CN103344773A - 一种胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂及检测方法和试剂盒 - Google Patents
一种胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂及检测方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，其主要组份及含量如下：每100μl的检测试剂中：基因重组GLP-1受体20μg；二肽基肽酶-4抑制剂占血浆样本重量的1%；三磷酸腺苷480μg；三磷酸鸟苷10μg；3-异丁基1-甲基黄嘌呤0.5mg；膜反应液100μl。本发明检测试剂中的GLP-1受体由基因重组产生，便于纯化并能降低检测试剂的批间差异；同时，以GLP-1受体作为捕获GLP-1的探针，不仅提高了检测的灵敏性，同时可直接测定其生物活性，灵敏度高、实用性强。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物检测试剂，尤其是一种胰高血糖素样肽-1(GLP-1)生物学活性检测试剂及检测方法和试剂盒。
背景技术
糖尿病是在多基因遗传基础上，加上环境因素、自身免疫的作用，通过未完全阐明的机制，引起胰岛素的分泌障碍和胰岛素生物学效应不足，导致以高血糖症为基本生化特点的糖、脂肪、蛋白质、水电解质代谢紊乱的一组临床综合征。典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等“三多一少”症状，其慢性并发症主要是特异和非特异的微血管病变、末梢神经病变。目前糖尿病已成为继肿瘤及心脑血管疾病后第3位主要的非传染性疾病，WHO预测到2030年全世界糖尿病患者将超过3.6亿。糖尿病治疗主要围绕如何控制血糖升高，而现有纠正高血糖治疗措施并不能纠正糖尿病原发病理生理改变即β细胞功能缺陷。近年研究发现，2型糖尿病患者肠促胰岛素激素对胰岛素的刺激作用明显降低，其原因可能是肠促胰岛素激素的浓度低或作用抵抗。因此，GLP-1将成为2型糖尿病治疗重要环节。
GLP-1是由末端空肠、回肠和结肠的Langerhans细胞（L细胞）分泌的一种由30个氨基酸组成的短肽激素，是胰高血糖素原基因转录翻译后的产物。肠腔内营养物质如糖、脂肪等可直接刺激肠腔分泌GLP-1。GLP-1基因表达具有组织特异性，主要表达在胰腺胰岛细胞、小肠的L细胞以及下丘脑。人体内有活性的GLP-1有两种形式，分别为GLP-1（7-36）NH2和GLP-l（7-37）NH2，其中血循环中80％以上为GLP-l（7-36）NH2。在人体内GLP-1能被二肽酰基肽酶特异性识别，导致GLP-1在血浆中的半衰期短于2min，这一降解过程主要是在肝脏完成，最后通过肾脏排泄；同时，在正常生理状态下肾外组织协助肾脏清除GLP-l。GLP-1通过与GLP-1受体结合后发挥葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌作用，即高血糖时才能发挥作用，这种生理特性使GLP-1具有不会造成低血糖的优势。GLP-1能够促进胰岛素的分泌，刺激胰岛β细胞增殖分化、抑制β细胞凋亡，从而起到保护胰岛β细胞的作用。此外，GLP-1还对心血管具有保护作用，并且能够营养神经细胞。
由于GLP-1在控制和调控血糖中的重要地位，且其降糖作用依赖于血糖浓度，通过这样途径控制血糖不存在导致低血糖的风险，为此，药学领域的专家已经开发GLP-1的类似物，如：艾塞那肽，利拉鲁肽等。检测患者血浆中GLP-1水平，可指导临床正确使用GLP-1类似物。
然而，国内外检测GLP-1主要是通过酶联免疫吸附试验和化学发光免疫测定技术，目前国内尚不能生产临床实用商品化试剂，进口试剂盒不但价格昂贵、检测成本高，而且操作繁琐。同时，基于免疫学原理建立的测定方法，只能测定GLP-1免疫活性，而不能测定其生物活性，但GLP-1在体内以生物活性发挥生理和病理作用。而且，目前GLP-1检测试剂盒灵敏度低，只能用于科研而不适用于临床检验的缺陷。
通过检索，发现与本发明专利申请相关的如下专利公开文献：
1、人胰高血糖素样肽-1调节剂及其在治疗糖尿病和相关病症中的用途（CN101400699），本发明提供新的人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)-受体调节剂，其具有类似于或优于天然GLP-1肽的生物活性，因而可用于治疗或预防与GLP活性相关的疾病或病症。此外，本发明提供新的化学修饰的化合物，其不但在II型糖尿病中刺激胰岛素的分泌，而且还产生其它有益的促胰岛素响应。这些合成的肽GLP-1受体调节剂对溶蛋白性裂解表现出提高的稳定性，这使其成为理想的用于口服或肠胃外给药的治疗候选物。本发明的化合物在糖尿病的功效模型中显示出期望的药物动力学性质和期望的效能。
2、胰高血糖素样肽-1衍生物及其制药用途（CN101868476A），本发明的GLP-1衍生物包含修饰的GLP-1(7-37)序列，其具有总共2-12个氨基酸修饰，包括Glu22和Arg26，在18、20、23、30、31、34、36、37或39位被白蛋白结合残基衍生化或PEG化。这些化合物可用于治疗或预防2型糖尿病和相关疾病。所述化合物是有效的、稳定的，具有长半衰期、结合白蛋白的高亲和力和/或结合GLP-1受体(GLP-1R)的胞外结构域的高亲和力，所有这些都与获得长效的、稳定的且有活性的并有可能每周给予1次的GLP-1衍生物的总体目标潜在相关。
3、胰高血糖素样肽-1突变体多肽及其制备方法、药物组合物和其应用（CN102363633A），本发明公开了一种胰高血糖素样肽-1突变体多肽及其制备方法、药物组合物和其应用，所述突变多肽由胰高血糖素样肽-1突变体N末端添加含有Cys的延长多肽而成，并且所述突变多肽自身折叠成二硫键，所述胰高血糖素样肽-1突变多肽用于制备治疗糖尿病、治疗和/或预防肥胖症的药物组合物。针对临床上GLP-1类似物在体内存留时间较短，需要每天注射给药的缺限，提供一种半衰期较长的GLP-1突变体多肽，该GLP-1突变体多肽半衰期较长，不需要每天给患者注射，能够有效地提高患者的依从态度。
通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献有本质的不同。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术的不足之处，提供一种灵敏度高、实用性强、不仅能够辅助临床诊断血糖升高的原因，而且能够更好地指导临床应用GLP-1类似物药物的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)生物学活性检测试剂及检测方法和试剂盒，该检测试剂主要用于检测2型糖尿病患者血清（或血浆）中胰高血糖素样肽-1的生物学活性。
本发明实现目的的技术方案如下：
一种胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，其主要组份及含量如下：
每100μl的检测试剂中：
基因重组GLP-1受体 20μg；
二肽基肽酶-4抑制剂 占血浆样本重量的1%；
三磷酸腺苷 480μg；
三磷酸鸟苷 10μg；
3-异丁基1-甲基黄嘌呤 0.5mg；
膜反应液 100μl。
而且，所述的GLP-1受体的制备步骤如下：
⑴真核细胞GLP-1受体表达
①根据人GLP-1受体的序列设计引物，5′端引入BglII酶切位点和Kozok序列，3′端引入XhoI酶切位点和终止密码；5’端引物序列见序列1，3’端引物序列见序列2；
②用PCR方法扩增DNA片段，模板来自胎儿正常胰岛组织的cDNA文库，反应条件为：
94℃，30s；
60℃，20s；
72℃，90s；
25个循环后，72℃延伸7min；
③反应结束后，凝胶电泳提取PCR片段（1.4Kb），分别用BglII和XhoI消化PCR产物并用QIAGEN Plasmid Mini Kits纯化DNA片段；使用NheI和XhoI消化质粒pcDNA3.1(+)(5.4kb)；
④按照DNA的重量比为1:5-10的比例将PCR片段和质粒片段在DNA连接酶的作用下连接起来，将新构建的质粒转入Ecoli DH5α细菌中；
⑤通过氨苄青霉素筛选步骤④中转入Ecoli DH5α的细菌，挑取单菌落，PCR鉴定后，提取纯化重组质粒；
⑥使用电穿孔将重组质料转染CHO细胞株，用G418筛选细胞株，扩增并提取蛋白质，确定该细胞株表达GLP-1受体，液氮冻存备用；
⑵提取表达GLP-1受体细胞膜的过程
①向洗涤细胞中加入harvesting缓冲液，在温箱中孵育后，离心，弃去上清液；
②将离心后的沉淀重新悬浮，将其在冰上孵育后破碎细胞，得细胞液；
③将步骤②中细胞液离心；将沉淀重新悬浮，再向其中加入蛋白质，最终调整为2mg/mL，即得GLP-1受体。
而且，所述的二肽基肽酶-4抑制剂为磷酸西他列汀。
而且，所述的膜反应液的组成成份及重量份数g/L为：
余量为双蒸水；
pH=7.4。
而且，所述的膜反应液的组成成份及重量份数g/L为：
余量为双蒸水；
pH=7.4。
一种胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂盒，包括权利要求上述的检测试剂。
一种胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂的检测方法，步骤如下：
⑴加入GLP-1受体、膜反应液、待测标本及GLP-1标准品后，于30℃振荡下，孵育5-10min；同时设定自身对照；利用GLP-1系列标准品绘制标准曲线；
⑵吸取步骤⑴中反应液加入cAMP酶联免疫吸附试验试剂盒微孔板中，并向微孔板中加入样本稀释液及辣根过氧化物酶标记的检测抗体，使待检测的cAMP与酶标抗体结合；
其中，反应液体、样本稀释液和辣根过氧化物酶标记的检测抗体的体积比为：1：4：10。
⑶洗去未结合的酶标抗体后加入底物TMB显色，反应完成后，测定反应GLP-1的量；
其中，各物质的添加量均按照权利要求1的配比。
本发明的有益效果和优点是：
1、本发明检测试剂组成成份中的GLP-1受体由基因重组产生，便于纯化并能降低检测试剂的批间差异；同时，以GLP-1受体作为捕获GLP-1的探针，不仅提高了检测的灵敏性，同时也可直接测定其生物活性，灵敏度高、实用性强。
2、本发明胰高血糖素样肽-1(GLP-1)生物学活性检测方法不仅可以提高GLP-1检测的灵敏度，能够监测患者血清（或血浆）中GLP-1动态变化，而且方法简单、快速，并适合用于临床GLP-1的体外检测，辅助临床对血糖升高原因进行鉴别，并且对指导临床应用GLP-1类似物药物也具有重要的意义。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明建立一种基于受体-配体结合测定GLP-1生物学活性方法和相应检测试剂及试剂盒。本发明克隆GLP-1受体的目的基因，通过基因重组技术建立表达GLP-1受体的细胞系，从而获得纯化的GLP-1受体，待测血清（或血浆）中的GLP-1与细胞膜上的GLP-1受体结合，受体被激活产生第二信使cAMP，用商品化的cAMP试剂盒检测上清中cAMP的含量，从而反映待检血清（或血浆）中GLP-1的生物学活性。同时设定自身对照，以排除血清（或血浆）中所含的cAMP的量。
下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
一、溶液配制
⑴膜反应液的配制
充分溶解后，用HCl或NaOH调pH至7.4，加ddH2O定容至1L；
⑵牛血清白蛋白溶液
BSA（牛血清白蛋白） 2.4g；
ddH2O（双蒸水） 50mL；
充分溶解后加ddH2O定容至100mL；
⑶HBS液的配制 pH7.4
NaCl（氯化钠） 4.5g；
HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸) 1.192g
ddH2O（双蒸水） 300ml；
充分溶解后，用HCl或NaOH调节pH至7.4，加ddH2O定容至500ml；
⑷harvesting缓冲液 pH7.4
充分溶解后，用HCl或NaOH调节pH至7.4，加ddH2O定容至500ml；
⑸solubilization缓冲液 pH7.4
HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸） 1.192g；
EDTA（乙二胺四乙酸） 1.871g；
ddH2O（双蒸水） 300ml；
充分溶解后，用HCl或NaOH调节pH至7.4，加ddH2O定容至500ml；
⑹resuspension缓冲液 pH7.4
HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸） 1.192g；
EDTA（乙二胺四乙酸） 0.0187g；
ddH2O（双蒸水） 300ml；
充分溶解后，用HCl或NaOH调节pH至7.4，加ddH2O定容至500ml。
二、一种胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，其主要组份如下：
A基因重组GLP-1受体
B磷酸西他列汀（二肽基肽酶-4抑制剂）
C三磷酸腺苷（ATP）
D三磷酸鸟苷（GTP）
E3-异丁基1-甲基黄嘌呤(IBMX)
F H膜反应液。
上述胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂的添加量为：
A基因重组GLP-1受体 20μg；
B二肽基肽酶-4抑制剂 占血浆样本重量的1%；
C三磷酸腺苷 480μg；
D三磷酸鸟苷 10μg；
E3-异丁基1-甲基黄嘌呤 0.5mg；
F膜反应液 100μl。
上述胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂还包括GLP-1标准品和cAMP酶联免疫吸附试验试剂盒。
基因重组GLP-1受体的制备步骤如下：
1、真核细胞GLP-1受体表达
⑴根据人GLP-1受体的序列设计引物，5′端引入BglII酶切位点和Kozok序列，3′端引入XhoI酶切位点和终止密码；引物序列见表1；
⑵用PCR方法扩增DNA片段，模板来自胎儿正常胰岛组织的cDNA文库，反应条件为：
94℃，30s；
60℃，20s；
72℃，90s；
25个循环后，72℃延伸7min；
⑶反应结束后，凝胶电泳提取PCR片段（1.4Kb），分别用BglII和XhoI消化PCR产物并用QIAGEN Plasmid Mini Kits纯化DNA片段；使用NheI和XhoI消化质粒pcDNA3.1(+)(5.4kb)；
⑷按照DNA的重量比为1:8的比例将PCR片段和质粒片段在DNA连接酶的作用下连接起来，将新构建的质粒转入Ecoli DH5α细菌中；
⑸通过氨苄青霉素筛选步骤⑷中转入Ecoli DH5α的细菌，挑取单菌落，PCR鉴定后，提取纯化重组质粒；
⑹使用电穿孔将重组质料转染CHO细胞株，用1mg/ml（常用10ml/10cm的培养皿中，根据容器的面积而定）G418筛选细胞株，3周后挑选单个活细胞，扩增并提取蛋白质，用Western Blotting的方法确定该细胞株表达GLP-1受体，液氮冻存备用。
表1GLP-1受体引物序列
2、提取表达GLP-1受体细胞膜的过程
⑴用预保温（保温温度为37℃）的HBS液（HBS：154mM NaCl，10mM HEPES，pH7.4）洗涤瓶中的单层融合细胞；
⑵向洗涤细胞中加入8ml harvesting缓冲液(154mM NaCl，10mM HEPES，5mM EDTA，pH7.4)，在37℃温箱中孵育10min后，在4℃条件下500g/转离心5min，弃去上清液；
⑶将离心后的沉淀颗粒重新悬浮于10mL的solubilization缓冲液(10mM HEPES，10mM EDTA，pH7.4)，将其在冰上孵育15min后用超声破碎仪处理细胞；
⑷经处理后的细胞液在4℃环境下以40,000g离心15min；再将下层颗粒（沉淀）重新悬浮于冰冻resuspension缓冲液(10mM HEPES，0.1mM EDTA，pH7.4)，向其中加入2mg/mL蛋白质，最终调整为2mg/mL，，即得GLP-1受体，分装后保存于-80℃冰箱待用。
三、本发明试剂的使用方法
⑴按照下表配制GLP-1系列标准品，配制方法如表2所示。
表2GLP-1的标准品的配制
⑵分别设置样本孔和GLP-1标准品孔，标准品孔中加入不同浓度的GLP-1标准品10μl，样本孔中加入待检血标本10μl后，按照表3加入试剂。
表3操作流程
⑶由于血标本中可能存在cAMP，所以需设置自身对照，及将一份血标本中加经煮沸的细胞膜，使膜受体失活，以作为cAMP自身对照；
⑷加样完毕后，在30℃水浴锅中孵育5-10min，并且在加热过程中要不断振荡，以使标本中GLP-1与膜受体充分反应；
⑸取出反应槽后以1mM的TCA溶液终止反应；
⑹按cAMP试剂盒测定反应体系中cAMP含量；
⑺以cAMP含量为纵坐标，GLP-1浓度为横坐标绘制标准曲线（或建立数学模型），未知样品浓度通过标准曲线（或数学模型）获得。
附：cAMP试剂盒使用方法
⑴取cAMP试剂盒，从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条板数；
⑵向试剂盒中微孔板加上述反应液体10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加；
⑶除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min；
⑷弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；
⑸每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min；
⑹每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。根据cAMP含量反应血中GLP-1的动态变化。
当血浆样本检测范围：0.1-100ng/mL时，检测的灵敏度为0.05ng/ml。
Claims (7)
1.一种胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，其特征在于：其主要组份及含量如下：
每100μl的检测试剂中：
基因重组GLP-1受体 20μg；
二肽基肽酶-4抑制剂 占血浆样本重量的1%；
三磷酸腺苷 480μg；
三磷酸鸟苷 10μg；
3-异丁基1-甲基黄嘌呤 0.5mg；
膜反应液 100μl。
2.根据权利要求1所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，其特征在于：所述的GLP-1受体的制备步骤如下：
⑴真核细胞GLP-1受体表达
①根据人GLP-1受体的序列设计引物，5′端引入BglII酶切位点和Kozok序列，3′端引入XhoI酶切位点和终止密码；5’端引物序列见序列1，3’端引物序列见序列2；
②用PCR方法扩增DNA片段，模板来自胎儿正常胰岛组织的cDNA文库，反应条件为：
94℃，30s；
60℃，20s；
72℃，90s；
25个循环后，72℃延伸7min；
③反应结束后，凝胶电泳提取PCR片段（1.4Kb），分别用BglII和XhoI消化PCR产物并用QIAGEN Plasmid Mini Kits纯化DNA片段；使用NheI和XhoI消化质粒pcDNA3.1(+)(5.4kb)；
④按照DNA的重量比为1:5-10的比例将PCR片段和质粒片段在DNA连接酶的作用下连接起来，将新构建的质粒转入Ecoli DH5α细菌中；
⑤通过氨苄青霉素筛选步骤④中转入Ecoli DH5α的细菌，挑取单菌落，PCR鉴定后，提取纯化重组质粒；
⑥使用电穿孔将重组质料转染CHO细胞株，用G418筛选细胞株，扩增并提取蛋白质，确定该细胞株表达GLP-1受体，液氮冻存备用；
⑵提取表达GLP-1受体细胞膜的过程
①向洗涤细胞中加入harvesting缓冲液，在温箱中孵育后，离心，弃去上清液；
②将离心后的沉淀重新悬浮，将其在冰上孵育后破碎细胞，得细胞液；
③将步骤②中细胞液离心；将沉淀重新悬浮，再向其中加入蛋白质，最终调整为2mg/mL，即得GLP-1受体。
3.根据权利要求1所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，其特征在于：所述的二肽基肽酶-4抑制剂为磷酸西他列汀。
4.根据权利要求1所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，其特征在于：所述的膜反应液的组成成份及重量份数g/L为：
余量为双蒸水；
pH=7.4。
5.根据权利要求3所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，其特征在于：所述的膜反应液的组成成份及重量份数g/L为：
余量为双蒸水；
pH=7.4。
6.一种胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1至5任一项所述的检测试剂。
7.一种如权利要求1所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂的检测方法，其特征在于：步骤如下：
⑴加入GLP-1受体、膜反应液、待测标本及GLP-1标准品后，于30℃振荡下，孵育5-10min；同时设定自身对照；利用GLP-1系列标准品绘制标准曲线；
⑵吸取步骤⑴中反应液加入cAMP酶联免疫吸附试验试剂盒微孔板中，并向微孔板中加入样本稀释液及辣根过氧化物酶标记的检测抗体，使待检测的cAMP与酶标抗体结合；
其中，反应液体、样本稀释液和辣根过氧化物酶标记的检测抗体的体积比为：1：4：10。
⑶洗去未结合的酶标抗体后加入底物TMB显色，反应完成后，测定反应GLP-1的量；
其中，各物质的添加量均按照权利要求1的配比。
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