TWI844975B - 一種高產透明質酸酶的工程酵母菌株及其應用 - Google Patents
一種高產透明質酸酶的工程酵母菌株及其應用 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI844975B TWI844975B TW111137430A TW111137430A TWI844975B TW I844975 B TWI844975 B TW I844975B TW 111137430 A TW111137430 A TW 111137430A TW 111137430 A TW111137430 A TW 111137430A TW I844975 B TWI844975 B TW I844975B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- hyaluronidase
- yeast strain
- engineered yeast
- fermentation
- glycerol
- Prior art date
Links
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 title claims abstract description 83
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 title claims abstract description 67
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 title claims abstract description 66
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 57
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 23
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 120
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 117
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 33
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 23
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 65
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 claims description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 21
- 239000007433 bsm medium Substances 0.000 claims description 16
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 19
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 abstract description 19
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 18
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 5
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 21
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 16
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 15
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 101150051118 PTM1 gene Proteins 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 8
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 8
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 8
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 8
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 8
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 8
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 7
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 7
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 3,5-dinitrosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 5
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 5
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 4
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 4
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 4
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 4
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 3
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 3
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 3
- KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N hyaluronan Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)C1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H](C(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N 0.000 description 3
- 229940099552 hyaluronan Drugs 0.000 description 3
- -1 hyaluronic acid oligosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 3
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102100035149 Cytosolic endo-beta-N-acetylglucosaminidase Human genes 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 101710144190 Endo-beta-N-acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 2
- 102100021102 Hyaluronidase PH-20 Human genes 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 2
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 2
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 229920002567 Chondroitin Polymers 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 description 1
- 101001121408 Homo sapiens L-amino-acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108050009363 Hyaluronidases Proteins 0.000 description 1
- 102100026388 L-amino-acid oxidase Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 101150055528 SPAM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100012902 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) FIG2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 101150031623 aox gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 230000008436 biogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N chondroitin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@H](O)C=C(C(O)=O)O1 DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 229940019765 dermatin Drugs 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 125000000600 disaccharide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-UHFFFAOYSA-N glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=CC(O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000003783 haploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000002440 industrial waste Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000001050 lubricating effect Effects 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002893 slag Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Abstract
本發明提供一種高產透明質酸酶的工程酵母菌株，所述工程酵母菌株是採用基因組整合型載體將SEQ ID NO. 1所示的透明質酸酶基因分別整合到酵母基因組的任意兩個位點而獲得。本發明通過整合型質體介導的重組菌構建方法，構建了一株高產透明質酸酶的工程酵母菌株，該工程酵母菌株在以甲醇爲碳源的培養基中最高酶活爲5.9×10
5U/mL，在以甘油爲碳源的培養基中最高酶活爲3.6×10
5U/mL。因此，將有利於進一步降低工業化生產山大齒猛蟻透明質酸酶的成本，從而擴大透明質酸酶在醫藥、化工及食品領域的應用範圍。
Description
本發明屬基因工程技術領域，具體地，涉及一種高產透明質酸酶的工程酵母菌株及其應用。
透明質酸（hyaluronic acid，簡稱HA），又稱玻尿酸，是一種由D-葡萄糖醛酸和N-乙醯氨基葡萄糖爲重複雙糖單位，通過β（1-3）和β（1-4）糖苷鍵交替連接而成的大分子粘性多糖，由Meyer等人於1934年首次從牛玻璃球眼中提取獲得。文獻研究顯示，HA的生物活性依賴於其分子量的大小，不同分子量範圍的HA表現出不同的生理學功能。高分子量HA由於具有較好的粘彈性、保濕性、抗炎、潤滑等功能，可應用於化妝品行業、眼科手術粘彈劑和關節腔內注射治療。相比於高分子量HA，透明質酸寡聚糖具有抑制腫瘤擴散、促進創傷癒合、促進骨和血管生成、免疫調節等作用，且易於滲透到真皮中，免疫細胞、細胞因子的激活劑。
內切-β-N-乙醯氨基葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.35）是能夠將高分子量透明質酸降解成透明質酸寡聚糖的一類透明質酸酶。這類酶主要來源於哺乳動物的睾丸及動物的毒液，能夠水解透明質酸的β-1，4糖苷鍵，產生寡聚糖的還原端爲N-乙醯氨基葡萄糖結構。另外，這類酶的底物譜較寬，對硫酸軟骨素結構也有一定的催化活性，因此也可應用於低分子量硫酸軟骨素及其寡糖的生產。
目前市售的這類透明質酸酶主要是從牛睾丸提取獲得的BTH，價格非常昂貴。儘管也有用微生物細胞重組表達人睾丸源（PH20）及部分動物毒液源透明質酸酶的報導，但重組表達水平非常低，無法作爲生物催化劑用於工業化製備透明質酸寡聚糖。
針對現有技術存在的問題，本發明提供一種高產透明質酸酶的工程酵母菌株及使用該工程酵母菌株生產透明質酸酶的方法。
具體來說，本發明涉及如下方面：
1、一種高產透明質酸酶的工程酵母菌株，其中，所述工程酵母菌株是採用基因組整合型載體將SEQ ID NO. 1所示的透明質酸酶基因分別整合到酵母基因組的任意兩個位點而獲得。
2、根據項1所述的工程酵母菌，其中，所述工程酵母菌株是採用基因組整合型載體將SEQ ID NO. 1所示的透明質酸酶基因分別整合到酵母基因組的HIS4和GAP位點而獲得。
3、根據項1或2所述的工程酵母菌株，其中，所述酵母爲畢赤酵母GS115、KM71或SMD1168。
4、根據項1或2所述的工程酵母菌株，其中，所述整合型載體選自pPIC系列中的任意載體和pGAPZα系列中的任意載體；較佳的，所述整合型載體爲pPIC9K或pGAPZαA。
5、一種生產透明質酸酶的方法，其中，所述方法包括以下步驟：
利用項1-4中任一項所述的工程酵母菌株來生產透明質酸酶。
6、根據項5所述的方法，其中，所述方法包括使用BSM培養基，以甘油作爲碳源來發酵生產透明質酸酶。
7、根據項6所述的方法，其中所述發酵條件爲：發酵溫度爲25℃‒30℃，待BSM培養基中的甘油耗盡後，流加60-80%（v/v）甘油，控制溶氧DO在20%以上，發酵90-150 h。
8、根據項5所述的方法，其中，所述方法包括使用BSM培養基，以甲醇作爲碳源來發酵生產透明質酸酶。
9、根據項8所述的方法，其中所述發酵條件爲：發酵溫度爲25℃‒30℃，待BSM培養基中分批補料的甘油耗盡後，流加純甲醇並且終濃度維持在0.5-2%（v/v），誘導表達80-100 h。
10、項1-4中任一項所述的工程酵母菌株在生產透明質酸酶中的應用。
本發明通過整合型質體介導的重組菌構建方法，構建了一株高產透明質酸酶的工程酵母菌株，該工程酵母菌株在以甲醇爲碳源的培養基中最高酶活爲5.9×10
5U/mL，在以甘油爲碳源的培養基中最高酶活爲3.6×10
5U/mL。因此，將有利於進一步降低工業化生產山大齒猛蟻透明質酸酶的成本，從而擴大透明質酸酶在醫藥、化工及食品領域的應用範圍。
下面結合實施例進一步說明本發明，應當理解，實施例僅用於進一步說明和闡釋本發明，並非用於限制本發明。
除非另外定義，本說明書中有關技術的和科學的術語與所屬技術領域中具有通常知識者所通常理解的意思相同。雖然在實驗或實際應用中可以應用與此間所述相似或相同的方法和材料，本文還是在下文中對材料和方法做了描述。在相衝突的情况下，以本說明書包括其中定義爲準，另外，材料、方法和例子僅供說明，而不具限制性。以下結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但不用來限制本發明的範圍。
如本文所使用的，術語“基因”或“編碼序列”是指編碼基因產物的體外或體內的核苷酸序列。在一些情况下，基因由或基本上由編碼序列組成，即，編碼基因產物的序列。在其它情况中，基因包括附加的非編碼序列。例如，基因可以或可以不包括編碼區之前和之後的區域，例如5’非翻譯(5’UTR)或“前導”序列和3’UTR或“非轉錄尾區(trailer)”序列，以及各個編碼區段(外顯子)之間的插入序列(內含子)。
如本文所使用的，術語“載體”用於描述可以被工程化以含有可以在宿主細胞中擴增的複製的一種多核苷酸或多種多核苷酸的核酸分子。載體包括但不限於：單鏈，雙鏈或部分雙鏈的核酸分子;包含一個或多個游離末端，沒有游離末端（例如環狀）的核酸分子;包含DNA，RNA或兩者的核酸分子;以及本領域習知的其他多核苷酸種類。一種類型的載體是“質體”，其是指可以插入額外DNA片段的環狀雙鏈DNA環，例如通過標準分子複製技術。某些載體能夠在引入它們的宿主細胞中自主複製（例如，具有細菌複製起點的細菌載體和游離型哺乳動物載體）。其他載體（例如，非游離型哺乳動物載體）在引入宿主細胞後整合到宿主細胞的基因組中，從而與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠指導它們可操作地連接的那些基因的表達。此類載體在本文中稱爲“表達載體”。重組表達載體可以包含適於在宿主細胞中表達核酸的形式的本發明的核酸，這意味著重組表達載體包括一種或多種調節元件，其可以基於用於表達的、可以與待表達的核酸序列可操作地連接的宿主細胞來選擇。
如本文所使用的，術語“整合型載體”或“整合載體”是指線性或環狀的DNA分子，其能夠被摻入微生物的基因組中，並且提供編碼感興趣的多肽的基因的穩定遺傳。整合載體一般包含一個或多個區段(segments)，所述區段包括編碼感興趣的多肽的基因序列，所述基因序列位於支持其轉錄的額外的核酸區段的控制下(與之可操作地連接)。這類額外的區段可包括啓動子和終止子序列，和驅動感興趣的基因摻入靶細胞基因組中的一個或多個區段，所述摻入通常通過同源重組過程實現。典型地，整合載體會是能夠被轉移進靶細胞的載體，但是其具有在所述生物中無功能的複製子。當區段中包含適當的標記物時，可以選擇包含感興趣的基因的區段的整合。
如本文所使用的，密碼子優化是指在維持天然胺基酸序列的同時，通過用目的宿主細胞的基因中更頻繁或最頻繁使用的密碼子替換天然序列的至少一個密碼子來修飾核酸序列以在該宿主細胞中增强表達的過程。多種物種對特定胺基酸的某些密碼子表現出特定的偏倚。密碼子偏倚(生物體之間密碼子選用的差異)通常與信使RNA(mRNA)的翻譯效率相關，而信使RNA(mRNA)的翻譯效率繼而被認爲尤其取决於所翻譯密碼子的特性和特定轉移RNA(tRNA)分子的可用性。所選擇tRNA在細胞中的優勢通常反映了肽合成中最頻繁使用的密碼子。因此，可基於密碼子優化來定制基因以在給定生物體中進行最佳基因表達。
密碼子優化可以例如通過將一種物種的核苷酸序列轉化爲不同物種的遺傳序列來實現。優化的密碼子有助於實現更快的翻譯速度和更高的準確性。由於這些因素，預計在高表達基因中翻譯選擇會更强。然而，儘管本文考慮了使用優化的密碼子來表達公開的蛋白質，但是本文考慮了用於編碼任何公開的蛋白質的核酸的所有可能的密碼子。
如本文所使用的，術語“信號肽”意指存在於大多數新合成蛋白質的N-末端的短肽(通常爲16-30個胺基酸)，這些蛋白質預定要進入分泌途徑。其也可以稱爲信號序列、靶向信號、定位信號、定位序列、轉運肽、前導序列或前導肽。信號肽通常通過信號肽酶從蛋白質切割下來。
本發明提供一種高產透明質酸酶的工程酵母菌株，其採用基因組整合型載體將SEQ ID NO. 1所示的透明質酸酶基因分別整合到酵母基因組的任意兩個位點而獲得。
在一個較佳的實施方式中，高產透明質酸酶的工程酵母菌株採用基因組整合型載體將SEQ ID NO. 1所示的透明質酸酶基因分別整合到酵母基因組的HIS4和GAP位點而獲得。
具體地，首先針對山大齒猛蟻透明質酸酶全長基因序列，根據畢赤酵母密碼子偏好性對其進行了密碼子優化得到密碼子優化的透明質酸酶基因。進一步地，在密碼子優化的透明質酸酶基因的N端截掉一段自身信號肽序列，得到SEQ ID NO. 1所示的透明質酸酶基因。
其中，山大齒猛蟻透明質酸酶屬第三類透明質酸酶，爲內切-β-N-乙醯氨基葡萄糖苷酶，能夠水解透明質酸的β-1，4糖苷鍵，產生終產物的還原端爲N-乙醯氨基葡萄糖。另外，這類酶相比於第二類的水蛭透明質酸酶底物譜較寬，對軟骨素、硫酸軟骨素和硫酸皮膚素結構也有一定的催化活性。山大齒猛蟻透明質酸酶能夠豐富透明質酸水解產物的種類，還可以具有除透明質酸酶催化以外的更廣泛的應用範圍。
然後將SEQ ID NO. 1所示的透明質酸酶基因以高拷貝數整合到酵母基因組的HIS4和GAP位點，具體地，透明質酸酶基因經EcoRI和NotI雙酶切後，分別複製至經相同酶切處理的線性表達載體pPIC9K和pGAPZαA上，構建表達質體pPIC9K-ΔN24HYAL_OM
opt和pGAPZαA-ΔN24HYAL_OM
opt，pPIC9K-ΔN24HYAL_OM
opt經限制性內切酶SalI線性化後經電轉整合到畢赤酵母基因組的HIS4位點，pGAPZαA-ΔN24HYAL_OM
opt經限制性內切酶AvrII線性化後經電轉整合到畢赤酵母基因組的GAP位點。
在一個具體的實施方式中，所述酵母爲畢赤酵母GS115、KM71或SMD1168。
其中，畢赤酵母，是甲醇營養型酵母中的一類能夠利用甲醇作爲唯一碳源和能源的酵母菌。與其它酵母一樣，在無性生長期主要以單倍體形式存在，當環境營養限制時，常誘導2個生理類型不同的接合型單倍體細胞交配，融合成雙倍體。畢赤酵母的另一個生物學特點是，甲醇代謝所需的醇氧化酶被分選到過氧化物酶體中，形成區域化。以葡萄糖作碳源時，菌體中只有1個或很少幾個小的過氧化物酶體，而以甲醇作碳源時，過氧化物酶體幾乎占到整個細胞體積的80%，AOX增至細胞總蛋白的35%‒40%。因此，當在AOX基因前利用同源重組方式插入外源蛋白基因時，可獲得大量表達。同時，根據甲醇酵母這種可以形成過氧化物酶體的特性，既可利用該系統表達一些毒性蛋白和易被降解的酶類，也可用以研究細胞特異區域化的生物發生及其機制和功能，爲高等動物類似的研究提供啓示。
畢赤酵母常用的分泌型表達載體有pPIC9K、pGAPZαA等。
在一個具體的實施方式中，本發明的整合型載體選自pPIC系列中的任意載體和pGAPZα系列中的任意載體。即同時存在pPIC系列載體和pGAPZα系列載體。其中，載體pPIC系列包括pPIC9K、pPIC3.5K、pPICZαA,B,C、pPIC9K-His、pPICZA,B,C等，較佳pPIC9K。載體pGAPZα系列包括pGAPZαA、pGAPZαB、pGAPZαC等，較佳pGAPZαA。
其中，pPIC9K以醇氧化酶基因啓動子P
AOX1爲啓動子，爲甲醇誘導型强啓動子；pGAPZαA以3-磷酸甘油醛脫氫酶啓動子P
GAP爲啓動子，該啓動子具有高水平的組成型表達特點，過程控制簡單，適合於連續培養，且蛋白表達水平與P
AOX1系統相當。本發明在畢赤酵母基因組的不同位點上整合了上述兩種表達載體，增加了目的基因拷貝數，同時提供了利用不同碳源（甲醇或甘油）的兩種生產方式。在後續的工業生產中可將工業廢渣甘油及廢液甲醇轉化成有價值的產物，爲實現廢渣廢液的重複利用提供了可能。
進一步地，本發明所述的工程酵母菌株通過遺傳黴素和博萊黴素篩選獲得。具體地，pPIC9K-ΔN24HYAL_OM
opt電轉畢赤酵母後MD平板上生長的轉化子挑到含4 mg/mL遺傳黴素G418的平板上，篩選高拷貝重組菌。pGAPZαA-ΔN24HYAL_OM
opt，電轉至上述高拷貝重組菌在含有0.1 mg/mL博來黴素Zeocin的平板上篩選陽性轉化子，並轉到含有1 mg/mL博來黴素Zeocin的平板上進行高拷貝工程菌的篩選。
在一個具體的實施方式中，重組透明質酸酶工程酵母菌株構建過程如圖1所示，重組質體pPIC9K-ΔN24HYAL_OM
opt經限制性內切酶SalI線性化後電轉入
P. pastorisGS115細胞中，重組轉化子經遺傳黴素G418篩選得到高拷貝透明質酸酶基因的重組菌
P. pastorisGS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM
opt（圖2a）。重組質體pGAPZαA-ΔN24HYAL_OM
opt經限制性內切酶AvrII線性化後電轉入
P. pastorisGS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM
opt細胞中，重組轉化子經博來黴素Zeocin篩選得到高拷貝透明質酸酶基因的組合菌株
P. pastorisGS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM
opt/pGAPZαA-ΔN24HYAL_OM
opt（圖2b）。
本發明還提供一種生產透明質酸酶的方法，其包括如下步驟：
利用上述高產透明質酸酶的工程酵母菌株來生產透明質酸酶。
在一個具體的實施方式中，所述方法爲搖瓶培養，包括使用BMMY培養基，以甲醇作爲碳源來發酵生產透明質酸酶。
其中，BMMY培養基的組成爲酵母提取物10 g/L，蛋白腖20 g/L，K
2HPO
43 g/L，KH
2PO
411.8 g/L，YNB 3.4 g/L，硫酸銨10 g/L，生物素4×10
-4g/L，甲醇10 mL/L。
具體地，所述發酵條件爲：發酵溫度爲25℃‒30℃，發酵過程中每隔24 h補加0.5%‒1%（v/v）甲醇，誘導表達80-100 h。
在一個較佳的實施方式中，以本發明的工程酵母菌株
P. pastorisGS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM
opt/pGAPZαA-ΔN24HYAL_OM
opt爲生產菌株，發酵生產透明質酸酶。具體的發酵條件爲：挑取單株接種於40 mL的YPD培養基，30℃、200 rpm培養24 h。按10%的接種量轉接於40 mL的初始表達培養基BMGY（酵母提取物10 g/L，蛋白腖20 g/L，K
2HPO
43 g/L，KH
2PO
411.8 g/L，YNB 3.4 g/L，硫酸銨10 g/L，生物素4×10
-4g/L，甘油10 g/L）中，30℃，200 rpm培養24 h。離心收集菌體，用生理鹽水洗滌菌體後更換至40 mL誘導表達培養基BMMY，30℃、200 rpm培養，每隔24 h向培養基中添加純甲醇至終濃度爲1.0%（v/v），誘導表達96 h。
在一個具體的實施方式中，所述方法爲發酵罐培養，包括使用BSM培養基，以甲醇作爲碳源來發酵生產透明質酸酶。
具體地，所述發酵條件爲：發酵溫度爲25℃‒30℃，待BSM培養基中分批補料的甘油耗盡後，流加純甲醇並且終濃度維持在0.5-2%（v/v），誘導表達80-100 h。
其中，BSM發酵培養基組成爲：甘油40 g/L，K
2SO
418 g/L，KOH 4.13 g/L，85% H
3PO
426.7 mL/L，CaSO
4·2H
2O 0.93 g/L，MgSO
4·7H
2O 14.9 g/L，4.4 mL/L過濾除菌的PTM1；PTM1配方：CuSO
4·5H
2O 6 g/L，KI 0.09 g/L，MnSO
4·H
2O 3 g/L，H
3BO
30.02 g/L，MoNa
2O
4·2H
2O 0.2 g/L，CoCl
2·6H
2O 0.92 g/L，ZnCl
220 g/L，FeSO
4·7H
2O 65 g/L，生物素 0.2 g/L，H
2SO
45.0 mL。
在一個較佳的實施方式中，以本發明的工程酵母菌株
P. pastorisGS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM
opt/pGAPZαA-ΔN24HYAL_OM
opt爲生產菌株，發酵生產透明質酸酶。具體的發酵條件爲：接YPD平板上的單菌落至50 mL YPD液體培養基中，30℃ 220 rpm培養24 h，將培養液按10%接種至200 mL BMGY培養基中，30℃ 220 rpm培養24 h；將培養24 h的200 mL種子液接入到含有2 L BSM發酵培養基的5-L發酵罐中。初始發酵參數設置爲溫度30℃，pH 5.5，通氣量2.0 vvm和轉速500 rpm；發酵過程中通過自動添加氨水將pH控制在5.5；待BSM培養基中的甘油被耗盡後，進入分批補料階段，以指數流加的方式補加50%（v/v）甘油（含12 mL/L PTM1），同時設置轉速與溶氧DO偶聯，補料速率爲前6 h分別爲13.5、16.2、19.2、22.8、27.2和32.4 mL/h/L，隨後6 h的補料速率設置爲30 mL/h/L；補料結束後進入饑餓培養階段，饑餓培養2‒3 h，至殘餘甘油耗盡；進入甲醇誘導階段，流加含12 mL/L PTM1的純甲醇並且終濃度維持在1.8%（v/v），同時將發酵溫度調整至25℃，轉速提高至1000 rpm，甲醇誘導88 h。
在一個具體的實施方式中，所述方法爲搖瓶培養，包括使用BMGYS培養基，以甘油作爲碳源來發酵生產透明質酸酶。
其中，BMGYS培養基的組成爲酵母提取物10 g/L，蛋白腖20 g/L，K
2HPO
43 g/L，KH
2PO
411.8 g/L，YNB 3.4 g/L，硫酸銨10 g/L，生物素4×10
-4g/L，甘油40 g/L。
在一個具體的實施方式中，所述發酵條件爲：發酵溫度爲25℃‒30℃，誘導表達80-120 h。
在一個較佳的實施方式中，以本發明的工程酵母菌株
P. pastorisGS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM
opt/pGAPZαA-ΔN24HYAL_OM
opt爲生產菌株，發酵生產透明質酸酶。具體的發酵條件爲：挑取單株接種於40 mL的YPD培養基（酵母提取物10 g/L，蛋白腖20 g/L，葡萄糖20 g/L），30℃、200 rpm培養24 h。按10%的接種量轉接於40 mL的表達培養基BMGYS中，30℃，200 rpm培養96 h。
在一個具體的實施方式中，所述方法爲發酵罐培養，包括使用BSM培養基，以甘油作爲碳源來發酵生產透明質酸酶。
具體地，所述發酵條件爲：發酵溫度爲25℃‒30℃，待BSM培養基中的甘油耗盡後，流加60-80%（v/v）甘油，控制溶氧DO在20%以上，發酵90-150 h。
在一個較佳的實施方式中，以本發明的工程酵母菌株
P. pastorisGS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM
opt/pGAPZαA-ΔN24HYAL_OM
opt爲生產菌株，發酵生產透明質酸酶。具體的發酵條件爲：接YPD平板上的單菌落至50 mL YPD液體培養基中，30℃ 220 rpm培養24 h，將培養液按10%接種至200 mL BMGY培養基中，30℃ 220 rpm培養24 h；將培養24 h的200 mL種子液接入到含有2 L BSM發酵培養基的5-L發酵罐中。初始發酵參數設置爲溫度30℃，pH 5.5，通氣量2.0 vvm和轉速500 rpm；發酵過程中通過自動添加氨水將pH控制在5.5；待BSM培養基中的甘油被耗盡後，加入含有1.2% (v/v) PTM1的70% (w/v)甘油，控制溶氧DO在20%以上。當濕細胞重量達到200 g/L時，溫度調整至25℃。發酵培養132 h。
對於生產得到的透明質酸酶的酶活，採用3，5-二硝基水楊酸法（DNS）測定。
其中，透明質酸酶活力單位定義（U）爲：在pH 5.5和38℃條件下，每小時從透明質酸糖鏈中釋放出1 μg葡萄糖還原當量的還原糖所需的酶量。
DNS還原糖測定法：山大齒猛蟻透明質酸酶水解透明質酸的β-1,4糖苷鍵，產生帶有還原端羥基的還原糖產物。通過DNS還原糖法測定水解透明質酸產生的相對於葡萄糖還原當量的還原糖產物的量，來計算透明質酸酶的催化活力。
本發明還提供上述工程酵母菌株在生產透明質酸酶中的應用。
實施例
實施例1 高產透明質酸酶的工程酵母菌株的構建
基於NCBI數據庫公開的山大齒猛蟻透明質酸酶全長基因序列（Genbank: FX985505.1），根據畢赤酵母密碼子偏好性對其進行了密碼子優化。密碼子優化的山大齒猛蟻透明質酸酶的基因序列如SEQ ID NO. 2所示，委托南京金斯瑞生物科技有限公司全基因合成，並複製到畢赤酵母表達載體pPIC9K的EcoRI和NotI酶切位點之間，得到重組表達載體pPIC9K-HYAL_OM
opt。
以pPIC9K-HYAL_OM
opt重組表達載體爲模板，
設計引物，截掉全長透明質酸水解酶基因N端的一段信號肽序列，獲得基因工程透明質酸水解酶基因片段，其序列如SEQ ID NO. 1所示。
其中引物序列如下：
上游引物F：5’‒CCGGAATTCATGAAGACACTACGCGGCTC‒3’（SEQ ID NO. 3）；
下游引物R：5’‒ATTTGCGGCCGCTCAATGATGATGATGGTGGTGATGAA GGGTGAACTTCTT‒3’（SEQ ID NO. 4）；
對得到的基因工程透明質酸水解酶基因片段進行EcoRI和NotI雙酶切後，複製至經相同酶切處理的線性表達載體pPIC9K和pGAPZαA上，轉化至
E.coilTOP10中，在確保閱讀框不移碼的前提下獲得重組表達質體pPIC9K-ΔN24HYAL_OM
opt和pGAPZαA-ΔN24HYAL_OM
opt，經DNA測序比對，重組序列正確。重組透明質酸酶工程酵母菌株構建過程如圖1所示，重組質體pPIC9K-ΔN24HYAL_OM
opt經限制性內切酶SalI線性化後電轉入
P. pastorisGS115細胞中（其中，卡那黴素在畢赤酵母中的表型爲G418），重組轉化子經遺傳黴素G418篩選得到高拷貝透明質酸酶基因的重組菌
P. pastorisGS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM
opt（圖2a）。重組質體pGAPZαA- ΔN24HYAL_OM
opt經限制性內切酶AvrII線性化後電轉入
P. pastorisGS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM
opt細胞中，重組轉化子經博來黴素Zeocin篩選得到高拷貝透明質酸酶基因的組合菌株
P. pastorisGS115/pPIC9K- ΔN24HYAL_OM
opt/pGAPZαA-ΔN24HYAL_OM
opt（圖2b）。
實施例2重組透明質酸酶工程酵母菌株搖瓶發酵
對獲得的重組工程菌
P. pastorisGS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM
opt/pGAPZαA-ΔN24HYAL_OM
opt進行搖瓶發酵培養。
純甘油培養發酵步驟如下：挑取單株接種於40 mL的YPD培養基（酵母提取物10 g/L，蛋白腖20 g/L，葡萄糖20 g/L），30℃、200 rpm培養24 h。按10%的接種量轉接於40 mL的表達培養基BMGYS（酵母提取物10 g/L，蛋白腖20 g/L，K
2HPO
43 g/L，KH
2PO
411.8 g/L，YNB 3.4 g/L，硫酸銨10 g/L，生物素4×10
-4g/L，甘油40 g/L）中，30℃，200 rpm培養96 h。
甲醇誘導發酵步驟如下：挑取單株接種於40 mL的YPD培養基，30℃、200 rpm培養24 h。按10%的接種量轉接於40 mL的初始表達培養基BMGY（酵母提取物10 g/L，蛋白腖20 g/L，K
2HPO
43 g/L，KH
2PO
411.8 g/L，YNB 3.4 g/L，硫酸銨10 g/L，生物素4×10
-4g/L，甘油10 g/L）中，30℃，200 rpm培養24 h。離心收集菌體，用生理鹽水洗滌菌體後更換至40 mL誘導表達培養基BMMY（酵母提取物10 g/L，蛋白腖20 g/L，K
2HPO
43 g/L，KH
2PO
411.8 g/L，YNB 3.4 g/L，硫酸銨10 g/L，生物素4×10
-4g/L，甲醇10 mL/L），30℃、200 rpm培養，每隔24 h向培養基中添加純甲醇至終濃度爲1.0%（v/v），誘導表達96 h。
發酵上清液經SDS‒PAGE蛋白電泳檢測，結果圖3所示，純甘油培養（泳道1）及甲醇誘導培養（泳道3）均在理論分子量39 kDa左右有一條明顯的蛋白條帶（箭頭位置所示），說明該重組透明質酸酶工程酵母菌株既可以以甲醇爲碳源，也可以以甘油爲碳源生產透明質酸酶。
採用DNS法測定水解透明質酸產生的還原糖當量，用分析純葡萄糖做標準曲線，計算出透明質酸酶活力。結果如圖4所示，本發明構建的組合菌株
P. pastorisGS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM
opt/pGAPZαA-ΔN24HYAL_OM
opt甲醇誘導發酵上清液酶活爲80596.89 U/mL，純甘油培養發酵上清液酶活達到31173.03 U/mL。
實施例3重組透明質酸酶工程酵母菌株5-L發酵罐高密度培養（以甲醇爲碳源）
將組合菌株
P. pastorisGS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM
opt/pGAPZαA- ΔN24HYAL_OM
opt進行5-L發酵罐高密度培養。
接YPD平板上的單菌落至50 mL YPD液體培養基中，30℃ 220 rpm培養24 h，將培養液按10%接種至200 mL BMGY培養基中，30℃ 220 rpm培養24 h；將培養24 h的200 mL種子液接入到含有2 L BSM發酵培養基（甘油40 g/L，K
2SO
418 g/L，KOH 4.13 g/L，85% H
3PO
426.7 mL/L，CaSO
4·2H
2O 0.93 g/L，MgSO
4·7H
2O 14.9 g/L，4.4 mL/L過濾除菌的PTM1；PTM1配方：CuSO
4·5H
2O 6 g/L，KI 0.09 g/L，MnSO
4·H
2O 3 g/L，H
3BO
30.02 g/L，MoNa
2O
4·2H
2O 0.2 g/L，CoCl
2·6H
2O 0.92 g/L，ZnCl
220 g/L，FeSO
4·7H
2O 65 g/L，生物素 0.2 g/L，H
2SO
45.0 mL）的5-L發酵罐中。
初始發酵參數設置爲溫度30℃，pH 5.5，通氣量2.0 vvm和轉速500 rpm；發酵過程中通過自動添加氨水將pH控制在5.5；待BSM培養基中的甘油被耗盡後，進入分批補料階段，以指數流加的方式補加50%（v/v）甘油（含12 mL/L PTM1），同時設置轉速與溶氧DO偶聯，補料速率爲前6 h分別爲13.5、16.2、19.2、22.8、27.2和32.4 mL/h/L，隨後6 h的補料速率設置爲30 mL/h/L；補料結束後進入饑餓培養階段，饑餓培養2‒3 h，至殘餘甘油耗盡；進入甲醇誘導階段，流加含12 mL/L PTM1的純甲醇並且終濃度維持在1.8%（v/v），同時將發酵溫度調整至25℃，轉速提高至1000 rpm，甲醇流加速率和培養基中的甲醇終濃度由甲醇檢測器實時在線控制。
進入甲醇誘導階段後每隔一定時間取樣，檢測發酵上清液酶活及生物量。
酶活檢測結果如圖5所示，甲醇誘導88 h時，發酵上清液透明質酸酶酶活力爲5.8×10
5U/mL；甲醇誘導100 h時，發酵上清液透明質酸酶酶活力最高爲5.9×10
5U/mL。
實施例4 重組透明質酸酶工程酵母菌株5-L發酵罐高密度培養（以甘油爲碳源）
將組合菌株
P. pastorisGS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM
opt/pGAPZαA- ΔN24HYAL_OM
opt進行5-L發酵罐高密度培養。
接YPD平板上的單菌落至50 mL YPD液體培養基中，30℃ 220 rpm培養24 h，將培養液按10%接種至200 mL BMGY培養基中，30℃ 220 rpm培養24 h；將培養24 h的200 mL種子液接入到含有2 L BSM發酵培養基的5-L發酵罐中。初始發酵參數設置爲溫度30℃，pH 5.5，通氣量2.0 vvm和轉速500 rpm；發酵過程中通過自動添加氨水將pH控制在5.5；待BSM培養基中的甘油被耗盡後，加入含有1.2% (v/v) PTM1的70% (w/v)甘油，控制溶氧DO在20%以上。當濕細胞重量達到200 g/L時，溫度調整至25℃。每12小時收集一次培養液，檢測發酵上清液酶活及生物量。
酶活檢測結果如圖6所示，發酵培養132 h時，發酵上清液透明質酸酶酶活力最高爲3.6×10
5U/mL。
序列表
SEQ ID NO. 1
atgaagacac tacgcggctc ttccccacag caattcgacg tatactggaa tgtgccaact 60
ttcatgtgtc acaagcacgg tatgaaattt gaagagctga aagatttcgg tatacaccag 120
aacgcaatgg atatgtttcg cggcgaagaa attgcgattc tttatgaccc tggcatgttt 180
cccgcccttc tagtagataa agatggatac gtcactaaac ggaacggtgg ggtgccgcaa 240
gaggggaacc tcaaggaaca tttagaaacc tttagaaagc atctgacgac acaaattccg 300
gacgagagct ttagcgggat aggaatcata gactttgaga gttggagacc gattttcagg 360
cagaactggg cgtcactcga gccctataaa actttgtcca taaagttgga gagggaaaaa 420
cacccatttt ggtcggaggc agctgtgaag aaggaggcca aacgtcgatt cgagaaatcc 480
gggcgaatat ttatggagga aaccctcaaa atggccaaaa aactaagacc gaaagcaaag 540
tggggctatt atgggtatcc ccactgtttc aatcaaaccc ctggacagca gtcggttcac 600
tgcaatcggc aaacgatgat ggaaaatgac ggtatgagtt ggctgtttac actcgaagac 660
gttcatgctc ccagcgttta cctacgattg gaaatcaagg aggatgaccg gccttcattc 720
gtgaaaggcc gggtttccga ggccttaagg ttagccgcta aatcgtcttc aaaacaacgt 780
atcctacctt actactggtt catttatcag gataagaagg atgagttctt aacggaaaag 840
gatacacaaa acactataaa tatgatcgct aatctgggat ctaatggttt cataatttgg 900
ggatctagtg acgatgtcaa cacggaacgc aaatgcaagg atttacagca atacgtaaag 960
gaagtcttgg gcccagcgat taagaagttc acccttcatc accaccatca tcatcattga 1020
SEQ ID NO. 2：
atgatcccac ccgcacgtga ctcgcttatg tttgtctttg cgactgcggt aatcgctagt 60
tttttcggta gcgcaaagac actacgcggc tcttccccac agcaattcga cgtatactgg 120
aatgtgccaa ctttcatgtg tcacaagcac ggtatgaaat ttgaagagct gaaagatttc 180
ggtatacacc agaacgcaat ggatatgttt cgcggcgaag aaattgcgat tctttatgac 240
cctggcatgt ttcccgccct tctagtagat aaagatggat acgtcactaa acggaacggt 300
ggggtgccgc aagaggggaa cctcaaggaa catttagaaa cctttagaaa gcatctgacg 360
acacaaattc cggacgagag ctttagcggg ataggaatca tagactttga gagttggaga 420
ccgattttca ggcagaactg ggcgtcactc gagccctata aaactttgtc cataaagttg 480
gagagggaaa aacacccatt ttggtcggag gcagctgtga agaaggaggc caaacgtcga 540
ttcgagaaat ccgggcgaat atttatggag gaaaccctca aaatggccaa aaaactaaga 600
ccgaaagcaa agtggggcta ttatgggtat ccccactgtt tcaatcaaac ccctggacag 660
cagtcggttc actgcaatcg gcaaacgatg atggaaaatg acggtatgag ttggctgttt 720
acactcgaag acgttcatgc tcccagcgtt tacctacgat tggaaatcaa ggaggatgac 780
cggccttcat tcgtgaaagg ccgggtttcc gaggccttaa ggttagccgc taaatcgtct 840
tcaaaacaac gtatcctacc ttactactgg ttcatttatc aggataagaa ggatgagttc 900
ttaacggaaa aggatacaca aaacactata aatatgatcg ctaatctggg atctaatggt 960
ttcataattt ggggatctag tgacgatgtc aacacggaac gcaaatgcaa ggatttacag 1020
caatacgtaa aggaagtctt gggcccagcg attaagaagt tcacccttca ttga 1074
SEQ ID NO. 3：
CCGGAATTCATGAAGACACTACGCGGCTC
SEQ ID NO. 4：
ATTTGCGGCCGCTCAATGATGATGATGGTGGTGATGAAGGGTGAACTTCTT
無
圖1爲構建高產透明質酸酶工程酵母菌株的示意圖。
圖2爲篩選含高拷貝透明質酸酶基因的工程酵母平板。
圖3搖瓶發酵培養上清液中透明質酸酶表達水平的電泳驗證圖。其中，泳道M代表分子量爲180 kDa的標準蛋白；泳道1代表組合菌株
P. pastorisGS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM
opt/pGAPZαA-ΔN24HYAL_OM
opt以甘油爲碳源發酵上清液；泳道2代表重組菌
P. pastorisGS115發酵上清液（陰性對照）；泳道3代表組合菌株
P. pastorisGS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM
opt/pGAPZαA- ΔN24HYAL_OM
opt以甲醇爲碳源發酵上清液。
圖4爲搖瓶發酵上清液透明質酸酶酶活。
圖5爲組合菌株5-L發酵罐高密度發酵的酶活曲線（以甲醇爲碳源）。
圖6爲組合菌株5-L發酵罐高密度發酵的酶活曲線（以甘油爲碳源）。
無
TWI844975B_111137430_SEQL.xml
Claims (9)
- 一種高產透明質酸酶的工程酵母菌株，其中，所述工程酵母菌株是採用基因組整合型載體將SEQ ID NO.1所示的透明質酸酶基因分別整合到酵母基因組的兩個位點而獲得，所述兩個位點為HIS和GAP位點。
- 如請求項1所述的工程酵母菌株，其中，所述酵母為畢赤酵母GS115、KM71或SMD1168。
- 如請求項1所述的工程酵母菌株，其中，所述整合型載體為pPIC9K或pGAPZαA。
- 一種生產透明質酸酶的方法，其中，所述方法包括以下步驟：利用請求項1-3中任一項所述的工程酵母菌株來生產透明質酸酶。
- 如請求項4所述的方法，其中，所述方法包括使用BSM培養基，以甘油作為碳源來發酵生產透明質酸酶。
- 如請求項5所述的方法，其中所述發酵條件為：發酵溫度為25℃-30℃，待BSM培養基中的甘油耗盡後，流加60-80%(v/v)甘油，控制溶氧DO在20%以上，發酵90-150h。
- 如請求項4所述的方法，其中，所述方法包括使用BSM培養基，以甲醇作為碳源來發酵生產透明質酸酶。
- 如請求項7所述的方法，其中所述發酵條件為：發酵溫度為25℃-30℃，待BSM培養基中分批補料的甘油耗盡後，流加純甲醇並且終濃度維持在0.5-2%(v/v)，誘導表達80-100h。
- 一種如請求項1-3中任一項所述的工程酵母菌株在生產透明質酸酶中的用途。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111176424.XA CN114350535B (zh) | 2021-10-09 | 2021-10-09 | 一种高产透明质酸酶的工程酵母菌株及其应用 |
| CN202111176424.X | 2021-10-09 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW202336227A TW202336227A (zh) | 2023-09-16 |
| TWI844975B true TWI844975B (zh) | 2024-06-11 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112522125A (zh) | 2020-12-28 | 2021-03-19 | 河北省微生物研究所 | 一种透明质酸酶工程菌及其构建方法与应用 |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112522125A (zh) | 2020-12-28 | 2021-03-19 | 河北省微生物研究所 | 一种透明质酸酶工程菌及其构建方法与应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 網路文獻 Gen Bank, FX985505.1 2019年2月 5日 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2023056891A1 (zh) | 一种高产透明质酸酶的工程酵母菌株及其应用 | |
| CN114350691B (zh) | 一种高效表达透明质酸水解酶的基因及其表达方法 | |
| CN107574159B (zh) | 一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体 | |
| CN114350639B (zh) | 一种密码子优化的透明质酸水解酶基因及其表达 | |
| CN110106156B (zh) | 一种阿魏酸酯酶EpFAE1及其编码基因和应用 | |
| US10508279B2 (en) | Recombinant Escherichia coli for high efficiency production of fructosylated chondroitin and method for making thereof | |
| CA2407415A1 (en) | Chondroitin synthase gene and methods of making and using same | |
| CN108048473B (zh) | 一种阿魏酸酯酶基因、基因工程菌株以及制备方法和用途 | |
| TWI844975B (zh) | 一種高產透明質酸酶的工程酵母菌株及其應用 | |
| CN112430589B (zh) | 高热稳定性的硫酸软骨素abc裂解酶突变体及其应用 | |
| CN107746836B (zh) | 一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶突变体 | |
| CN111518822B (zh) | 一种硫酸软骨素abc裂解酶突变体及其分泌表达的方法 | |
| EP4029946A1 (en) | Transformed microorganism, and method for producing polyhydroxyalkanoic acid using said microorganism | |
| CN108865913B (zh) | 一种构建高效分泌表达硫酸软骨素水解酶重组菌的方法 | |
| CN114761553A (zh) | 用于生产来自黑曲霉的β-呋喃果糖苷酶的核酸、载体、宿主细胞和方法 | |
| Kanai et al. | Recombinant thermostable cycloinulo-oligosaccharide fructanotransferase produced by Saccharomyces cerevisiae | |
| CN112522125B (zh) | 一种透明质酸酶工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN105254745A (zh) | 一种生产猪源脂联素的方法 | |
| Kim et al. | Constitutive overexpression of Pseudoalteromonas carrageenovora arylsulfatase in E. coli fed-batch culture | |
| CN114746548A (zh) | 用于生产来自日本曲霉的果糖基转移酶的核酸、载体、宿主细胞和方法 | |
| CN106497898B (zh) | 表达重组菊粉内切酶的基因工程菌株及重组菊粉内切酶的制备方法 | |
| JP6778870B2 (ja) | 藍藻変異株及びそれを用いたコハク酸及びｄ−乳酸産生方法 | |
| CN114107256B (zh) | 一种耐热木糖苷酶及其应用 | |
| WO2024045153A1 (zh) | 一种提高重组人白蛋白表达量的方法和细胞和蛋白 | |
| WO2024124528A1 (zh) | 一种利用果胶的基因工程菌及其构建方法和应用 |