CN105085659A - 一种重组利钠肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组利钠肽及其制备方法，所述重组利钠肽由38个氨基酸组成，从N末端到C末端的序列为：SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCPSLRDPRPNAPSTSA，其中两个半胱氨酸残基形成二硫键环状结构。本发明的新型重组利钠肽同时具有心房利钠肽及蛇利钠肽的生物学特性，生理作用显著增强，药物半衰期明显延长；本发明的制备工艺简易可行；新型重组利钠肽基因工程药物可有效作用于心脏血管以及肾脏等效应器官，发挥利尿、排钠、提高肾小球滤过率、扩张血管等作用从而有效保护上述器官的生理功能，达到预防和治疗心脏衰竭及肾衰竭等严重疾病。

Description

一种重组利钠肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物活性肽技术领域，更具体的说，涉及一种重组利钠肽及其制备方法。

背景技术

心力衰竭是由心肌功能、结构、节律、传导等异常引起的，最终导致心室泵血能力和充盈功能受损等严重的心脏疾病，其中充血性心力衰竭是心力衰竭的严重阶段，影响1-2％成年人口的身体健康，尤其是65岁以上人口约有6-10％受到该病的威胁，成为当前最严重的心血管疾病。

自从1981年Bold等发现大鼠心房抽提物具有尿钠排泄活性后，利钠肽家族成员被陆续发现，迄今为止已发现多种利钠肽分子，如心房利钠肽(ANP)、脑利钠肽(BNP)、C型利钠肽(CNP)、尿钠肽(Urodalitin)及蛇利钠肽等。它们的一级结构虽有所不同，但却具有相似的二级结构，且具有共同的生理作用：利钠肽分子的受体属于鸟苷酸环化酶家族的成员，利钠肽分子与受体结合，激活鸟苷酸环化酶，引起效应组织器官如心脏、血管、肾脏等组织细胞内环化鸟苷酸(cGMP)的浓度升高；cGMP作为第二信使，扩张动脉、静脉等脉管系统，快速降低全身外周动脉血压、肺毛细血管楔压(PCWP)、右房压(RAP)和周围血管阻力(SVR)，增加心输出量(CO)及每搏出量(SV)，从而迅速改善血液动力学状态，有效降低心室的前后负荷，同时拮抗肾素-醛固酮系统过度激活产生的心脏毒性，从而扩张肾小球的入球小动脉、抑制近曲小管对钠的吸收，使肾小球滤过率和钠排泄增加，产生明显的利尿和利尿钠作用，促进肾脏功能。通过上述机制降低心室负荷，产生舒张血管、抗纤维化、抗心肌肥大等生理学效应，改善血管和肾脏的血流动力学平衡。

心房利钠肽(ANP)首先是从大鼠心房中获得的，人心房利钠肽编码基因NPPA位于1p36.21，长度约2kb，包含3个外显子和2个内含子。图1示出了人心房利钠肽的肽链结构，如图1所示，ANP前体为151个氨基酸组成的多肽，去除信号肽后形成126个氨基酸组成的前体ANP，储存于心房颗粒中，释放过程中迅速裂解成为具有活性的、由28个氨基酸组成的心房利钠肽分子，从N末端到C末端的序列为：

SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY

其中两个半胱氨酸残基形成利钠肽分子所共有的二硫键环状结构。利钠肽分子是内源性激素，由心脏分泌用以应对心肌紧张和过载，其中ANP与利钠肽受体A(NatriureticpeptideAreceptor，NPRA)结合，激活鸟苷酸环化酶，提高胞内cGMP水平，从而产生多种生理功能：促进水钠排泄、扩张血管、调节血管张力和血压；还可调节孕激素分泌及肾素、血管加压素、内皮素的释放等。但ANP在血液中的半衰期非常短，约为2分钟。

蛇利钠肽(DNP)是一种从树眼镜蛇(Dendroaspisangusticeps)的毒液中提取的利钠肽分子，图2示出了蛇利钠肽的肽链结构，如图2所示，蛇利钠肽由38个氨基酸组成，从N末端到C末端的序列为：

EVKYDPCFGHKIDRINHVSNLGCPSLRDPRPNAPSTSA

在人和大鼠血液、组织中均有相应的免疫学反应，且充血性心力衰竭病人的血清浓度显著升高，提示DNP可能是哺乳动物另一个内源性利钠肽分子，但其编码基因尚未证实。DNP同样具有促进水钠排泄、诱导血管舒张、抑制血管平滑肌细胞增殖的功能。研究表明：DNP的羧基末端(即C末端)由15个氨基酸组成，可增加cGMP的刺激效应，其刺激心肌细胞产生cGMP的能力是ANP的10倍。NPRC(NatriureticpeptideCreceptor，NPRC)是细胞表面的利钠肽清除受体，研究结果还证实：DNP与NPRC的亲和力低于ANP和BNP，且对中性内肽酶(NEP)的消化作用具有更强的抵抗力，从而使DNP在循环系统中并不像其他利钠肽那样被快速清除，半衰期更长。

人工合成的心房利纳肽(ANP)(商品名carperitide)已被应用于急性心衰的治疗，可以降低动脉血压、肺毛细血管楔压，改善血液动力学状态，缓解心脏负荷，但临床研究结果证实：它们在血液循环系统中的半衰期非常短，约为2分钟，临床应用和治疗效果受到了很大的限制。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，提供一种重组利钠肽及其制备方法，克服现有技术中将心房利钠肽治疗急性心衰时，其半衰期非常短、生理作用效应不强而造成的急性心衰治疗效果不理想的缺陷。

本发明解决上述问题的技术方案在于：一种重组利钠肽，所述重组利钠肽由38个氨基酸组成，从N末端到C末端的序列为：

SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCPSLRDPRPNAPSTSA

其中两个半胱氨酸残基形成二硫键环状结构。

在本发明中，所述重组利钠肽的N末端为人心房利钠肽N末端的23个氨基酸，C末端为蛇利钠肽C末端的15个氨基酸。

在本发明中，所述N末端的23个氨基酸构成一个完整的人心房利钠肽的环状功能区。

本发明还提供一种重组利钠肽的制备方法，所述方法包括如下步骤：

S1、分别获取心房利钠肽基因的N末端基因片段和蛇利钠肽基因的C末端基因片段；

S2、通过PCR的方法拼接合成重组利钠肽基因，所述重组利钠肽基因的N末端为所述心房利钠肽基因的N末端基因片段，所述重组利钠肽基因的C末端为所述蛇利钠肽基因的C末端基因片段；

S3、构建表达载体；

S4、表达。

在本发明的制备方法中，获取的所述心房利钠肽基因为人心房利钠肽基因。

在本发明的制备方法中，所述步骤S1进一步包括：

S101、获取全长人心房利钠肽基因；

S102、通过PCR的方法获取所述人心房利钠肽基因的N末端基因片段：

引物序列3：5’-GAATTCGTTCGTGGTCCGCGTTCTCTTCGTCGTTCTTCT-3’；

引物序列4：5’-AGCGTTCGGACGCGGGTCACGCAGGCTCGGGCATCCAAGACCAGACTG-3’。

S103、合成所述蛇利钠肽基因的C末端基因片段：

引物序列5：5’-GTGGATCCTCAAGCGCTAGTGCTCGGAGCGTTCGGACGCGGGTCACG-3’。

在本发明的制备方法中，所述步骤S101进一步包括：以人心脏cDNA为模板，通过PCR的方法钓取全长人心房利钠肽基因，

引物序列1：5’-ATGAGCTCCTTCTCCACCACCACCGTGAGC-3’；

引物序列2：5’-TCAGTACCGGAAGCTGTTACAGCCCAGTCCGCT-3’。

在本发明的制备方法中，所述步骤S2进一步包括：

S201、以所述人全长人心房利钠肽基因为模板，分别以引物序列3和引物序列4为上游和下游引物扩增，获得第一基因片段；

S202、以所述第一基因片段为模板，分别以引物序列3和引物序列5为上游和下游引物扩增，获得重组利钠肽基因，所述重组利钠肽基因序列为：

TCTCTTCGTCGTTCTTCTTGCTTCGGTGGTCGTATGGACCGTATCGGGGCTCAGTCTGGTCTTGGTTGCCCGAGCCTGCGTGACCCGCGTCCGAACGCTCCGAGCACTAGCGCT。

在本发明的制备方法中，所述步骤S3中，所述表达载体为pGEX-4T-1或pCW；所述步骤S4中，所述表达菌株为DH5α、BL21、Rosetta或Rosetta-gami。

实施本发明的技术方案，可以获得以下技术效果：本发明的重组利钠肽同时具有心房利钠肽及蛇利钠肽的生物学特性，生理作用显著增强，药物半衰期明显延长；本发明的制备工艺简易可行；新型重组利钠肽基因工程药物可有效作用于心脏血管以及肾脏等效应器官，发挥利尿、排钠、提高肾小球滤过率、扩张血管等作用从而有效保护上述器官的生理功能，达到预防和治疗心脏衰竭及肾衰竭等严重疾病。

附图说明

以下将结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。附图中：

图1是人心房利钠肽的示意图；

图2是蛇利钠肽的示意图；

图3是本发明实施例中制备得到的新型重组利钠肽的示意图；

图4是以人心脏cDNA为模板，以全长人心房利钠肽基因(pre-ANP)的上游和下游引物扩增，获得约450bp大小目的基因片段；

图5以人全长人心房利钠肽基因(pre-ANP)为模板，分别以引物序列3和引物序列4为上游和下游引物扩增，获得约120bp大小的第一基因片段；

图6以图5中120bp的第一基因片段为模板，分别以引物序列3和引物序列5为上游和下游引物扩增，获得约135bp大小的基因片段；

图7是图6中扩增得到的ADNP基因片段的测序分析图；

图8分离纯化获得的重组利钠肽分子。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

现有技术中将心房利钠肽治疗急性心衰时，其半衰期非常短、生理效应作用不强，使得急性心衰治疗效果不理想。本发明的主要创新点在于：提供一种基于基因工程技术制备的新型重组利钠肽(ADNP)，该重组利钠肽具有心房利钠肽(ANP)构成的N末端和由蛇利钠肽(DNP)构成的C末端，同时具有心房利钠肽及蛇利钠肽的特性，具有与效应受体结合能力最强的心房利钠肽(ANP)的N末端，同时具有与清除受体结合能力最弱、且对中性内肽酶(NEP)的酶解消化作用具有更强抵抗力的蛇利钠肽(DNP)的C末端，从而使药物的特异性作用显著增强，半衰期明显延长，可高效率作用于心脏、血管、肾脏等效应器官，有效保护心脏、肾脏及其他器官的功能，达到保护、预防和治疗心脏、肾脏及其他器官衰竭疾病的目的。

图3示出了重组利钠肽的肽链结构，如图3所示，本发明的重组利钠肽由38个氨基酸组成，其中N末端为人心房利钠肽N末端的23个氨基酸，两个半胱氨酸残基形成的二硫键环状结构；C末端为蛇利钠肽C末端的15个氨基酸。即，包括一个完整的人心房利钠肽的环状功能区，所述蛇利钠肽具有完整的蛇利钠肽C末端的15个氨基酸，本发明的重组利钠肽从N末端到C末端的序列为：

SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCPSLRDPRPNAPSTSA

本发明同时还提供一种上述基因工程新型重组利钠肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：

S1、分别获取心房利钠肽基因的N末端基因片段和蛇利钠肽基因的C末端基因片段。优选的，获取的所述心房利钠肽基因为人心房利钠肽基因。

S2、通过PCR的方法合成重组利钠肽基因，所述重组利钠肽基因的N末端为所述心房利钠肽基因的N末端基因片段，所述重组利钠肽基因的C末端为所述蛇利钠肽基因的C末端基因片段；

S3、构建表达载体；

S4、表达。

优选的，上述步骤S1进一步包括：

S101、获取全长人心房利钠肽基因。

在美国国立生物信息中心(NCBI)数据库中查找人心房利钠肽基因序列，设计上游和下游引物，分别为：

上游引物的引物序列1为序列列表中序列1所示核苷酸序列：5’-ATGAGCTCCTTCTCCACCACCACCGTGAGC-3’,

下游引物的引物序列2为序列列表中序列2所示核苷酸序列：5’-TCAGTACCGGAAGCTGTTACAGCCCAGTCCGCT-3’。

以人心脏cDNA为模板，以全长人心房利钠肽基因(pre-ANP)的上游和下游引物扩增，获得约450bp大小的基因片段(见图4)，经基因测序分析证实为目的基因。

S102、通过PCR的方法获取所述人心房利钠肽基因的N末端基因片段。

从步骤S101中获得的全长人心房利钠肽基因(pre-ANP)中钓取人心房利钠肽基因(ANP)N末端基因片段，设计含有酶切位点的上游和下游引物，分别为：

上游引物的引物序列3为序列列表中序列3所示核苷酸序列：5’-GAATTCGTTCGTGGTCCGCGTTCTCTTCGTCGTTCTTCT-3’

下游引物的引物序列4为序列列表中序列4所示核苷酸序列：5’-AGCGTTCGGACGCGGGTCACGCAGGCTCGGGCATCCAAGACCAGACTG-3’。

S103、合成所述蛇利钠肽基因的C末端基因片段。

在美国国立生物信息中心(NCBI)数据库中，找到蛇利钠肽(DNP)基因序列，并进行相应的生物信息学分析。合成蛇利钠肽(DNP)基因C末端序列，设计同时含有酶切位点，设计的引物序列为

引物序列5为序列列表中序列5所示核苷酸序列：5’-GTGGATCCTCAAGCGCTAGTGCTCGGAGCGTTCGGACGCGGGTCACG-3’，

在引物中引入了BamHI酶切位点用作后续PCR扩增拼接合成重组利钠肽(ADNP)。

优选的，所述步骤S2进一步包括：

以人全长人心房利钠肽基因(pre-ANP)为模板，分别以引物序列3和引物序列4为上游和下游引物扩增，获得约120bp大小的第一基因片段，其中含有ANP的N末端69bp片段和DNPC末端30bp片段(见图5)。随后，以上述120bp的第一基因片段为模板，分别以引物序列3和引物序列5为上游和下游引物扩增，获得约135bp大小的基因片段(见图6)，其中含有BNPN末端69bp片段和DNPC末端45bp片段，即为重组利钠肽(ADNP)基因(见序列表中序列6所示核苷酸序列)。将扩增得到的ADNP基因片段直接连接到表达载体中，经基因测序分析证实为所需要的目的基因(见图7)。

优选的，所述步骤S3中，所述表达载体为pGEX-4T-1或pCW；所述步骤S4中，所述表达菌株为DH5α、BL21、Rosetta或Rosetta-gami。

将重组利钠肽ADNP基因片段的PCR产物经EcoRI和BamHI酶切后连接插入相同酶切的原核表达载体pGEX-4T-1或pCW中，构建成含有ADNP基因的重组质粒pGEX-ADNP或pCW-ADNP。更优选的，使用的重组质粒pGEX-ADNP转入表达载体，为后续纯化重组利钠肽分子的方便。

为了使重组利钠肽(ADNP)在原核表达系统即大肠杆菌菌株中得到高水平的表达，本发明选择了多种表达菌株进行了表达条件的探索，表达菌株包括DH5α、BL21、Rosetta或Rosetta-gami等，综合考虑表达产物的可溶性、表达产物的产量、细菌生长状态、细菌培养基成分等诸方面因素，更优选的，使用BL21和Rosetta来建立表达菌株。

优选的，在所述步骤S4之后还包括：

S5、离心收集表达菌株的菌体，分离纯化得到所述新型重组利钠肽分子(见图8)。

通过上述制备方法工艺简单可行，获得重组利钠肽分子具有如下优点：

(1)ADNP具有由ANP构成的N末端和由DNP构成的C末端，构成N末端的ANPN末端是所有天然利钠肽分子中与利钠肽受体A(利钠肽效应受体)结合能力最强的分子，高效、特异地结合效应受体，使得生物学作用的强度和显著增加，从而显著增加了第二信使cGMP的浓度以及由其产生的激活效应，双重增强新型重组利钠肽的生理功能和药用效应。

(2)构成C末端的DNPC末端是所有利钠肽分子中与利钠肽受体C(利钠肽清除受体)结合能力最弱的分子，同时DNP对中性内肽酶的酶解具有较强的抵抗力，使得半衰期显著延长，生物学作用的效应时间显著增加，从另一方面增强了新型重组利钠肽的生理功能和药用效应。

(3)能有效作用心脏、血管及肾脏等效应器官，并有效保护心脏及肾脏及其他器官的功能。

重组利钠肽作为一种新颖的基因工程药物可有效作用于效应器官，达到预防和治疗心脏及肾脏及其他器官衰竭疾病的目的，可以用于治疗急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、高血压、糖尿病、肥胖症等疾病。

以下的实施例中将详细说明如何采用原核表达载体pGEX-4T-1和pCW构建原核表达质粒pGEX-ADNP和pCW-ADNP并在表达菌株BL21和Rosetta中实现新型重组利钠肽(ADNP)的高效表达。

实施例1

将经PCR拼接扩增、并经测序的新型重组利钠肽(ADNP)基因克隆至原核系统大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1中，构建成含有新型重组利钠肽(ADNP)的原核表达质粒pGEX-ADNP。采用BL21和Rosetta作为原核系统表达宿主菌。提取高质量高浓度的原核表达质粒pGEX-ADNP，利用冷CaCl₂法制备感受态宿主细菌，并经常规方法转化宿主菌，将上述质粒分别转化到BL21和Rosetta菌株中，37℃培养12-18小时；挑取单克隆表达菌株，接种LB培养基(加入氨苄青霉素，终浓度为100μg/ml)，37℃振荡(250-300rpm)过夜培养，离心收集菌液，超声波破碎后提取蛋白，进行聚丙烯凝胶电泳(PAGE)蛋白质电泳检测。

实施例2

将经PCR拼接扩增、并经测序的新型重组利钠肽(ADNP)基因克隆至原核表达载体pCW中，构建成含有新型重组利钠肽(ADNP)的原核表达质粒pCW-ADNP。采用BL21和Rosetta作为原核系统表达宿主菌。提取高质量高浓度的原核表达质粒pCW-ADNP，利用冷CaCl₂法制备感受态宿主细菌，并经常规方法宿主细菌，将上述质粒分别转化到BL21和Rosetta菌株中，37℃培养12-18小时；挑取单克隆表达菌株，接种LB培养基(加入氨苄青霉素，终浓度为100μg/ml)，37℃振荡(250-300rpm)过夜培养，离心收集菌液，超声波破碎后提取蛋白，进行聚丙烯凝胶电泳(PAGE)蛋白质电泳检测。

上述步骤中，对实施例1-2的新型重组利钠肽进行纯化包括通过离心收集表达菌株，然后通过亲和层析分离出新型重组利钠肽的融合蛋白，利用凝血酶酶切去除标签蛋白，最后分离纯化获得新型重组利钠肽(ADNP)。

综上所述，本发明的新型重组利钠肽同时具有人心房利钠肽及蛇利钠肽的特性，与效应受体的特异性作用显著增强，与清除受体的结合明显降低，并同时具有增强的抗酶解活性，使得药物半衰期显著延长；本发明的制备方法工艺简单、切实可行；具有新型重组利钠肽的基因工程药物可有效作用心脏、血管、肺及肾脏等效应器官，并有效保护心肺及肾脏功能，达到预防和治疗心脏衰竭以及肾衰竭等严重疾病。

Claims (9)

1.一种重组利钠肽，其特征在于，所述重组利钠肽由38个氨基酸组成，从N末端到C末端的序列为：

SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCPSLRDPRPNAPSTSA

其中两个半胱氨酸残基形成二硫键环状结构。

2.根据权利要求1所述的重组利钠肽，其特征在于，所述重组利钠肽的N末端为人心房利钠肽N末端的23个氨基酸，C末端为蛇利钠肽C末端的15个氨基酸。

3.根据权利要求2所述的重组利钠肽，其特征在于，所述N末端的23个氨基酸构成一个完整的人心房利钠肽的环状功能区。

4.一种重组利钠肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、分别获取心房利钠肽基因的N末端基因片段和蛇利钠肽基因的C末端基因片段；

S2、通过PCR的方法合成重组利钠肽基因，所述重组利钠肽基因的N末端为所述心房利钠肽基因的N末端基因片段，所述重组利钠肽基因的C末端为所述蛇利钠肽基因的C末端基因片段；

S3、构建表达载体；

S4、表达。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，获取的所述心房利钠肽基因为人心房利钠肽基因。

6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述步骤S1进一步包括：

S101、获取全长人心房利钠肽基因；

S102、通过PCR的方法获取所述人心房利钠肽基因的N末端基因片段：

引物序列3：5’-GAATTCGTTCGTGGTCCGCGTTCTCTTCGTCGTTCTTCT-3’；

引物序列4：5’-AGCGTTCGGACGCGGGTCACGCAGGCTCGGGCATCCAAGACCAGACTG-3’。

S103、合成所述蛇利钠肽基因的C末端基因片段：

引物序列5：5’-GTGGATCCTCAAGCGCTAGTGCTCGGAGCGTTCGGACGCGGGTCACG-3’。

7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述步骤S101进一步包括：以人心脏cDNA为模板，通过PCR的方法钓取全长人心房利钠肽基因，

引物序列1：5’-ATGAGCTCCTTCTCCACCACCACCGTGAGC-3’；

引物序列2：5’-TCAGTACCGGAAGCTGTTACAGCCCAGTCCGCT-3’。

8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述步骤S2进一步包括：

S201、以所述人全长人心房利钠肽基因为模板，分别以引物序列3和引物序列4为上游和下游引物扩增，获得第一基因片段；

S202、以所述第一基因片段为模板，分别以引物序列3和引物序列5为上游和下游引物扩增，获得重组利钠肽基因，所述重组利钠肽基因序列为：

TCTCTTCGTCGTTCTTCTTGCTTCGGTGGTCGTATGGACCGTATCGGGGCTCAGTCTGGTCTTGGTTGCCCGAGCCTGCGTGACCCGCGTCCGAACGCTCCGAGCACTAGCGCT。

9.根据权利要求4～8任意一项所述制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述表达载体为pGEX-4T-1或pCW；所述步骤S4中，所述表达菌株为DH5α、BL21、Rosetta或Rosetta-gami。