CN105254745A

CN105254745A - 一种生产猪源脂联素的方法

Info

Publication number: CN105254745A
Application number: CN201510654844.2A
Authority: CN
Inventors: 姬生跃
Original assignee: Individual
Current assignee: Zhongji Fengke Shandong Biotechnology Co ltd
Priority date: 2015-10-10
Filing date: 2015-10-10
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2035-10-10
Also published as: CN105254745B

Abstract

本发明提供了一种生产猪源脂联素的方法，通过人工合成可分泌表达sumo蛋白酶的操纵子、可分泌表达酿酒酵母小分子泛素样蛋白与猪源脂联素融合蛋白的操纵子，进而克隆得到了猪源脂联素母体基因可在枯草芽孢杆菌表达的载体pZLS-128，并将其电转化进入枯草芽孢杆菌WB700菌株的感受态细胞中得到重组枯草芽孢杆菌BZLS128菌株，重组枯草芽孢杆菌BZLS128菌株在摇瓶经诱导发酵后可得到猪源脂联素蛋白。本发明具有表达系统简单、可用于大规模生产且生产成本低等优点，为猪源脂联素的商业应用提供了必要的技术支持。

Description

一种生产猪源脂联素的方法

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体讲提供了一种生产猪源脂联素的方法。

背景技术

脂肪组织(adiposetissue)主要由大量聚集成团的脂肪细胞构成，脂联素(Adiponectin/ADPN)是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性蛋白质。脂联素是一种胰岛素增敏激素(AnInsulin-sensitizingHormone)，能改善小鼠的胰岛素抗性(Insulinresistance)和动脉硬化症；对人体的研究发现，脂联素水平能预示II型糖尿病和冠心病的发展，并在临床试验表现出抗糖尿病、抗动脉粥样和炎症的潜力。

在脂肪细胞分泌的具有生物活性的一类蛋白质因子中，脂联素是脂肪组织基因表达最丰富的蛋白质产物之一，大量存在于血液循环中。在人体内以3-30ug/ml的浓度出现在循环血浆中。脂联素又被称作Acrp30、apM1、AdipoQ、GBP28。最初,脂联素是在人体皮下脂肪组织、血浆和鼠科动物的脂肪细胞中被发现。人体内的脂联素由244个氨基酸组成，分子量为30KD,由氨基末端的分泌信号序列(aa1-18)，一段特异序列(aa19-41)，一组由22个氨基酸组成的胶原重复序列(aa42-107)，一段球状序列(aa108-244)组成。其中球状区是脂联素生物活性的关键部位，和TNF-α的结构相似，脂联素与胶原Ⅷ、X和补体C1q高度同源。脂联素的单聚体和三聚体是其生物活性形式或受体亲和配基可以特异性结合骨骼肌或肝脏细胞膜上的G蛋白藕联受体一型或二型脂联素受体，进而调节脂肪酸氧化和糖代谢。

目前关于用基因工程的方法来表达生产脂联素的报道还比较少。枯草芽孢杆菌具有良好的分泌特性，其发酵工艺和产物回收技术也比较成熟，用作外源蛋白的分泌型宿主菌，具有很大潜力。相关研究表明，多种外源蛋白都能在枯草芽孢杆菌中分泌表达，有些还获得了较高的产率。枯草芽孢杆菌WB700菌株是缺失7种胞外蛋白酶的枯草芽孢杆菌突变株，其保外残余的蛋白酶活性只相当于野生菌株的0.1％，是一种表达外源蛋白的理想宿主菌株。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产猪源脂联素方法，以克服当前脂联素在产业化应用中产量不足的问题。目前还没有用枯草芽孢杆菌WB700表达系统生物合成猪源脂联素的报道。枯草芽孢杆菌是一种原核单细胞微生物，具有培养条件易于控制、增殖速度迅速、表达量高和表达产物易于分离纯化等特点。

本发明所提供的生产猪源脂联素的方法包括以下步骤：

1.可分泌表达sumo蛋白酶的操纵子、可分泌表达酿酒酵母小分子泛素样蛋白与猪源脂联素融合蛋白的操纵子的合成：

a)人工合成含枯草芽孢杆菌麦芽糖诱导的Pglv启动子、编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽sacB和编码sumo蛋白酶的表达操纵子基因的融合DNA片段Pglv-sacB-ulp1(可以是由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成)，其核苷酸序列为：

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b)人工合成枯草芽孢杆菌高效启动子P43、编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽sacB和含编码酿酒酵母小分子泛素样蛋白与猪源脂联素的融合蛋白表达操纵子基因的融合DNA片段P43-sacB-sumo1-adipo(可以是由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成)，其核苷酸序列为：

ggatccggcatggctgaaaattcttacatttattttacatttttagaaatgggcgtgaaaaaaagcgcgcgattatgtaaaatataaagtgatagcggtaccattataggtaagagaggaatgtacacgaattcatgaatatcaaaaagtttgctaaacaagctacagtccttacgttcacgacagctctgcttgctggaggagctacgcaggcttttgctatgggccatcaccatcatcatcacggtagcgcaaatcaagaagaagataaaaagcctggcgatggcggcgcacatattaacctgaaagtcaaaggccaagatggcaatgaagttttctttcgcatcaaacgcagcacacaactgaagaaactgatgaatgcatattgcgatcgccaaagcgttgatatgaatagcattgcatttctgtttgatggccgccgcctgcgcgcagaacagacgccggatgaactggacatggaagatggcgatgaaatcgatgcaatgcttcatcaaaccggtggcatgctgctgctgggcgcagttctgctgctgctggcactgccgagcctgggccaagaaacaacagaaaaaccgggcgcactgctgccgatgccgaaaggcgcatgcgcaggctggatggcaggcattccgggccatccgggccataatggcacaccgggccgcgacggccgcgacggcgttccgggcgaaaaaggcgaaaaaggcgacacaggcctgacaggcccgaaaggcgacacaggcgaaagcggcgttacaggcgttgaaggcccgcgcggctttccgggcattccgggccgcaaaggcgaaccgggcgaaagcgcatatgtttatcgcagcgcatttagcgttggcctggaaacacgcgttacagttccgaatatgccgattcgctttacaaaaattttttataatcaacaaaatcattatgacgttacaacaggcaaatttcattgcaatattccgggcctgtattattttagctttcatattacagtttatctgaaagacgttaaagttagcctgtataaaaaagacaaagcagttctgtttacatatgaccaatatcaagacaaaaatgttgaccaagcaagcggcagcgttctgctgtatctggaaaaaggcgaccaagtttggctgcaagcatatggcgacgaagaaaataatggcgtttatgcagacaatgttaatgacagcatttttacaggctttctgctgtatcataatattgaatagctcgagaaaaataggaaggagctgaccgaacagggcagctcctttcataaagtaaagatctgagctc。

2.猪源脂联素母体基因可在枯草芽孢杆菌表达的载体pZLS-128的构建：

将所述步骤a)中人工合成的基因片段Pglv-sacB-ulp1用BamHI和SacI双酶切，将所述步骤b)中人工合成的基因片段P43-sacB-sumo1-adipo用BamHI和BglII双酶切，依次构建入载体pGJ222，构建成命名为pZLS-128的质粒。

3.重组表达载体pZLS-128在枯草芽孢杆菌WB700中的转化：

优选地，将枯草芽孢杆菌WB700感受态细胞与质粒pZLS-128混合并将混合物转移至2mm电转杯，在2.5kV、5mV条件下电击；之后立即加入1000μl预冷的枯草芽孢杆菌电转恢复培养基RM，于37℃、225rpm条件下恢复培养1h；5000rpm离心后将管底菌体均匀涂布于含有Cm5的LB固体平皿上，培养皿放置于37℃培养至单菌落出现；挑取单菌落置于LB液体培养基振荡培养被提取质粒进行EcoRI和SacI双酶切鉴定和测序鉴定；将鉴定正确的单菌落定义为BZLS128。

4.重组枯草芽孢杆菌BZLS128菌株在摇瓶中的诱导表达：

优选地，将筛选得到重组枯草芽孢杆菌BZLS128菌株的阳性转化子接种到25ml的LB液体培养基中，于30℃、225rpm的条件下振荡培养8～12h至595nm波长处的吸光值(OD595)达到2～4，之后加入5ml质量百分比浓度为30％的麦芽糖溶液进行诱导表达；接着于25℃、225rpm的条件下再继续振荡培养36～48h，12000rpm离心10分钟收集培养液上清，即为获得的猪源脂联素蛋白。

本发明人工设计合成包含有小分子泛素样修饰物(smallubiquitin-relatedmodifier,SUMO)蛋白酶以及猪源脂联素蛋白与SUMO融合的双顺反子表达元件基因，以质粒pZLS-128为大肠杆菌—枯草芽孢杆菌穿梭载体，构建了一个猪源脂联素的重组枯草芽孢杆菌WB700的表达系统。该系统具有优良的质粒稳定性，以及分泌表达的SUMO-脂联素蛋白偶合物能有效地被同样分泌表达的SUMO蛋白酶水解从而释放出具有正常生物学活性的脂联素。SUMO融合表达体系为枯草芽孢杆菌WB700菌株能够分泌具有正常生物学活性所对应的猪源脂联素的构象提供了材料基础。

该系统解决了当前脂联素产业化所面临的一些关键问题：天然提取的脂联素成本太高，产业化困难：脂联素分子量不大，在其它微生物表达体系下容易被降解或难以形成正常生物学活性所对应的构象：分离纯化工艺复杂等。

本发明的有益结果为：

1.表达系统简单：本发明采用了猪源抗菌肽的重组枯草芽孢杆菌WB700表达体系与SUMO融合表达体系，由于融合表达后得到的SUMO—脂联素融合蛋白体不会对宿主菌枯草芽孢杆菌WB700菌株产生毒害作用，因此可以使重组枯草芽孢杆菌WB700菌株持续表达产物，而其生长则不会得到抑制。

2.本发明可用于大规模生产：本发明采用枯草芽孢杆菌WB700表达体系，相对于真核细胞表达系统和病毒表达系统具有生产条件和步骤简单，反应条件易于控制的优点，因此适用于大规模的的生产。

3.生产成本低：本生产方法中的培养基价格低廉，生产所用设备为实验室常规设备，易于操作。

4.生物活性强，无毒害物质：本发明分泌的蛋白质浓度高，生物活性强。

附图说明：

图1为猪源脂联素的Tris-SDS-PAGE分析

其中，横坐标表示的是蛋白电泳的泳道序号，纵坐标表示的是蛋白marker的分子量大小：

1：蛋白marker：分子量(116.0kDa、66.2kDa、45.0kDa、35.0kDa和25.0kDa)；

2：对照组：枯草芽孢杆菌WB700上清冻干样品；

3：实验组：重组枯草芽孢杆菌BZLS128上清冻干样品。

具体实施方式

实施例1

3.重组表达载体pZLS-128在枯草芽孢杆菌WB700中的转化：

将枯草芽孢杆菌WB700感受态细胞与质粒pZLS-128混合并将混合物转移至2mm电转杯，在2.5kV、5mV条件下电击；之后立即加入1000μl预冷的枯草芽孢杆菌电转恢复培养基RM，于37℃、225rpm条件下恢复培养1h；5000rpm离心后将管底菌体均匀涂布于含有Cm5的LB固体平皿上，培养皿放置于37℃培养至单菌落出现；挑取单菌落置于LB液体培养基振荡培养被提取质粒进行EcoRI和SacI双酶切鉴定和测序鉴定；将鉴定正确的单菌落定义为BZLS128。

4.重组枯草芽孢杆菌BZLS128菌株在摇瓶中的诱导表达：

将筛选得到重组枯草芽孢杆菌BZLS128菌株的阳性转化子接种到25ml的LB液体培养基中，于30℃、225rpm的条件下振荡培养8～12h至595nm波长处的吸光值(OD595)达到2～4，之后加入5ml质量百分比浓度为30％的麦芽糖溶液进行诱导表达；接着于25℃、225rpm的条件下再继续振荡培养36～48h，12000rpm离心10分钟收集培养液上清，即为获得的猪源脂联素蛋白。

实施例2

重组枯草芽孢杆菌BZLS128菌株分泌猪源脂联素的Tris-SDS-PAGE鉴定：

枯草芽孢杆菌WB700菌株和重组枯草芽孢杆菌BZLS128菌株的发酵液上清经过冷冻干燥后，使用Tris-SDS-PAGE方法进行蛋白电泳分析及浓度比定。

1.Tris-SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶(分离胶+浓缩胶)制备

2.相关试剂的制备

a)30％聚丙烯酰胺:丙烯酰胺29g和1g甲叉双丙烯酰胺溶于100mLddH₂O中；

b)1×SDS凝胶上样缓冲液：50mmol/LTris-HCl(Ph6.8)，100mmol/L二硫苏糖醇(临用时加入)，2％(m/V)SDS(电泳级)，0.1％溴酚蓝和10％(V/V)甘油；

c)1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：25mmol/LTris，250mmol/L甘氨酸(电泳级)(pH8.3)，0.1％(m/V)SDS；(可配成5×贮存液，在900mL去离子水中溶解15.1gTris碱和94g甘氨酸，然后加入50mL10％(m/V)电泳级SDS贮存液，用去离子水补至1000mL即可)

d)磷酸缓冲液(PBS):NaCL137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO42mmol/L；

e)染色液：25％异丙醇，10％乙酸和0.04％(g/ml)考马斯亮蓝R-250；

f)脱色液：5％乙酸和7.5％甲醇；

g)200mg/mlIPTG:在8ml去离子水中溶解2gIPTG，定溶至10ml，用0.22μm灭菌滤器过滤除菌，分装成1ml小份，贮存于-20℃；

h)10％十二烷基硫酸钠(SDS)：在900ml去离子水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓HCl调节溶液的pH值至7.2，加水定容至1000ml，分装备用；

i)10％过硫酸铵：称取1g过硫酸铵溶于10mL蒸馏水中；

j)1.5mol/LTris(pH8.8)：在800ml去离子水中溶解181.65gTris碱，定溶至1000mL，用浓盐酸调节pH值至8.8；

k)1.5mol/LTris(pH6.8)：在800ml去离子水中溶解181.65gTris碱，定溶至1000mL，用浓盐酸调节pH值至6.8；

l)1mol/L二硫苏糖醇(DTT)：用20ml0.01mol/L乙酸钠溶液(pH:5.2)溶解3.09gDTT，过滤除菌后分装成1mL小份，贮存于-20℃。

3.电泳及分析

电泳槽的内外槽加入1×SDS凝胶上样缓冲液，形成Tris-SDS-PAGE电泳系统，用80v恒电压处理2～3个小时，待溴酚蓝指示剂条带离开凝胶后停止电泳。考马斯亮蓝对胶染色，脱色液脱色，用凝胶成像系统对脱色后的PAGE胶照相：见附图1。

结果显示，重组枯草芽孢杆菌BZLS128菌株能明显分泌表达出26kDa左右的蛋白，与猪源脂联素的理论值一致。

在参照marker标准蛋白条带的基础上，脱色后凝胶经薄层凝胶扫描分析并经band5.0软件进一步分析计算，得出重组枯草芽孢杆菌BZLS128菌株所分泌表达的脂联素的含量为218mg/l。

实施例3

枯草芽孢杆菌WB700菌株的高效转化方法：

1.相关试剂准备

生长培养基(Growthmedium，GM)：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl10g/l，山梨醇0.5M，pH＝7.2；

电转培养基(Electroporrationmedium，EM)：山梨醇0.5M，甘露醇0.5M，葡萄糖10％；

恢复培养基(Recoverymedium，RM)：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl10g/l，山梨醇0.5M，甘露醇0.38M。

2.枯草芽孢杆菌WB700菌株的转化

1)接种枯草芽孢杆菌WB700菌株于3mlLB培养基中，过夜培养；

2)取2.6ml过夜培养物接入40mlGM中，37℃，200rpm培养至OD600＝0.85～0.95；

3)将菌液冰水浴10min，然后5000g，5min，4℃离心收集菌体；

4)用50ml预冷的EM，重新吹悬菌体，5000g，5min，4℃离心去上清，如此漂洗4次；

5)将洗涤后的菌体吹悬于1mlEM中，每EP管分装60μl菌体；

6)向60μl感受态细胞中加入50ngDNA(1～8μl)，冰上孵育2min，加入预冷的电转杯中进行电击；

7)电击完毕取出杯子并立即加入1mlRM，37℃，200rpm，复苏3h后涂板，并于37℃过夜培养。

序列表说明

SEQIDNO.1为Pglv-sacB-ulp1序列，即人工合成含枯草芽孢杆菌麦芽糖诱导的Pglv启动子、编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽(sacB)和编码sumo蛋白酶的表达操纵子基因的融合DNA片段：

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SEQIDNO.2为P43-sacB-sumo1-adipo序列，即人工合成枯草芽孢杆菌高效启动子P43、编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽(sacB)和含编码酿酒酵母小分子泛素样蛋白与猪源脂联素的融合蛋白表达操纵子基因的融合DNA片段：

Claims

1.一种生产猪源脂联素的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

1)可分泌表达sumo蛋白酶的操纵子、可分泌表达酿酒酵母小分子泛素样蛋白与猪源脂联素融合蛋白的操纵子的合成，包括以下步骤：

a)人工合成含枯草芽孢杆菌麦芽糖诱导的Pglv启动子、编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽sacB和编码sumo蛋白酶的表达操纵子基因的融合DNA片段Pglv-sacB-ulp1；

b)人工合成枯草芽孢杆菌高效启动子P43、编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽sacB和含编码酿酒酵母小分子泛素样蛋白与猪源脂联素的融合蛋白表达操纵子基因的融合DNA片段P43-sacB-sumo1-adipo；

2)猪源脂联素母体基因可在枯草芽孢杆菌表达的载体pZLS-128的构建，包括以下步骤：

将所述步骤中a)中人工的DNA片段Pglv-sacB-ulp1用BamHI和SacI双酶切，将所述步骤b)中人工合成的DNA片段P43-sacB-sumo1-adipo用BamHI和BglII双酶切，依次构建入载体pGJ222，构建成命名为pZLS-128的质粒；

3)重组表达载体pZLS-128在枯草芽孢杆菌WB700中的转化；

4)重组枯草芽孢杆菌BZLS-128在摇瓶中的诱导表达。

2.一种如权利要求1所述的生产猪源脂联素的方法，其特征在于所述步骤3)中重组表达载体pZLS-128在枯草芽孢杆菌WB700中的转化包括以下步骤：

3.一种如权利要求1所述的生产猪源脂联素的方法，其特征在于所述步骤4)中重组枯草芽孢杆菌BZLS128菌株在摇瓶中的诱导表达包括以下步骤：

将筛选得到重组枯草芽孢杆菌BZLS128菌株的阳性转化子接种到25ml的LB液体培养基中，于30℃、225rpm的条件下振荡培养8～12h至595nm波长处的吸光值OD595达到2～4，之后加入5ml质量百分比浓度为30％的麦芽糖溶液进行诱导表达；接着于25℃、225rpm的条件下再继续振荡培养36～48h，12000rpm离心10分钟收集培养液上清，即为获得的猪源脂联素蛋白。

4.一种如权利要求1所述的生产猪源脂联素的方法，其特征在于所述步骤a)中人工合成含枯草芽孢杆菌麦芽糖诱导的Pglv启动子、编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽sacB和编码sumo蛋白酶的表达操纵子基因的融合DNA片段Pglv-sacB-ulp1，其核苷酸序列为：

5.一种如权利要求1所述的生产猪源脂联素的方法，其特征在于所述步骤b)中人工合成枯草芽孢杆菌高效启动子P43、编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽sacB和含编码酿酒酵母小分子泛素样蛋白与猪源脂联素的融合蛋白表达操纵子基因的融合DNA片段P43-sacB-sumo1-adipo，其核苷酸序列为：