)降解功能。

2、本发明经过启动子、信号肽和宿主细胞优化，提供了一株高产透明质酸酶的链霉菌工程菌株Stretomyces lividans S07，该工程菌是在变铅青链霉菌clpP2基因敲除突变株(S.lividans clpP2KO)中转化hylP高表达质粒而来。gapdh启动子(Pgapdh)和xlnc信号肽(SPxlnc)是构建hylP高表达质粒的两个重要功能元件。以工程菌S.lividans S07进行透明质酸酶的发酵生产，过4天的摇瓶发酵，发酵液中透明质酸酶酶活可达到3373U/ml，该发酵过程可以较为容易进行放大生成。

3、本发明菌株发酵生产时透明质酸酶以分泌表达的方式积累在发酵培养基上清液中，生产过程中免除了细胞破碎工艺，方便下游的分离提取过程。相比于以往透明质酸酶在大肠杆菌的重组胞内表达，同时链霉菌作为细胞工厂，避免了细胞破碎流程和内毒素LPS的污染风险，降低了生产成本和提高了产品质量。

4、本发明中利用链霉菌来源的新型透明质酸酶基因，构建了透明质酸酶高效表达的重组质粒，并采用高效分泌表达的工程链霉菌作为底盘细胞，构建了透明质酸酶高产工程菌株。该工程菌株经发酵培养，目标透明质酸酶高效分泌到发酵上清液中(4天发酵液透明质酸酶浓度达3373U/ml)；也避免了LPS内毒素的污染，大大降低了生产成本。

附图说明

图1为本发明中透明质酸酶产生菌的凝胶电泳法筛选图；其中，泳道1：为未经酶切处理的大分子量HA，泳道2：菌株Streptomyces indicus CGMCC 4.5727发酵液对大分子量HA的酶切效果；

图2为本发明中1代透明质酸酶异源表达盒构建示意图；其中，Pgapdh：来自于Eggerthella lenta甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子；Pvsi：来自于S.venezuelae中的蛋白酶抑制剂(subtilisin inhibitor)的启动子；hylP：包含自身信号肽编码区域的完整透明质酸酶基因；

图3为本发明中1代透明质酸酶异源表达菌株的构建与发酵示意图；其中，S01：Streptomyces indicusCGMCC 4.5727；S02：S.lividansTK24；S03：pKC1139::Pgapdh-hylP/S.lividans TK24；S04：pKC1139::Pvsi-hylP/S.lividans TK24；

图4为本发明中2代透明质酸酶异源表达盒构建示意图；其中，Pgapdh：来自于Eggerthella lenta甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子；SPvsi：Sec途径信号肽，来自于S.venezuelae中的蛋白酶抑制剂(subtilisin inhibitor)；SPxlnc：Tat途径信号肽，来自于S.lividans中的木聚糖酶C(XylanaseC)；

图5为本发明中2代透明质酸酶异源表达菌株的构建与发酵验证图；其中，S03：pKC1139::Pgapdh-hylP/S.lividansTK24；S05：pKC1139::Pgapdh-SPvsi-hylP/S.lividansTK24；S06：pKC1139::Pgapdh-SPxlnc-hylP/S.lividans TK24；

图6为本发明中3代透明质酸酶异源表达菌株的构建与发酵验证图；其中，S06：PKC1139::Pgapdh-SPxlnc-hylP/S.lividansTK24；S07：pKC1139::Pgapdh-SPxlnc-hylP/S.lividansclpP2KO；

图7为本发明中不同分子量透明质酸酶的制备结果图；其中，泳道1为未经酶切处理的大分子HA；泳道2-6分别为经不同透明质酸酶浓度(酶活力分别为40U/ml,20U/ml,10U/ml,8U/ml,4U/ml)酶切后的HA。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。

一种新型透明质酸酶编码基因hylP，所述基因hylP来源于链霉菌菌株Streptomyces indicus CGMCC 4.5727，其基因序列为SEQ ID NO.1，其氨基酸序列为SEQID NO.2。

如上所述的基因hylP编码的透明质酸酶。

较优地，所述透明质酸酶具有28.25kDa的分子量，属于透明质酸裂解酶类(Hyalurona te Lyase，EC 4.2.2.1)。

一种高产透明质酸酶的链霉菌工程菌株，所述工程菌株应用了链霉菌高拷贝载体pKC 1139载体，应用了gapdh启动子驱动透明质酸酶编码基因hylP的表达，采用xlnc信号肽控制成熟透明质酸酶的分泌，以及采用变铅青链霉菌(Streptomyces lividans TK24)clpP2基因敲除突变株(S.lividans clpP2KO)作为底盘细胞。

较优地，所述gapdh启动子来自于迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5；所述xlnc信号肽来自于S.lividans中的木聚糖酶C(xylanase C)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.6。

如上所述的高产透明质酸酶的链霉菌工程菌株的构建方法，包括如下步骤：

a.重组质粒的构建及异源表达；

b.分泌信号肽优化；

c.宿主细胞改造。

较优地，包括如下步骤：

步骤1，蛋白酶基因clpP2突变株(S.lividans clpP2KO)的构建：该菌株在模式菌株S.lividans TK24中对蛋白质量控制系统clpP2基因进行了敲除而获得；该菌株较野生型TK24菌株相比，胞外蛋白的整体分泌量都有明显提高；

步骤2，构建透明质酸酶高表达质粒：以Streptomyces indicus CGMCC 4.5727基因组为模板，通过PCR反应分别扩增hylP基因及gapdh启动子、xlnc信号肽，通过goldengate连接克隆到pUC质粒载体获得中间质粒pUC57::Pgapdh-SPxlnc-hylP；最后通过限制性内切酶和T4 DNA连接酶将完整的表达元件Pgapdh-SPxlnc-hylP克隆到pKC1139载体，构建成透明质酸酶表达质粒pKC1139::Pgapdh-SPxlnc-hylP；

步骤3，高产透明质酸酶链霉菌工程菌株的获得：将步骤2高表达质粒pKC1139::Pgapdh-SPxlnc-hylP转入至S.lividans clpP2KO菌株，即获得高产透明质酸酶的基因工程菌。

如上所述的链霉菌工程菌株在生产透明质酸酶方面中的应用。

利用如上所述的链霉菌工程菌株发酵生产透明质酸酶的方法，包括如下步骤：

将链霉菌工程菌株接种到种子培养基中，28℃,200rpm发酵培养，种子液发酵48h后，可见菌体浓度较高。以2％的接种量转接发酵培养基中进行发酵4天，取发酵上清液，得到透明质酸酶；

其中，种子培养基TSB的配方为：酪蛋白胨：17g/L，大豆蛋白胨:3g/L,NaCl：5g/L,K2HPO4：2.5g/L，葡萄糖：2.5g/L；

发酵培养基TSB的配方为：酪蛋白胨：17g/L,大豆蛋白胨:3g/L,NaCl：5g/L,K2HPO4:2.5g/L,葡萄糖：2.5g/L。

利用如上所述的链霉菌工程菌株制备不同分子量透明质酸的方法，包括如下步骤：

将链霉菌工程菌株接种到种子培养基中，28℃,200rpm发酵培养，种子液发酵48h后，以2％的接种量转接发酵培养基中进行发酵4天，取发酵上清液进行HA的酶切处理；

稀释发酵液至不同透明质酸酶浓度即酶活力分别为40U/ml、20U/ml、10U/ml、8U/ml、4U/ml，酶切处理条件：每1ml不同浓度的透明质酸酶与10ml15g/L的透明质酸混合，37℃200rpm摇床处理1h，获得不同分子量的透明质酸；

其中，种子培养基TSB的配方为：酪蛋白胨：17g/L，大豆蛋白胨:3g/L,NaCl：5g/L,K2HPO4：2.5g/L，葡萄糖：2.5g/L；

发酵培养基TSB的配方为：酪蛋白胨：17g/L,大豆蛋白胨:3g/L,NaCl：5g/L,K2HPO4:2.5g/L,葡萄糖：2.5g/L。

具体地，相关的制备及检测如下：

实施例1：透明质酸酶生产菌株的获得

将来源于链霉菌koganeiensis(Streptomyces koganeiensis,ATCC31392)的透明质酸酶(AKQ62598)与Genbank数据库其他链霉菌基因组编码序列进行比对，发现链霉菌菌株Streptomyces indicus CGMCC 4.5727的基因hylP与其具有43.71％的序列相似性，推测该基因编码蛋白可能具有透明质酸酶活性。对链霉菌菌株Streptomyces indicus CGMCC4.5727进行发酵，检测其发酵液是否具有透明质酸酶活性，发酵条件如下：

所用种子培养基(TSB)：酪蛋白胨：17g/L，大豆蛋白胨:3g/L,NaCl：5g/L，K2HPO4：2.5g/L，葡萄糖：2.5g/L。种子液发酵条件：28℃，200r。种子液发酵48h后以2％的接种量转接发酵培养基(TSB)：酪蛋白胨：17g/L，大豆蛋白胨:3g/L,NaCl：5g/L，K2HPO4：2.5g/L，葡萄糖：2.5g/L。发酵72h。

发酵液中透明质酸酶酶活力的测定：取发酵液与底物HA进行温育，反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测HA的降解情况。酶切处理条件：取Streptomyces indicus CGMCC4.5727菌株发酵液100μl分别与100μl 15g/L的HA混合,37℃,200rpm处理30min，对照为100ul TSB培养基与100ul 15g/L的HA混合,37℃,200r摇床处理30min。

琼脂糖凝胶的制备及电泳：(1)准确称量0.5g琼脂糖于烧杯中，向其中加入90mL蒸馏水，加热融化。(2)量取10mL 10×TAE buffer以及上一步的烧杯放入48℃的水浴锅中，水浴加热15min后将10×TAE buffer倒入烧杯中并充分震荡混匀。(3)将已经溶好的胶液倒入事先摆好梳子的胶槽中，厚度约为3mm，待其凝固1h后，轻轻地向其表面倒入50mL 1×TAEbuffer(并用塑料膜包裹)过夜后使用。(4)向电泳槽内加入适量新鲜的1×TAE buffer，然后将制好的胶放入电泳槽中，保证电泳液完全浸泡胶面且高于2mm(整个电泳过程中应不断倾倒电泳液，保证其高度)。(5)向每个孔内分别加入待测样品14μg。(6)点样完成之后，沉降5～10min，待观察孔中样品都沉降于孔底时，开启电泳仪，电压40v，35mA，电泳1h；然后调节电泳仪65v，80mA，电泳大约2-3h，待示踪剂的蓝色条带跑到大板胶的中下层后，停止电泳。(7)带手套取出电泳完毕的胶版(在蒸馏水中轻轻将胶取出)，用蒸馏水清洗多次。(8)将胶放入已配置完成的50mL 0.005％的Stains-All染液中，在避光环境中轻轻震荡，染色12h。将胶放入清水中褪色48h(避光环境，多次换水)。(10)从避光环境中取出胶块，于自然光下褪色3h左右(待颜色褪掉，出现明显条带后停止褪色)。(11)在合适的光线下照胶记录实验结果。

检测结果表明，在Streptomyces indicus CGMCC 4.5727(S01)菌株发酵液的作用下，底物HA被降解成更小的HA分子。菌株Streptomyces indicus CGMCC 4.5727发酵液具有透明质酸酶活性(图1)。

Streptomyces indicus CGMCC 4.5727基因组上潜在的透明质酸酶编码基因hylP，其基因序列为SEQ ID NO.1，编码的蛋白质序列为SEQ ID NO.2。在线分析软件signalIP-5.0(SignalP-5.0-Services-DTU Health Tech)分析结果表明，该蛋白为分泌蛋白，具有Tat类型的信号肽，其信号肽序列为：SEQ ID NO.3；推测分泌的成熟蛋白序列为:SEQ ID NO.4。

实施例2重组质粒的构建与异源表达

2.1重组质粒的构建：

分别采用来源于迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(gapdh)的启动子(Pgapdh，SEQ ID NO.5)和来源于委内瑞拉链霉菌的枯草杆菌蛋白酶抑制剂编码基因(S.venezuelae subtilisin inhibitor)的启动子(Pvsi，SEQ ID NO.7)来驱动完整动透明质酸酶基因(hylP)，构建获得两个表达盒(Pgapdh-hylP和Pvsi-hylP，图2)。并分别克隆到链霉菌质粒pKC1139上，分别获得表达质粒pKC1139::Pgapdh-hylP和pKC1139::Pvsi-hylP。

构建过程如下：

pKC1139::Pgapdh-hylP构建过程如下：

委托基因合成公司合成gapdh启动子(Pgapdh)，并以质粒pUC57::Pgapdh(SEQ IDNO.9)形式提供。以质粒pUC57::Pgapdh为模板，采用Primer-gaF/Primer-gaR引物对进行PCR扩增，50μL PCR反应体系含有如下组分：10μL 5×PS Buffer,4μL dNTP(2mM),2μLPrimer-gaF(10μM),2uL Primer-gaR(10μM),0.5μL pUC57::Pgapdh(10ng/μl),0.5μLPrimer STAR DNA聚合酶(Takara，R010A),31μL去离子水。PCR反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s,68℃延伸5min,反应30个循环；68℃10min。PCR扩增产物经纯化回收后获得线性片段pUC57-Pgapdh。同时，以链霉菌Streptomyces indicus CGMCC 4.5727基因组为模板，利用引物对(Primer-hylF/Primer-hylR)进行PCR扩增，50μL PCR反应体系含有如下组分：10μL 5×PS Buffer,4μL dNTP(2mM),2μL Primer-hylR(10μM),2μL Primer-hylF(10μM),0.5μL pUC57::Pgapdh(10ng/μl),0.5μL Primer STAR DNA聚合酶(Takara，R010A),31μL去离子水。PCR反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，68℃延伸2min,反应30个循环；68℃10min。PCR扩增产物经纯化回收后获得包含完整透明质酸酶基因的DNA片段hylP。将PCR扩增产物pUC57::Pgapdh与hylP在如下体系中进行连接(Golden GateCloning)：1.5μL 10×T4 DNA ligase buffer(NEB)，1μL 0.1％BSA(NEB),1μL BsaI(NEB),1μL T4 DNA ligase(NEB),1μL PCR扩增产物pUC57-Pgapdh(100ng/μL),1μL PCR扩增产物hylP,8.5μL ddH2O。在PCR仪中执行如下循环：37℃3min，16℃4min，共进行25个循环，最后80℃反应5min。将连接产物转化E.coli JM09感受态细胞(Sambrook J.et al.Molecularcloning,Laboratory manuals.2001)，转化子在含有氨苄青霉素(Amp 100μg/mL)的LB培养基上进行筛选。获得中间质粒pUC57::Pgapdh-hylP.

采用HindIII和BamHI双酶切质粒pUC57::Pgapdh-hylP。酶切反应体系为：2μL 10×Quick Cut Green Buffer，1μL Quick Cut HindIII，1μL Quick Cut BamHI,4μL质粒,12μL ddH2O。反应条件为：37℃水浴30min，反应产物经琼脂糖凝胶回收，获得含有Pgapd h-hylP表达盒的DNA片段。

采用HindIII和BamHI双酶切链霉菌质粒pKC1139(Bierman M.Plasmid cloningvectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli toStreptomyces spp.[J].Gene,1992,116(1):43-49.)，酶切反应体系和反应条件同上，反应产物经琼脂糖凝胶回收，获得线性化的pKC1139。

在如下体系中进行T4 DNA连接酶连接，连接反应体系为：0.5μL T4 DNA Ligase,2μL 5×T4 DNA Ligase Buffer,2.5μL Pgapdh-hylP片段，5μL线性化载体pKC1139。连接反应条件为：25℃反应15min。将连接产物转化E.coli JM09感受态细胞，转化子在含有安普霉素(Apr 100μg/mL)的LB培养基上进行筛选。培养转化子并提取质粒，经酶切验证，构建成功的重组质粒命名为pKC1139::Pgapdh-hylP。

pKC1139::Pvsi-hylP的构建:

pKC1139::Pvsi-hylP质粒的构建与pKC1139::Pgapdh-hylP质粒类似，不同的是利用Primer-vsiF/Primer-vsiR扩增pUC57-Pvsi DNA片段,模板为pUC57::Pvsi(SEQ IDNO.10),该质粒委托公司合成。

2.21代透质酸酶异源表达工程菌的构建：

将重组质粒pKC1139::Pgapdh-hylP和Pkc1139::Pvsi-hylP通过结合转移的方式分别转化入Streptomyces lividans TK24，具体步骤如下：

将重组质粒pKC1139::Pgapdh-hylP转化大肠杆菌ET12567/PUZ8002感受态细胞，涂布LB加硫酸卡那霉素(kana 100ug/ml),氯霉素(cm 25ug/ml),Apr 100ug/ml的板子，37℃恒温培养箱过夜培养，约12h后可见转化子。②待长出单菌落以后，第二天挑取单菌落接种到4ml LB加kana(100ug/ml),cm(25ug/ml),Apr(100ug/ml)的试管中，37℃200r摇床过夜培养作为种子液。③第二天按照1％的接种量，将过夜培养的种子液接种至装有10ml LB液体的锥形瓶中，加入抗性Apr(50ug/ml)，kana(50ug/ml),37℃培养至OD600＝0.4-0.6,这个过程大概需要2-3h。④待大肠杆菌OD600nm达到0.4-0.6时，取出1ml大肠杆菌菌液，8000rpm离心1min，去除上清，然后用等体积的新鲜的LB培养基洗菌体3次，弃掉上清，菌体备用。⑤固体MS板培养7天以上的孢子，用棉签沾取2xYT培养基轻轻洗掉四分之一的孢子于500ul2xYT培养基中。如果是保存于-20℃的孢子，需要先8000rpm离心1min，弃去甘油后用适量的2xYT重悬。金属浴50℃热激10min，降至室温待用。⑥取100ul孢子液加到装有处理好的大肠杆菌的EP管中，将两种菌体充分混匀后，涂布MS+10mM MgCl2的板子，28℃恒温培养箱培养18h后，在固体平板表面喷淋相应的抗生素600ul无菌水+10ulNaL(25mg/ml)+10ulApr(100mg/ml)，之后继续培养4-5天等待转化子长出。⑦待转化子长出以后，先将转化子接到含有质粒抗性的MS板子(终浓度40ug/ml)上做抗性验证，抗性正确的转化子进行进一步的分子验证。

将包含有pKC1139::Pgapdh-hylP/TK24的工程菌株(pKC1139::Pgapdh-hylP/TK24)命名为S.lividans S03。

同样的方法，将重组质粒pKC139::Pvsi-hylP通过结合转移的方式分别转化入Streptom yces lividans TK24(Genbank ACCESSION CP009124)，获得工程菌株(pKC1139::Pgapdh-hylP/TK24)命名为S.lividans S04

2.3异源表达菌株的发酵及酶活测定：将重组菌株S.lividans S03，S.lividansS04，野生型菌株Streptomyces indicus CGMCC 4.5727,进行摇瓶发酵,宿主菌S.lividansTK24在相同条件下进行发酵作为阴性对照。发酵条件如下：所用种子培养基(TSB)：酪蛋白胨：17g/L，大豆蛋白胨:3g/L,NaCl：5g/L，K2HPO4：2.5g/L，葡萄糖：2.5g/L。种子液发酵条件：28℃，200rpm。发酵48h后以2％的接种量转接发酵培养基(TSB)：酪蛋白胨：17g/L，大豆蛋白胨:3g/L,NaCl：5g/L，K2HPO4：2.5g/L，葡萄糖：2.5g/L。分别于48h、72h、96h、120h取样检测透明质酸酶活性。

检测方法如下：

标曲绘制：用TSB培养基配置透明质酸酶标品浓度范围为0U/ml-30U/ml。测定吸光度用酶标仪，在96孔板中，反应体积(20ul试剂2+30ul标品+100ulCTAB试剂)，测OD400nm的吸光度值。利用△OD(TSB OD400-标品OD400)作为横坐标，透明质酸酶浓度作为纵坐标，绘制标椎曲线。标准曲线代表底物的消耗量和OD400的对应关系。

样品酶活测定：96孔板中，30ul发酵液+20ul底物混匀，37℃反应15min.之后加入100ulCTAB终止反应，检测OD400nm的吸光度值。阴性对照为TK24野生型菌株发酵液。计算△OD400带入标曲中再乘以发酵液的稀释倍数即为最终酶活力。

其中溶液的配制方法如下：

试剂1：乙酸缓冲液：配置0.2M NaAC(pH6.0)采用乙酸调pH，并用该缓冲液配置0.15MNaCl溶液。

试剂2：HA溶液，50mg/100ml，采用乙酸缓冲液配置。

试剂3：CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide)2.5g/100ml,采用2％的NaOH配置。

结果如图3所示，宿主菌S.lividans TK24在整个发酵过程检测不到透明质酸酶的产生，两株重组菌株S03和S04的透明质酸酶产量显著高于原始菌株Streptomyces indicusCGMCC 4.5727(S01)，在第三天时上清液产量分别达到1246U/ml和2330U/ml。相比采用Pvsi启动子，采用启动子Pgapdh驱动hylP的表达获得较好的表达效果。

实施例3：分泌信号肽优化与透明质酸酶发酵

3.1采用来源于迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(gapdh)的启动子(Pgapdh，SEQ ID NO.5)来驱动完整动透明质酸酶基因(hylP)，分别采用来源于S.venezuelae中的蛋白酶抑制剂(subtilisin inhibitor)的信号肽(SPvsi,SEQ IDNO.8)和来源于S.lividans中的木聚糖酶C(xylanase C)的信号肽(SPxlnc,SEQ ID NO.6)来控制成熟蛋白的分泌，构建获得两个表达盒(Pgapdh-Spvsi-hylP和Pgapdh-SPxlnc-hylP，图4)。并分别克隆到链霉菌质粒pKC1139上，分别获得表达质粒pKC1139::Pgapdh-SPvsi-hylP和pKC1139::Pgapdh-SPxlnc-hylP。

具体构建过程如下：

pKC1139::Pgapdh-SPvsi-hylP构建过程如下：

委托基因合成公司合成vsi信号肽(SPvsi)，并以质粒pUC57::SPvsi(SEQ IDNO.11)形式提供。以质粒pUC57::SPvsi为模板，采用Primer-SPvsiF/Primer-SPvsiR引物对进行PCR扩增，50μL PCR反应体系含有如下组分：10μL 5×PS Buffer,4μL dNTP(2mM),2μLPrimer-SPvsiF(10μM),2uL Primer-SPvsiR(10μM),0.5μL pUC57::SPvsi(10ng/μl),0.5μLPrimer STAR DNA聚合酶(Takara，R010A),31μL去离子水。PCR反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s,68℃延伸30s,反应30个循环；68℃10min。PCR扩增产物经纯化回收后获得线性片段SPvsi。

同时，以实施例2所述pUC57::Pgapdh-hylP为模板，利用引物对Primer-pUCgaF/Primer-pUCgaR进行PCR扩增，50μL PCR反应体系含有如下组分：10μL 5×PS Buffer,4μLdNTP(2mM),2μL Primer-pUCgaF(10μM),2uL Primer-pUCgaR(10μM),0.5μL pUC57::Pgapdh-hylP(10ng/μl),0.5μL Primer STAR DNA聚合酶(Takara，R010A),31μL去离子水。PCR反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s,68℃延伸4min,反应30个循环；68℃10min。PCR扩增产物经纯化回收后获得包含gapdh启动子和信号肽缺失的透明质酸酶基因的DNA片段pUC57-Pgapdh-hylP。将PCR扩增产物SPvsi与pUC57-Pgapdh-hylP在如下体系中进行连接((Golden Gate Cloning)：1.5μL 10×T4 DNA ligase buffer(NEB),1μL 0.1％BSA(NEB),1μL BsaI(NEB),1μL T4 DNA ligase(NEB),1μL PCR扩增产物pUC57-Pgapdh-hylP(100ng/μL),1μL PCR扩增产物SPvsi,8.5μL ddH2O。在PCR仪中执行如下循环：37℃3min，16℃4min，共进行25个循环，最后80℃反应5min。将连接产物转化E.coli JM09感受态细胞，转化子在含有Amp(100μg/mL)的LB培养基上进行筛选。获得中间质粒pUC57::Pgapdh-Spvsi-hylP。

采用HindIII和BamHI双酶切质粒pUC57::Pgapdh-SPvsi-hylP.。酶切反应体系为：2μL 10×Quick Cut Green Buffer，1μL Quick Cut HindIII，1μL Quick Cut BamHI，4μL质粒,12μL ddH2O。反应条件为：37℃水浴30min，反应产物经琼脂糖凝胶回收，获得含有Pgapdh-Spvsi-hylP表达盒的DNA片段。

采用HindIII和BamHI双酶切链霉菌质粒pKC1139，酶切反应体系和反应条件同上，反应产物经琼脂糖凝胶回收，获得线性化的pKC1139。

在如下体系中进行T4 DNA连接酶连接，连接反应体系为：0.5μL T4 DNA Ligase,2μL 5×T4 DNA Ligase Buffer,2.5μL Pgapdh-Spvsi-hylP片段，5μL线性化载体pKC1139。连接反应条件为：25℃反应15min。将连接产物转化E.coli JM09感受态细胞，转化子在含有Apr(100μg/mL)的LB培养基上进行筛选。培养转化子并提取质粒，经酶切验证,构建成功的重组质粒命名为pKC1139::Pgapdh-Spvsi-hylP。

pKC1139::Pgapdh-Spxlnc-hylP质粒的构建与pKC1139::Pgapdh-Spvsi-hylP质粒类似，不同的是利用Primer-SPxlncF/Primer-SPxlncR扩增SPxlncDNA片段,模板为pUC57::SPxlnc(SEQ ID NO.12),该质粒委托公司合成。

3.22代透明质酸酶异源表达工程菌的构建：

将重组质粒pKC1139::Pgapdh-SPvsi-hylP和pKC1139::Pgapdh-SPxlnc-hylP通过结合转移的方式分别转化入Streptomyces lividans TK24，具体步骤同实施例2中结合转移步骤，获得工程菌株(pKC1139::Pgapdh-Spvsi-hylP/TK24和pKC1139::Pgapdh-SPxlnc-hylP/TK24)命名为S.lividans S05和S.lividans S06。

3.3异源表达菌株的发酵及酶活测定：

将重组菌株S.lividans S05，S.lividans S06进行摇瓶发酵，S02作为对照菌株，发酵条件同实施例2。分别于48h、72h、96h、120h取样检测透明质酸酶活性。酶活检测方法同实施例2。结果如图5所示，相比于菌株S05(pKC1139::Pgapdh-Spvsi-hylP/TK2)和菌株S03(pKC1139::Pgapdh-hylP/TK24),菌株S06(pKC1139::Pgapdh-SPxlnc-hylP/TK24)胞外产生透明质酸酶的能力最强。因此，我们选择Pgapdh启动子和SPxlnc信号肽用于下一步构建高产透明质酸酶工程菌株。

实施例4：宿主细胞改造与透明质酸酶发酵

在S.lividans TK24中，采用基因组编辑系统蛋白质量控制系统clpP2基因内部同框引入终止密码子，获得clpP2基因敲除突变株(S.lividans clpP2KO)。本实验室前期实验表明，该菌株较野生型菌株S.lividans TK24相比，具有更强的胞外蛋白分泌能力。

4.1菌株S.lividans clpP2KO具体构建过程如下：

1.sgRNA设计合成

利用网站(https://crispy.secondarymetabolites.org)设计特异性的clpP2-sgRNA，并委托公司合成,加ddH2O稀释到10uM。

2.CRISPR质粒的构建

采用NcoI单酶切质粒pCRISPR-cBEST(Tong Y,Whitford C M,Blin K,etal.CRISPR–Cas9,CRISPRi and CRISPR-BEST-mediated genetic manipulation instreptomyc etes[J].Nature Protocols,2020:1-33.)。酶切反应体系为：2μL 10×QuickCut Green Buf fer，1μL Quick Cut HindIII，1μL Quick Cut BamHI,4μL质粒,12μLddH2O。反应条件为：37℃水浴30min，反应产物经琼脂糖凝胶回收，获得含有线性pCRISPR-CBEST的DNA片段。在如下体系进行一步克隆连接：clpP2-sgRNA(10uM)片段稀释100倍后加1.5ul,4ul线性pCRISPR-cBEST载体(240ng),2ul ExnaseII,4ul 5x ExnaseII buffer,8.5ul dd H2O。反应条件为：37℃水浴30min。将连接产物转化E.coli JM09感受态细胞，转化子在含有Apr(100μg/mL)的LB培养基上进行筛选。培养转化子并提取质粒，经公司测序验证,成功插入20bp sgRNA的质粒为目的质粒，命名为pCRISPR-cBEST-clpP2。

3.构建正确的CRISPR质粒与S.lividans TK24的结合转移

结合转移的步骤同实施例2中结合转移步骤。

4.验证发生正确编辑的目标链霉菌

提取转化子基因组，采用引物clpP2IF/clpP2IR扩增目标片段，扩增产物。50μLPCR反应体系含有如下组分：10μL 5×PS Buffer,4μL dNTP(2mM),Primer-clp P2IR(10μM),2uL Primer-clpP2IF(10μM),0.5μL转化子基因组,0.5μL Primer STAR DNA聚合酶(Takara，R010A),31μL去离子水。PCR反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s,68℃延伸45s,反应30个循环；68℃10min。扩增产物取2ul进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带单一且清晰的条件下送公司测序，测序引物Primer-clpP2IF，挑选基因组上发生正确编辑的转化子，即为目的菌株：pCRISPR-cBEST-clpP2/S.lividans clpP2KO菌株。

5.从正确编辑的链霉菌中去除pCRISPR-cBEST-clpP2质粒

验证正确的pCRISPR-cBEST-clpP2/S.lividans clpP2KO菌株在MS平板上培养7天的孢子进行稀释涂布，具体过程如下：用棉签轻轻沾取链霉菌孢子于1ml无菌水中作为孢子母液。然后用无菌水依次进行梯度稀释：取100ul母液加入到900ul无菌水作为10^-1梯度，以此类推，将母液进行10^-6稀释，取100ul10^-6稀释液涂布到MS板子，37℃培养3天挑选转化子进行安普霉素敏感验证，安普霉素敏感菌株即为最终S.lividans clpP2KO菌株。

4.2经信号肽优化的pKC1139::Pgapdh-SPxlnc-hylP质粒转化S.lividansclpP2KO菌株，分子验证正确的菌株命名为S.lividans S07。

4.3宿主细胞改造菌株的发酵及酶活测定：将重组菌株S.lividans S07，S.lividans S06作为对照菌株，发酵条件同实施例2。分别于48h、72h、96h、120h、144h取样检测透明质酸酶活性。酶活检测方法同实施例2。

结果如图6所示，宿主细胞改造菌株S07较S06相比透明质酸酶获得了较好的分泌表达效果，发酵4天酶活可达3373U/ml。

表1.所用引物序列

实施例5：不同分子量HA的制备(HA的酶切处理及琼脂糖凝胶)

将透明质酸酶高产菌株S07进行摇瓶发酵。所用种子培养基和发酵培养基同实施例1。取96h发酵上清液(透明质酸酶浓度为3373U/ml)用于高分子量HA的酶切处理。采用TSB培养基稀释发酵液至不同透明质酸酶浓度(酶活力浓度分别为40U/ml,20U/ml,10U/ml,8U/ml,4U/ml)，酶切处理条件：1ml不同浓度的透明质酸酶与10ml 15g/L的HA混合，37℃,200rpm床处理1h。之后每个样品取14ul进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切产物大小。

如图7所示，在不同酶活力透明质酸酶的作用下，大分子的HA得到了不同程度的降解，被分解成了不同分子量的HA。

本发明中使用的序列如下：

SEQ ID NO.1：透明质酸酶编码基因hylP序列(909bp)

ATGACTTCAAGAAGGCTGTTCCTGGGTGCGTTCACGGCGGGGGCTGTGACCGTGGCTGCGGGGGCGAGTGAGGCGGCCGCAGCCGAGGCGGAGGGCGTCGTCGAAGGGGACACGACGTTCACCGGGGCGGTGAAGGCCACCTCGTTCCACACGGATTCGGCTGCGATGTCGTCGTTCGCCGGCACCGCGGCTACCGCGCACACGCACACGCTGACGGTGCGGCAGGCGGGGACCGTCGTCGACAGCGTGGCGCTGAACGTCACGTCGACGAACCCGAACGATTCCGCGATGTGGGTGTCCGGCAAGGAGAAGGCGCGCGGCACTCTCAAGGTCACGCACCAGGGTTACGCGGACGGGTCGGACTACGAAGCCGCGGCGATCTCCATCTGGTTGTCGACCGCGGACGGCGTGGAAGGAACGCGGGCCCAGGGCATCTTCATGCGGCCCGCGCCCGGGAACGGACCGACCAAGGGCAACCTCATCACCTTGCGCAACAACGAGGACAAGGTGGACGACTTCGTCGTGAAGGCCAACGGCCGAGTCGGCCTCGGTCTGCCGTACGGGATGAACCCCCGTGCTCGGATCGAGATCGCCCAGCGCCCGGGTGACACGATGGGCCTGATGCTGCAGGCCAACCCTGAGAGCACCGCCCACCTCGCCGACTTCCGCAACAGCCAGGACGTCTCGCAGACCCGAGTCCTCAACGACGGAACGCTTGCCTCGCGCAACGTGTACCTCGGTGGCAGCGGATCGCCGCAGTTCGGCGGAGGTGACGCGGTCGTCGGCATCCGCAACCGCGCGCTCAAGCCCACCACGAACCCCGCCAACGGCGGCGTCCTCTACGCGGAGAACGGGGCTCTCGTGTGGCACGGCTCCAACGGCACAGTCACCACCATCGCCCCGGCCTGA

SEQ ID NO.2 新型透明质酸酶的氨基酸序列(302AA)

MTSRRLFLGAFTAGAVTVAAGASEAAAAEAEGVVEGDTTFTGAVKATSFHTDSAAMSSFAGTAATAHTHTLTVRQAGTVVDSVALNVTSTNPNDSAMWVSGKEKARGTLKVTHQGYADGSDYEAAAISIWLSTADGVEGTRAQGIFMRPAPGNGPTKGNLITLRNNEDKVDDFVVKANGRVGLGLPYGMNPRARIEIAQRPGDTMGLMLQANPESTAHLADFRNSQDVSQTRVLNDGTLASRNVYLGGSGSPQFGGGDAVVGIRNRALKPTTNPANGGVLYAENGALVWHGSNGTVTTIAPA*

SEQ ID NO.3 新型透明质酸酶信号肽的氨基酸序列(29AA)

MTSRRLFLGAFTAGAVTVAAGASEAAAAE

SEQ ID NO.4 新型透明质酸酶成熟蛋白的氨基酸序列(273AA)

AEGVVEGDTTFTGAVKATSFHTDSAAMSSFAGTAATAHTHTLTVRQAGTVVDSVALNVTSTNPNDSAMWVSGKEKARGTLKVTHQGYADGSDYEAAAISIWLSTADGVEGTRAQGIFMRPAPGNGPTKGNLITLRNNEDKVDDFVVKANGRVGLGLPYGMNPRARIEIAQRPGDTMGLMLQANPESTAHLADFRNSQDVSQTRVLNDGTLASRNVYLGGSGSPQFGGGDAVVGIRNRALKPTTNPANGGVLYAENGALVWHGSNGTVTTIAPA*

SEQ ID NO.5 gapdh启动子核苷酸序列(285bp)

GCTGCTCCTTCGGTCGGACGTGCGTCTACGGGCACCTTACCGCAGCCGTCGGCTGTGCGACACGGACGGATCGGGCGAACTGGCCGATGCTGGGAGAAGCGCGCTGCTGTACGGCGCGCACCGGGTGCGGAGCCCCTCGGCGAGCGGTGTGAAACTTCTGTGAATGGCCTGTTCGGTTGCTTTTTTTATACGGCTGCCAGATAAGGCTTGCAGCATCTGGGCGGCTACCGCTATGATCGGGGCGTTCCTGCAATTCTTAGTGCGAGTATCTGAAAGGGGATACGC

SEQ ID NO.6 xlnc信号肽核苷酸序列(147bp)

ATGCAGCAGGACGGCACACAGCAGGACCGGATCAAGCAGAGTCCCGCCCCTCTCAACGGAATGAGCCGACGAGGCTTCCTCGGTGGCGCCGGCACCCTCGCGCTCGCTACCGCGTCCGGGCTGCTGCTGCCCGGCACAGCCCACGCC

SEQ ID NO.7 vsi启动子核苷酸序列(130bp)

AACGAGCGTGCGGTCACCGCTCACCGGAACGCCACATCCGGAAATCGACCATCCGGATGGCACTCACTCTCCGCACCGGCAAGACTCCTCACCGCAGTCACCAACCGCATCGATCGAAGGAGAGTTCACC

SEQ ID NO.8 vsi信号肽核苷酸序列(84bp)

ATGCGTCGCACCCTCAAGGCCGTGGGAGCAGCCGCGGCGGCGGCCACCTGCGTCCTCGCCGCGACGGCAGGCACCGCGCAGGCC

SEQ ID NO.9 pUC57::Pgapdh核苷酸序列(3002bp)

GCGTATCCCCTTTCAGATACTCGCACTAAGAATTGCAGGAACGCCCCGATCATAGCGGTAGCCGCCCAGATGCTGCAAGCCTTATCTGGCAGCCGTATAAAAAAAGCAACCGAACAGGCCATTCACAGAAGTTTCACACCGCTCGCCGAGGGGCTCCGCACCCGGTGCGCGCCGTACAGCAGCGCGCTTCTCCCAGCATCGGCCAGTTCGCCCGATCCGTCCGTGTCGCACAGCCGACGGCTGCGGTAAGGTGCCCGTAGACGCACGTCCGACCGAAGGAGCAGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGATCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGTCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGA

SEQ ID NO.10 pUC57::Pvsi核苷酸序列(2847bp)

AACGAGCGTGCGGTCACCGCTCACCGGAACGCCACATCCGGAAATCGACCATCCGGATGGCACTCACTCTCCGCACCGGCAAGACTCCTCACCGCAGTCACCAACCGCATCGATCGAAGGAGAGTTCACCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGATCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGTCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGA

SEQ ID NO.11 pUC57::SPvsi核苷酸序列(2801bp)

ATGCGTCGCACCCTCAAGGCCGTGGGAGCAGCCGCGGCGGCGGCCACCTGCGTCCTCGCCGCGACGGCAGGCACCGCGCAGGCCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGATCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGTCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGA

SEQ ID NO.12 pUC57::SPxlnc核苷酸序列(2864bp)

ATGCAGCAGGACGGCACACAGCAGGACCGGATCAAGCAGAGTCCCGCCCCTCTCAACGGAATGAGCCGACGAGGCTTCCTCGGTGGCGCCGGCACCCTCGCGCTCGCTACCGCGTCCGGGCTGCTGCTGCCCGGCACAGCCCACGCCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGATCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGTCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGA

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (10)

1.一种新型透明质酸酶编码基因hylP，其特征在于：所述基因hylP来源于链霉菌菌株Streptomyces indicus CGMCC 4.5727，其基因序列为SEQ ID NO.1，其氨基酸序列为SEQID NO.2。

2.如权利要求1所述的基因hylP编码的透明质酸酶。

3.根据权利要求2所述的透明质酸酶，其特征在于：所述透明质酸酶具有28.25kDa的分子量，属于透明质酸裂解酶类(Hyaluronate Lyase，EC 4.2.2.1)。

4.一种高产透明质酸酶的链霉菌工程菌株，其特征在于：所述工程菌株应用了链霉菌高拷贝载体pKC1139载体，应用了gapdh启动子驱动透明质酸酶编码基因hylP的表达，采用xlnc信号肽控制成熟透明质酸酶的分泌，以及采用变铅青链霉菌(Streptomyces lividansTK24)clpP2基因敲除突变株(S.lividans clpP2KO)作为底盘细胞。

5.根据权利要求4所述的高产透明质酸酶的链霉菌工程菌株，其特征在于：所述gapdh启动子来自于迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5；所述xlnc信号肽来自于S.lividans中的木聚糖酶C(xylanase C)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.6。

6.如权利要求4或5所述的高产透明质酸酶的链霉菌工程菌株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

a.重组质粒的构建及异源表达；

b.分泌信号肽优化；

c.宿主细胞改造。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤1，蛋白酶基因clpP2突变株(S.lividans clpP2KO)的构建：该菌株在模式菌株S.lividans TK24中对蛋白质量控制系统clpP2基因进行了敲除而获得；

步骤2，构建透明质酸酶高表达质粒：以Streptomyces indicus CGMCC 4.5727基因组为模板，通过PCR反应分别扩增hylP基因及gapdh启动子、xlnc信号肽，通过golden gate连接克隆到pUC质粒载体获得中间质粒pUC57::Pgapdh-SPxlnc-hylP；最后通过限制性内切酶和T4 DNA连接酶将完整的表达元件Pgapdh-SPxlnc-hylP克隆到pKC1139载体，构建成透明质酸酶表达质粒pKC1139::Pgapdh-SPxlnc-hylP；

步骤3，高产透明质酸酶链霉菌工程菌株的获得：将步骤2高表达质粒pKC1139::Pgapdh-SPxlnc-hylP转入至S.lividans clpP2KO菌株，即获得高产透明质酸酶的基因工程菌。

8.如权利要求4或5所述的链霉菌工程菌株在生产透明质酸酶方面中的应用。

9.利用如权利要求4或5所述的链霉菌工程菌株发酵生产透明质酸酶的方法，其特征在于：包括如下步骤：

将链霉菌工程菌株接种到种子培养基中，28℃,200rpm发酵培养，种子液发酵48h后，以2％的接种量转接发酵培养基中进行发酵4天，取发酵上清液，得到透明质酸酶；

其中，种子培养基TSB的配方为：酪蛋白胨：17g/L，大豆蛋白胨:3g/L,NaCl：5g/L,K2HPO4：2.5g/L，葡萄糖：2.5g/L；

发酵培养基TSB的配方为：酪蛋白胨：17g/L,大豆蛋白胨:3g/L,NaCl：5g/L,K2HP O4:2.5g/L,葡萄糖：2.5g/L。

10.利用如权利要求4或5所述的链霉菌工程菌株制备不同分子量透明质酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：

将链霉菌工程菌株接种到种子培养基中，28℃,200rpm发酵培养，种子液发酵48h后，以2％的接种量转接发酵培养基中进行发酵4天，取发酵上清液进行HA的酶切处理；

稀释发酵液至不同透明质酸酶浓度即酶活力分别为40U/ml、20U/ml、10U/ml、8U/m l、4U/ml，酶切处理条件：每1ml不同浓度的透明质酸酶与10ml 15g/L的透明质酸混合，37℃200rpm摇床处理1h，获得不同分子量的透明质酸；

其中，种子培养基TSB的配方为：酪蛋白胨：17g/L，大豆蛋白胨:3g/L,NaCl：5g/L,K2HPO4：2.5g/L，葡萄糖：2.5g/L；

发酵培养基TSB的配方为：酪蛋白胨：17g/L,大豆蛋白胨:3g/L,NaCl：5g/L,K2HPO4:2.5g/L,葡萄糖：2.5g/L。

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