CN109868281A - 一种利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽-1的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽‑1的方法。首先化学合成得到含有BamHⅠ/XbaⅠ酶切位点及His‑tag标签的重组胰高血糖素样肽‑1目的基因片段，插入带有SamyQ信号肽序列的pHT43载体质粒中，经大肠杆菌DH5α扩增后，筛选阳性克隆，经过测序验证后，将测序正确的质粒大量抽提，经过电转化方法导入枯草芽孢杆菌WB800N宿主中，培养并且经过1mM IPTG诱导表达后，发酵液上清经过Tricine–SDS‑PAGE及Western Blot方法证明重组胰高血糖素样肽‑1（hmGLP‑1）的重组蛋白成功获得表达。本发明通过重组胰高血糖素样肽‑1基因导入肠道益生菌枯草芽孢杆菌中，使之成为能够表达其蛋白的重组菌，为后续制备活菌制剂和进行动物模型实验奠定基础。

Description

一种利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽-1的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽-1的方法。

背景技术

胰高血糖素样肽-1（Glucagon-like peptide-1,GLP-1）是由人体肠道L细胞合成分泌的一种30个氨基酸构成的短肽类激素，它是一种生理性肠降血糖素，可有效促进胰岛素分泌，发挥葡萄糖浓度依赖性降血糖作用。还可抑制胰高血糖素分泌和胰岛细胞凋亡，促进胰岛β细胞增殖，抑制肠胃蠕动和延缓胃排空，减少饮食摄入，明显降低患者空腹和餐后血糖水平，在治疗T2DM方面具有良好的应用前景。但由于人体内存在二肽酰基肽酶Ⅳ(dipeptidyl peptidaseⅣ , DPPⅣ)，可将其分解为无活性的GLP-1(9-37)，导致GLP-1的生物半衰期仅有2分钟左右，大大限制了其临床应用。国内外学者已研发出各种延长半衰期的策略，包括氨基酸点突变、脂肪酸连接修饰、与人血清白蛋白融合或与单克隆抗体的可结晶区(Fc)融合表达、药物持续递送系统及聚乙二醇化修饰等。当前应用于市场上的GLP-1药物主要由两种：DPP-Ⅳ抑制剂（如西格列汀、维格列汀、沙格列汀等）和GLP-1类似物（艾塞那肽、利拉鲁肽等）。对于全球众多的需要药物治疗的糖尿病患者来说，长期的皮下注射价格昂贵，为患者带来了巨大经济及心理负担。此时口服GLP-1类似物就成为药物研究的新热点。

枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis )是一种革兰氏阳性杆菌，美国食品药物管理局（FDA）及我国农业部门批准使用的食品级菌种之一，同时它也是仅次于大肠杆菌的分泌表达外源蛋白的理想宿主之一，具有以下几大优势：良好的生物安全性，无致病性；遗传操作性强，无明显密码子偏爱性；胞内合成蛋白质后，可直接将产物分泌到细胞外培养基中，只需处理发酵上清即可得到目的蛋白；不易形成包涵体，分泌的重组蛋白具有天然构象和生物学活性；发酵条件简单，可应用于大规模工业化生产。目前，已有学者通过枯草芽孢杆菌成功实现了炭疽抗原、肠道病毒71型的结构蛋白VP1、口蹄疫病毒表位嵌合蛋白等外源分泌表达，并且如蛋白酶、α-淀粉酶常用酶已通过枯草芽孢杆菌进行大规模生产并投入商业化使用。

目前，已经有研究团队在大肠杆菌、毕赤酵母菌表达系统成功表达胰高血糖素样肽-1，对其他菌种表达体系方面的研究报道极少，关于胰高血糖素样肽-1在枯草芽孢杆菌中的重组和表达未见文献报道，因此急需一种能够成功表达重组胰高血糖素样肽-1的方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽-1的方法。通过上述方法使得枯草芽孢杆菌菌株能够成功的在细菌外周培养液中表达重组胰高血糖素样肽-1蛋白，在体外可有效抵抗DPPⅣ酶的降解，并且更好的降低2 型糖尿病小鼠血糖水平。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为，一种利用枯草芽孢杆菌高效表达重组胰高血糖素样肽-1的方法，包括如下步骤：

1）选取人胰高血糖素样肽-1，将其氨基酸序列中2号位丙氨酸替换成丝氨酸，26号和34号位点的赖氨酸替换成谷氨酸和天冬氨酸，得到化学合成目的基因片段重组胰高血糖素样肽-1，然后合成重组pHT43-hmGLP-1质粒；

2）将重组质粒转入大肠杆菌DH5α超级感受态，抗性筛选重组质粒，并扩增提取；

3）制备枯草芽孢杆菌感受态细胞，电转化培养单克隆菌落；

4）将单克隆菌落接种到培养基上面，置于摇床中过夜培养，收集菌液，以F1/R1为引物进行PCR扩增；

5）重组枯草芽孢杆菌的鉴定及目的蛋白分泌表达。

本发明采用枯草芽孢杆菌为宿主菌，选择pHT43为表达载体，利用枯草芽孢杆菌的益生菌性质，在其生长过程中可产生枯草菌素、多粘菌素等活性物质，抑制细菌的生长。还可促进有益厌氧菌生长，并且产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑制其它致病菌生长，提高机体免疫球蛋白和抗体水平，促进食物消化吸收。同时它还是一种仅次于大肠杆菌的外源基因高效表达宿主，遗传操作性强，可直接将表达产物分泌到培养上清中，已成功完成多种激素、维生素、酶类等物质的异源表达。

本发明选用的表达宿主为枯草芽孢杆菌WB800N，该菌种特异性缺失八种胞外蛋白酶（nprE aprE epr bpr mpr::ble nprB::bsr Δvpr wprA::hyg cm::neo），较大程度的减轻表达产物的降解。

进一步地，所述目的基因片段的碱基序列如下：CATAGTGAAGGTACCTTTACCAGTGATGTTAGTAGTTATTTGGAAGGTCAGGCGGCGCAGGAATTTATTGCGTGGTTGGTTGATGGTCGC。

进一步地，所述步骤1）中合成重组pHT43-hmGLP-1质粒是通过在目的基因片段的5'端添加BamHⅠ、His-tag标签，3'端添加XbaⅠ得到。

进一步地，所述步骤2）中抗性筛选采用100μg/ml氨苄青霉素。

进一步地，所述步骤4）中使用的培养基为5μg/L氯霉素抗性的LB液体培养基，摇床条件为37℃、220 rpm。

进一步地，所述步骤4）中PCR扩增使用以下引物：

上游引物F1：5’-ttggtaccag ctattgtaac-3’

下游引物R1：5’-gcttcgtcca aaatata-3’。

进一步地，所述步骤3）中电转化条件为取重组质粒pHT43-hmGLP-1加入到枯草芽孢杆菌感受态细菌中，轻柔混匀后置于冰上5分钟，加入无菌预冷的直径2mm电转杯中，电转仪参数设置为2.25KV、5.5ms。

进一步地，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌WB800N。

相对于现有技术，本发明技术方案的有益效果体现在：

本发明通过重组胰高血糖素样肽-1基因导入肠道益生菌枯草芽孢杆菌中，使之成为能够表达其蛋白的重组菌，表达系统稳定，成功实现了重组胰高血糖素样在枯草芽孢杆菌中的高效表达，为后续制备活菌制剂和进行动物模型实验奠定基础。

附图说明

图1为重组胰高血糖素样肽-1（hmGLP-1）的氨基酸序列图；

图2为重组表达载体pHT43-hmGLP-1的结构图；

图3为重组pHT43-hmGLP-1质粒的合成路线示意图；

图4为重组质粒电转化枯草芽孢杆菌后的单克隆筛选图；

图5为重组枯草芽孢杆菌的菌液PCR鉴定图；

图6为重组胰高血糖素样肽-1的Tricine-SDS-PAGE分析图；

图7为重组胰高血糖素样肽-1的WesternBlot分析图。

具体实施方式

以下结合实施例和具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明，但不作为对本发明保护范围的限制。除特别标明外，所用试剂和测试设备均为市售。

本发明实施例中使用的酶和制剂的来源为：目的基因hmGLP-1核酸序列及亚克隆由苏州金唯智公司合成，大肠杆菌DH5α为本实验室自产，质粒pHT43和枯草芽孢杆菌宿主WB800N均购自武汉淼灵生物有限公司，蛋白Marker、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）和氯霉素购自上海生工股份有限公司。

本发明实施例中使用的主要培养基有LB液体培养基、LB固体培养基、生长培养基(GM)、复苏培养基(RM)和电转缓冲液（ETM），其中LB液体培养基供重组质粒克隆时使用，包括酵母提取物0.5%，胰蛋白胨1%，氯化钠1%；LB固体培养基供枯草芽孢杆菌WB800N活化使用，包括酵母提取物0.5%、胰蛋白胨1%、氯化钠1%、琼脂糖1.5%；生长培养基(GM)包括0.5 M山梨醇和LB培养基；复苏培养基(RM)包括LB培养基、0.5M山梨醇和0.38M甘露醇；电转缓冲液(ETM)供灭菌使用，包括0.5M山梨醇、0.5M甘露醇和10%甘油；用于制备枯草芽孢杆菌感受态无抗性；用于培养含有氨苄青霉素抗性质粒的大肠杆菌时，氨苄青霉素质量浓度为100μg/mL；用于培养含有氯霉素抗性质粒的枯草芽孢杆菌时，氯霉素质量浓度为5μg/mL。

实施例1：

1、重组胰高血糖素样肽-1基因的设计与合成

将人胰高血糖素样肽-1的2号位丙氨酸替换成丝氨酸，26号和34号位点的赖氨酸替换成谷氨酸和天冬氨酸，得到重组胰高血糖素样肽-1（hmGLP-1），即化学合成目的基因片段，其氨基酸序列如图1所示，碱基序列(SEQ ID No：1)如下所示：

CATAGTGAAGGTACCTTTACCAGTGATGTTAGTAGTTATTTGGAAGGTCAGGCGGCGCAGGAATTTATTGCGTGGTTGGTTGATGGTCGC。

在目的基因片段的5'端加入限制性内切酶BamHⅠ和His-tag标签， 3'端添加XbaⅠ标签，合成重组pHT43-hmGLP-1质粒，质粒结构如图2所示，合成过程如图3所示。

2、重组表达载体的转化与扩增

将上述质粒化学转化法转进大肠杆菌DH5α超级感受态细胞，采用100μg/ml氨苄青霉素抗性筛选重组质粒，扩增选取阳性克隆测序。

3、枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备与电转化

（1）取保存于-80℃的枯草芽孢杆菌WB800N菌株划线于LB固体培养基中，37℃过夜培养，挑选较小的单菌落，接种于5mL的LB液体培养基中，置于摇床中，37℃、200rpm培养过夜；

（2）次日，取2.5ml的过夜培养菌液转接至50ml的GM培养基中，37℃摇床中以220rpm振荡培养至OD₆₀₀在0.19-0.2之间,继续振荡培养至OD₆₀₀在0.8-1.0左右，冰浴10分钟；

（3）放入预冷的4℃离心机，5000rpm离心10分钟，收集菌体。用10ml预先冰浴的电转缓冲液(ETM)重悬沉淀菌体，4℃条件下5000rpm，离心10分钟。弃上清液，同样方法洗涤菌体4次并重悬于500μl电转缓冲液ETM中，得到枯草芽孢杆菌感受态，在冰上分装成每管60μl的感受态，-80℃保存；

（4）取6μl的重组质粒pHT43-hmGLP-1加入到枯草芽孢杆菌感受态细胞中，轻柔混匀后置于冰上5分钟，加入无菌预冷的直径2mm电转杯中，电转化条件为2.25KV、5.5ms，擦干电转杯后立刻电击；

（5）电击完成后，向电击杯中加入1mL的复苏培养基（RM），恒温37℃、220rpm下培养复苏3h；

（6）均匀涂布于含5μg/L 氯霉素抗性的LB固体培养基平板表面，置于摇床中，37℃过夜培养，直至长出单克隆菌落，如图4所示，本发明的重组pHT43-hmGLP-1质粒完全进入枯草芽孢杆菌，重组枯草芽孢杆菌构建成功。

4、扩增获得碱基序列

将单克隆菌落接种到含5μg/LCm+抗性的LB液体培养基上面，置于摇床中，37℃、220rpm过夜培养，收集菌液，以F1/R1为引物进行PCR扩增：

上游引物F1序列为：5-ttggtaccag ctattgtaac-3’

下游引物R1序列为：5-gcttcgtcca aaatata-3’

PCR扩增条件为：94℃预高温变性5 min； 94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s（30个循环），72℃延伸10min,4℃保存；

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测鉴定，实验结果见图5。

5、重组枯草芽孢杆菌的鉴定及目的蛋白分泌表达

（1）接种重组枯草芽孢杆菌到Cm+（5μg/mL）的LB培养基中，置于摇床中37℃、220 rpm振荡过夜培养；

（2）次日按1%的比例转接扩大培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8左右时，分装三瓶，一瓶作为对照，不加诱导剂，另两瓶分别加入终浓度为0.5mM 和1.0mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），37℃诱导4小时，12000rpm、4℃离心取沉淀菌体和上清液；

（3）向3000K超滤离心管中加入不超过15mL的胞外上清,使用摆桶转子，以最大4000×g转速旋转60分钟，回收浓缩后的上清样本。采用PBS缓冲液洗涤沉淀菌体两次并重新悬浮得到细胞悬液，置入1.5mL离心管中，并加入1mg/mL溶菌酶，超声处理（12w,6x15脉冲，间隔15s）4000g破碎细胞，4℃离心10min，并收集胞外上清和沉淀；

（4）所有样品分别加入1/5体积的5×SDS上样缓冲液，经100℃加热处理后，采用Tricine-SDS-PAGE及Western Blot分析样本中蛋白表达情况，分析结果见图6和图7。

本发明成功构建了携带hmGLP-1基因的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌双穿梭载体，首次实现了重组hmGLP-1在枯草芽孢杆菌中的分泌表达，为后续制备活菌制剂和进行动物模型实验奠定基础。

以上所述今为本发明的优选实施列而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽-1的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）选取人胰高血糖素样肽-1，将其氨基酸序列中2号位丙氨酸替换成丝氨酸，26号和34号位点的赖氨酸替换成谷氨酸和天冬氨酸，得到化学合成目的基因片段重组胰高血糖素样肽-1，然后合成重组pHT43-hmGLP-1质粒；

2）将重组质粒转入大肠杆菌DH5α超级感受态，抗性筛选重组质粒，并扩增提取；

3）制备枯草芽孢杆菌感受态细胞，电转化培养单克隆菌落；

4）将单克隆菌落接种到培养基上面，置于摇床中过夜培养，收集菌液，以F1/R1为引物进行PCR扩增；

5）重组枯草芽孢杆菌的鉴定及目的蛋白分泌表达。

2.根据权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽-1的方法，其特征在于，所述目的基因片段的碱基序列如下：CATAGTGAAGGTACCTTTACCAGTGATGTTAGTAGTTATTTGGAAGGTCAGGCGGCGCAGGAATTTATTGCGTGGTTGGTTGATGGTCGC。

3.根据权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽-1的方法，其特征在于，所述步骤1）中合成重组pHT43-hmGLP-1质粒是通过在目的基因片段的5'端添加BamHⅠ、His-tag标签，3'端添加XbaⅠ得到。

4.根据权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽-1的方法，其特征在于，所述步骤2）中抗性筛选采用100μg/ml氨苄青霉素。

5.根据权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽-1的方法，其特征在于，所述步骤4）中使用的培养基为5μg/LCm+抗性的LB液体培养基，摇床条件为37℃、220 rpm。

6.根据权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽-1的方法，其特征在于，所述步骤4）中PCR扩增使用以下引物：

上游引物F1：5’-ttggtaccag ctattgtaac-3’

下游引物R1：5’-gcttcgtcca aaatata-3’。

7.根据权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽-1的方法，其特征在于，所述步骤3）中电转化条件为取重组质粒pHT43-hmGLP-1加入到枯草芽孢杆菌感受态细菌中，轻柔混匀后置于冰上5分钟，加入无菌预冷的直径2mm电转杯中，电转仪参数设置为2.25KV、5.5ms。

8.根据权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽-1的方法，其特征在于所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌WB800N。