CN102660491A - 高效表达重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

高效表达重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌及其构建方法和应用 Download PDF

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CN102660491A CN2012101555395A CN201210155539A CN102660491A CN 102660491 A CN102660491 A CN 102660491A CN 2012101555395 A CN2012101555395 A CN 2012101555395A CN 201210155539 A CN201210155539 A CN 201210155539A CN 102660491 A CN102660491 A CN 102660491A
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Abstract

本发明公开了一种高效表达重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌，该基因工程菌是携带重组质粒的大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)，所述的重组质粒是含人胰高血糖素样肽-1（1-37）的质粒pET32a(+)。本发明还公开了该基因工程菌的构建方法：以pET32a(+)-GLP-1(7-37)为模板，根据GLP-1(1-37)基因的碱基设计引物，PCR扩增获得基因GLP-1(1-37)，经酶切，插入质粒pET32a(+)中，构建重组质粒pET32a(+)-GLP-1(1-37)，并转化大肠杆菌获得。本发明所制备的重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）具有良好的降血糖作用。本发明方法具有生产重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）成本低、重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）表达量高、纯化步骤简便，易于操作，得率高等优点。

Description

高效表达重组人胰高血糖素样肽-1(1-37)的基因工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及一种高效表达重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
截短型GLP-1（7-37）是胰高血糖素原翻译加工后的产物，并由小肠L细胞分泌，它不仅能够依赖葡萄糖刺激胰岛素的分泌，抑制胰高血糖素的分泌从而降低餐后血糖水平，而且诱导β细胞的增殖和胰岛新生、抑制β细胞的凋亡，此外，GLP-1(7-37)还能抑制胃蠕动，减少食欲。GLP-1（7-37）的这些功能使其成为治疗2型糖尿病的有效药物。胰高血糖素原在小肠中经加工先产生GLP-1（1-37），然后在特定的蛋白酶的作用下切除上游6个氨基酸残基从而产生GLP-1（7-37）。目前大部分研究针对截短型GLP-1（7-37）的作用，GLP-1（1-37）的功能仍然不明确。最近，有研究发现GLP-1（1-37）能够抑制趋化因子诱导的人CD-4淋巴细胞的迁移，也有研究证明GLP-1（1-37）能够将胎鼠小肠上皮细胞转化成分泌胰岛素的细胞。然而GLP-1（1-37）能否调节血糖这一功能还不清楚。
本发明通过研究发现，提出一种重组人GLP-1（1-37）能够激活GLP-1受体（GLP-1R），对动物体内血糖具有调节作用。另外，要研究重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）的功能，则需要合成重组人胰高血糖素样肽-1（1-37），目前国外对多肽的制备多采用化学合成的方法，其存在着难度大、合成成本高、纯化困难等缺陷。用现有方法制备的产品，价格昂贵。鉴于此，本发明提出一种通过基因工程的方法合成产量高、纯度较高的GLP-1（1-37），合成方法简便、原料便宜、适于大规模生产。
发明内容
为生产低成本的重组人胰高血糖素样肽-1（1-37），首先得找到并构建一种高效表达人胰高血糖素样肽-1（1-37），即能生产人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌。
本发明的目的之一是提出一种高效表达重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌。该基因工程菌是携带重组质粒的大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)，所述重组质粒是含人胰高血糖素样肽-1（1-37），即GLP-1(1-37)基因的质粒pET32a(+)。
其中，所述重组质粒是pET32a(+)-PT7-TrxA-6×His-GLP-1(1-37)，PT7是所述质粒pET32a(+)的启动子；TrxA是硫氧还蛋白；6×His是组氨酸纯化标签。
本发明的目的之一是提供一种高效表达重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌的构建方法。本发明通过采用以下技术方案解决以上技术问题。根据GLP-1(1-37)的氨基酸序列，设计引物，通过PCR扩增获得GLP-1(1-37) DNA序列，经双酶切，插入质粒pET32a(+)，构建成重组质粒pET32a-GLP-1(1-37)，转化大肠杆菌，获得高效表达重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌。
本发明所述高效表达重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌的构建方法，包括以下具体操作步骤：
第一步  扩增获得GLP-1(1-37) DNA片段
委托专业的生物技术公司通过化学合成方法合成如下碱基序列：P1-上游引物，引入GLP-1(1-6)基因序列，P2-上游引物，引入Bgl II酶切位点和肠激酶EK位点，P3-下游引物，引入Hind III酶切位点和终止密码子TAA。
P1-上游引物（39bp）序列为：
5’-CATGATGAATTTGAACGCCATGCCGAAGGCACCTTTACC-3’
GLP-1(1-6)基因序列
   P2-上游引物（43bp）序列为：
5’- GGAGATCTGGACGACGACGACAAGCATGATGAATTTGAACGCC-3’
          Bgl II酶切位点   肠激酶EK位点
   P3-下游引物（32bp）序列为：
5’- GGAAGCTTGTTAGCCTCTGCCTTTCACCAGCC-3’
        Hind III酶切位点 终止密码子
以质粒pET32a(+)-GLP-1(7-37)为模板，加入P1-上游引物和P3-下游引物，使用Ex Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，用DNA纯化试剂盒纯化回收反应产物，然后以纯化的基因片段为模板，加入P2-上游引物和P3-下游引物进行再次PCR扩增，反应产物再用DNA纯化试剂盒回收，最终获得含有Bgl II、Hind III、EK位点的GLP-1(1-37) DNA片段,序列如下：
Figure 4491DEST_PATH_IMAGE001
。
第二步  构建含人胰高血糖素样肽-1（1-37）基因序列的基因工程菌
用两种限制性内切酶双酶切第一步获得的GLP-1（1-37）DNA片段，所述的两种限制性内切酶是Bgl II 和Hind III，纯化回收小片段，用同样两种限制性内切酶双酶切质粒pET32a(+)，纯化回收大片段，使用T4 DNA连接酶连接上述回收的小片段和大片段，得到含GLP-1(1-37) DNA片段的重组质粒pET32a(+)-GLP-1(1-37)，将重组质粒pET32a(+)-GLP-1(1-37) 转化到大肠杆菌DH5α，制得含人胰高血糖素样肽-1（1-37）基因序列，即GLP-1(1-37) DNA序列的基因工程菌，将该基因工程菌委托专业的生物技术公司测序，证实该基因工程菌含完整的重组GLP-1(1-37)基因片段。
第三步  构建高效表达人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌
从第二步构建好的基因工程菌抽提重组质粒pET32a(+)-GLP-1(1-37)，转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得到高效表达的人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌。
上述构建涉及到的质粒pET32a(+)、大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)，限制性内切酶Bgl II、Hind III、Ex Taq DNA聚合酶和T4 DNA 连接酶均可从市场购得。委托合成所述的碱基序列的生物技术公司是上海英骏生物技术有限公司，委托测序的生物技术公司是上海铂尚生物技术有限公司。
本发明的目的之一是提出一种用所述基因工程菌生产人胰高血糖素样肽-1（1-37）的方法，具体操作步骤包括：
第一步  液体培养
将上述构建好的高效表达人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌在LB液体培养基中培养至OD600nm=0.6～0.8时，加入终浓度为0.6～1.0 mM的IPTG进行诱导表达4 h，生产和积累可溶性表达的人胰高血糖素样肽-1（1-37）融合蛋白。
第二步  纯化制得的人胰高血糖素样肽-1（1-37）融合蛋白
离心收集菌体，用缓冲液重悬菌体，超声破菌后，离心收集上清，进行亲和层析，收集人胰高血糖素样肽-1（1-37）的融合蛋白组分，用截留分子量为10KDa Amicon Ultra-15超滤管将蛋白浓缩至2～5 mg/mL。
第三步  制备重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）
用肠激酶EK酶解人胰高血糖素样肽-1（1-37）融合蛋白，25℃降解12h，终止反应，再次进行亲和层析，收集穿透峰，冷冻干燥，获得重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）。
本发明的目的之一是提供重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）在制备预防或治疗糖尿病的药物中作药物活性成分的应用。
本发明的目的之一是提供一种药物组合物，所述组合物含有有效量的重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）以及药学上可接受的成分。
本发明的优点包括以下方面：
通过本发明基因工程技术的方法生产重组人胰高血糖素样肽-1（1-37），比化学合成的方法生产重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）成本低；
通过本发明基因工程技术的方法构建含人胰高血糖素样肽-1（1-37）基因的基因工程菌，大大提高了人胰高血糖素样肽-1（1-37）的表达量；
只要进行一次亲和层析，便可从发酵液中得到较纯的人胰高血糖素样肽-1（1-37）融合蛋白，纯化步骤简便，比传统技术的多次层次更易于操作；
只要进行一次酶解便能得到重组人胰高血糖素样肽-1（1-37），纯化极为简便，得率高；
通过基因工程技术的方法生产的重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）具有降低血糖水平的作用。
因而用本发明基因工程菌生产重组人胰高血糖素样肽-1（1-37），产量高，纯化工艺简便，生产成本较低，本发明制备得到的人胰高血糖素样肽-1（1-37）具有降糖生物学活性。 
附图说明
图1 是重组质粒pET32a(+)-GLP-1(1-37)的构建及GLP-1(1-37)表达纯化的示意图。
图2 是重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）的分离纯化和酶切结果图。
图3 是重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）的降血糖活性图。其中，图3（A）所示为腹腔注射糖耐量折线图，图3（B）所示为腹腔注射糖耐量曲线下面积图。
图4是GLP-1激动GLP-1R的检测结果图。其中，图4（A）所示为不同浓度的GLP-1（1-37）对GLP-1受体的激活率，图4（B）所示为不同浓度的GLP-1(7-37)对GLP-1受体的激活率。
具体实施方式
以下结合附图和实施例进一步详细说明本发明。说明书和实施例中凡未注明具体条件的实验方法，按常规条件进行。
实施例1构建一种高效表达人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌
第一步  GLP-1(1-37) DNA序列的扩增
委托专业的生物技术公司化学合成如下碱基序列：P1—上游引物，引入GLP-1(1-6)基因序列，P2-上游引物，引入Bgl II酶切位点和肠激酶EK位点，P3-下游引物，引入Hind III酶切位点和终止密码子TAA。
P1（39bp）：
5’-CATGATGAATTTGAACGCCATGCCGAAGGCACCTTTACC-3’
GLP-1(1-6)基因序列
   P2（43bp）：
5’- GGAGATCTGGACGACGACGACAAGCATGATGAATTTGAACGCC-3’
           Bgl II酶切位点  肠激酶EK位点
   P3（32bp）：
5’- GGAAGCTTGTTAGCCTCTGCCTTTCACCAGCC-3’
        Hind III酶切位点 终止密码子
以质粒pET32a(+)-GLP-1(7-37)为模板，加入引物P1和P3，使用Ex Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，反应产物用DNA纯化试剂盒纯化回收，然后以纯化的基因片段为模板，加入P2和P3进行再次PCR扩增，反应产物再用DNA纯化试剂盒回收，最终获得含有Bgl II、Hind III、EK位点的GLP-1(1-37) DNA片段。两次PCR的反应体系如下：
Figure 212750DEST_PATH_IMAGE002
两次PCR反应程序为：
第二步  构建含人胰高血糖素样肽-1（1-37）基因序列的基因工程菌
用两种限制性内切酶双酶切第一步获得的GLP-1（1-37）DNA片段，所述的两种限制性内切酶是Bgl II 和Hind III，纯化回收小片段，即含有GLP-1（1-37）的基因片段，用同样两种限制性内切酶双酶切质粒pET32a(+)，纯化回收大片段，即pET32a(+)被酶切后较长的基因片段，使用T4 DNA连接酶连接上述回收的小片段和大片段，得到含GLP-1(1-37) DNA片段的重组质粒pET32a(+)-GLP-1(1-37)，将重组质粒pET32a(+)-GLP-1(1-37) 转化到大肠杆菌DH5α，制得含人胰高血糖素样肽-1（1-37）基因序列，即GLP-1(1-37) DNA序列的基因工程菌，将该基因工程菌委托专业的生物技术公司测序，证实该基因工程菌含完整的重组GLP-1(1-37)基因片段。
第三步  构建高效表达人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌
从第二步构建好的基因工程菌抽提重组质粒pET32a(+)-GLP-1(1-37)，转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得到高效表达的人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌，如图1所示。
实施例2  一种高效表达人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌生产人胰高血糖素样肽-1（1-37）
本实施例以下所述的亲和层析介质为NTA-0树脂，购自Novagen公司，下述的肠激酶EK，购自NEB公司。
第一步  液体培养
将实施例1中构建好的基因工程菌接种于20mL含100μg/mL Amp的LB培养基中，37℃，210 r/min，培养过夜，按4%的体积将菌液接种于200mL含100μg/mL Amp 的LB培养基，培养至菌液OD600=0.6～0.8时，取1mL菌液留样作为诱导前（见附图2的2），剩余的菌液中加入终浓度为0.6～1.0mM的IPTG诱导4h，取1mL菌液留样作为诱导后（见附图2的3），菌液经7000 r/min，4℃离心10-15min收集菌体。超声波破碎菌体，离心收集上清（见附图2的4）。
第二步 纯化制得人胰高血糖素样肽-1（1-37）融合蛋白
上清用亲和层析柱分离纯化得融合蛋白TrxA-GLP-1(1-37)。用五倍NTA体积的NTA-0 Buffer平衡层析柱。将样品加入到层析柱中，分别用5倍NTA体积的NTA-0，NTA-20，NTA-40，NTA80，NTA100，NTA200，NTA-200，NTA-1000 Buffer洗脱，分别收集穿透液和各洗脱液，用SDS-PAGE分析蛋白质洗脱情况，将含有融合蛋白TrxA-GLP-1(1-37)的洗脱液用截留分子量为10KDa的超滤管去盐浓缩。见附图2的5。
第三步  制备人胰高血糖素样肽-1（1-37）
融合蛋白TrxA-GLP-1(1-37) 用肠激酶EK酶切，25℃反应12h。见附图2的6。酶切产物用亲和层析柱分离，收集穿透峰和NTA-0的洗脱峰，将这两种洗脱液用截留分子量为3KDa的超滤管进行脱盐和浓缩。见附图2的7。
本实施例实验结果如图2所示，其中，1为标准蛋白质分子Marker；2为携带重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）基因工程菌诱导前；3为携带重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）基因工程菌诱导后；4为携带重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）基因工程菌破菌后的上清；5为携带重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）的融合蛋白；6为重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）经肠激酶EK酶解；7为纯化后的重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）。
实施例3  人胰高血糖素样肽-1（1-37）腹腔给药的降血糖作用
实验材料与方法：
雌性健康昆明小鼠（清洁级，上海斯莱克实验动物有限公司）；
40%葡萄糖溶液，0.9% NaCl溶液，人胰高血糖素样肽-1（1-37）；
血糖测试仪、血糖试纸条（上海新立医疗器械有限公司）；
一次性1mL无菌注射器（上海康德莱企业发展集团有限公司）；
雌性健康昆明小鼠禁食16 h，分为4组（n=8）。1，生理盐水对照组；2-4，人胰高血糖素样肽-1（1-37）给药组，给药剂量分别为6 nmol/kg，12 nmol/kg、24 nmol/kg。给药组注射250μL 40%葡萄糖溶液和不同剂量的人胰高血糖素样肽-1（1-37），记此时为零时刻。分别于15、30、45、60分钟进行小鼠尾静脉取血10μL，用血糖测试仪测定血糖浓度，以检测人胰高血糖素样肽-1（1-37）降血糖作用。生理盐水对照组只注射葡萄糖和生理盐水，不给予人胰高血糖素样肽-1（1-37），按相同时间间隔测定血糖浓度。
结果如图3（A）和（B）所示，所示数值均为n=8的均值。其中，Control为生理盐水对照组；24nmol/kg、12nmol/kg、6nmol/kg为给药剂量分别是24nmol/kg、12nmol/kg、6nmol/kg的人胰高血糖素样肽-1（1-37）给药组。与生理盐水对照组相比，在给药后60分钟之内，人胰高血糖素样肽-1（1-37）给药组能降低小鼠血糖，如图3（B）显示：给药剂量为6 nmol/kg时，与对照组相比，有显著性差异（P < 0.01），给药剂量为12 nmol/kg和24 nmol/kg，与对照组相比，有极显著性差异（P< 0.001），结果说明本发明人胰高血糖素样肽-1（1-37）降糖活性是剂量依赖性的。
实施例4 人胰高血糖素样肽-1（1-37）对GLP-1R的激动作用
实验材料与方法：
HEK293细胞系（ATCC，稳定表达GLP-1R和由cAMP驱动的荧光素酶报告基因）；
荧光素酶活性检测试剂盒（Promega）；
Envision 2101多功能微孔板酶标仪（PerkinElmer）；
将稳定表达GLP-1R和荧光素酶报告基因的HEK293细胞以50000个/孔的细胞量，100 μL/孔接种于96孔培养板内，在10% FBS 高糖DMEM，37?C、5% CO2条件下培养24小时。将不同浓度的GLP-1(1-37)与HEK293细胞孵育，以GLP-1(7-37)作为阳性对照，37?C、5% CO2条件下培养5小时，加入荧光素酶活性检测试剂，通过Envision2101 多功能微孔板酶标仪检测。结果如图4（A）显示：GLP-1(1-37)的EC50为0.12nmol/L，仅为GLP-1(7-37) EC50值（图4（B））的1/10，表明人胰高血糖素样肽-1（1-37）是一种GLP-1R强激动剂。
实施例5 包含GLP-1(1-37)的组合物
取0.6mg通过DNA重组技术制备的GLP-1(1-37)，溶解于2mL去离子水中；另取60mg甘露醇，溶解于1mL去离子水中；将二者混匀即为GLP-1(1-37)与甘露醇的组合物，其中含0.2mg/mL的GLP-1(1-37)以及20mg/mL的甘露醇。甘露醇作为一种常用的制剂成分对药效并无影响，上述包含GLP-1(1-37)的组合物具有与GLP-1(1-37)相同的降血糖作用。
本发明的保护内容不局限于以上实施例，在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
<110> 华东师范大学
<120> 高效表达重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌及其构建方法和应用
 
<160> 4
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 1
5’-CATGATGAATTTGAACGCCATGCCGAAGGCACCTTTACC-3’
 
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 2
5’- GGAGATCTGGACGACGACGACAAGCATGATGAATTTGAACGCC-3’
 
 
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 3
5’- GGAAGCTTGTTAGCCTCTGCCTTTCACCAGCC-3’
 
 
<210> 4
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 4
Figure 944481DEST_PATH_IMAGE002
 

Claims (6)

1.一种高效表达重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是携带重组质粒的大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)，所述重组质粒是含人胰高血糖素样肽-1（1-37）的质粒pET32a(+)。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述重组质粒是pET32a(+)-PT7-TrxA-6×His-GLP-1(1-37)，其中，PT7是所述质粒pET32a(+)的启动子；TrxA是硫氧还蛋白；6×His是组氨酸纯化标签。
3.一种根据权利要求1或2所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步  扩增获得GLP-1(1-37)DNA片段
通过化学合成方法合成如下碱基序列：P1-上游引物，引入GLP-1(1-6)基因序列，P2-上游引物，引入Bgl II酶切位点和肠激酶EK位点，P3-下游引物，引入Hind III酶切位点和终止密码子TAA；所述P1-上游引物、P2-上游引物、P3-下游引物序列如下：
P1-上游引物：5’-CATGATGAATTTGAACGCCATGCCGAAGGCACCTTTACC-3’
P2-上游引物：5’-GGAGATCTGGACGACGACGACAAGCATGATGAATTTGAACGCC-3’
P3-下游引物：5’-GGAAGCTTGTTAGCCTCTGCCTTTCACCAGCC-3’
以质粒pET32a(+)-GLP-1(7-37)为模板，加入所述P1-上游引物和P3-下游引物，使用Ex Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，用DNA纯化试剂盒纯化回收反应产物，然后以纯化的基因片段为模板，加入P2-上游引物和P3-下游引物进行再次PCR扩增，反应产物再用DNA纯化试剂盒回收，获得含有Bgl II、Hind III、EK位点的GLP-1(1-37) DNA片段；
第二步  构建含人胰高血糖素样肽-1（1-37）基因序列的基因工程菌
用限制性内切酶Bgl II 和Hind III双酶切第一步获得的所述GLP-1（1-37）DNA片段，纯化回收小片段，用限制性内切酶Bgl II 和Hind III双酶切质粒pET32a(+)，纯化回收大片段，使用T4 DNA连接酶连接所述回收的小片段和大片段，得到含GLP-1(1-37) DNA片段的重组质粒pET32a(+)-GLP-1(1-37)；将重组质粒pET32a(+)-GLP-1(1-37) 转化到大肠杆菌DH5α，制得含人胰高血糖素样肽-1（1-37）基因序列的基因工程菌，经测序证实所述基因工程菌含完整的重组GLP-1(1-37)基因片段；
第三步  构建高效表达人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌
从第二步构建好的基因工程菌抽提重组质粒pET32a(+)-GLP-1(1-37)，转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得到高效表达的人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌。
4.一种用权利要求1或2所述的基因工程菌生产重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步  液体培养
将所述高效表达人胰高血糖素样肽-1（1-37）的基因工程菌在LB液体培养基中培养至OD600nm=0.6～0.8时，加入IPTG使其终浓度为0.6～1.0 mM进行诱导表达4 h，生产和积累可溶性表达的人胰高血糖素样肽-1（1-37）融合蛋白；
第二步  纯化制得的人胰高血糖素样肽-1（1-37）融合蛋白
离心收集菌体，用缓冲液重悬菌体，超声破菌后，离心收集上清，进行亲和层析，收集人胰高血糖素样肽-1（1-37）的融合蛋白组分，用截留分子量为10KDa Amicon Ultra-15超滤管将蛋白浓缩至2-5 mg/mL；
第三步  制备重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）
用肠激酶EK酶解人胰高血糖素样肽-1（1-37）融合蛋白，25℃降解12h，终止反应，再次进行亲和层析，收集穿透峰，冷冻干燥，获得重组人胰高血糖素样肽-1（1-37）。
5.根据权利要求4所述方法制备的重组人胰高血糖素样肽-1(1-37)在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
6.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有有效量的根据权利要求4所述方法制备的人胰高血糖素样肽-1(1-37)，以及药学可接受的成分。
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