CN114621327A

CN114621327A - GLP-1、GIP和Gcg多重受体激动蛋白质

Info

Publication number: CN114621327A
Application number: CN202011437400.0A
Authority: CN
Inventors: 陈海; 廖高勇; 张怡
Original assignee: Xintrum Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Xintrum Pharmaceuticals Ltd
Priority date: 2020-12-10
Filing date: 2020-12-10
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2040-12-10
Also published as: US20220298215A1; CN114621327B; WO2022121667A1

Abstract

本发明提供了一种新的蛋白质。经实验证实，所述蛋白质同时具有对GLP‑1(胰高血糖素样肽‑1)、GIP(葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽)和Gcg(胰高血糖素)三种受体的激动活性，且兼具降低血糖和减轻体重作用。

Description

GLP-1、GIP和Gcg多重受体激动蛋白质

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种可高效减重兼具降糖的多重受体激动蛋白质。

背景技术：

糖尿病和肥胖之间联系密切，大约80％的2型糖尿病患者都有肥胖，具有并发性、异质性的特点。

已知GLP-1、GIP和Gcg都是与糖尿病、肥胖等代谢疾病相关的肠促胰素。

胰高血糖素样肽-1受体激动剂(简称GLP-1RA)为糖尿病和肥胖症患者提供了有效、安全的治疗方法，直接作用于胰腺促进胰岛素释放，抑制胰高糖素的分泌，抑制胃蠕动，延缓胃排空，通过对中枢神经系统的作用来抑制食欲，而这些治疗方案的疗效有限，其临床疗效并不能完全满足代谢紊乱病人的需求。

通过在单一疗法中组合多种代谢通路，则可能实现多重作用以改善疗效。

葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽(glucose-dependent insulinotropicpolypeptide，简称GIP)是正常人餐后肠促胰素效应的主要原因，具有与GLP-1不同的功能。GIP通过调节葡萄糖摄取、脂解和脂蛋白酶活性，在脂肪组织糖和脂代谢中发挥重要作用。

胰高血糖素(glucagon，简称Gcg)是在胰腺中产生的肠胃激素，通过刺激肝脏糖异生和糖原分解升高血糖，具有促分解代谢和机体产热增加作用。

现有技术中，糖尿病和肥胖的治疗药物一直专注于针对单一分子靶单独疗效的药物，临床上往往只能使用几种单一靶点的单一作用药物进行联合用药，或者使用这些药物的复方制剂。

研究表明，GLP-1RAs与其它不同的肠胃激素同时给药可显示出协同促进作用，因此，设计并获得单个分子在GLP-1/GIP/Gcg多重受体上具备适当平衡的活性，可同时激活不同信号通路，发挥出协同促进血糖控制、体重减轻以及调节脂质代谢等功能，从而具有疗效最大化、副作用降低、药动学性质更稳定等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够同时具有对GLP-1(胰高血糖素样肽-1)受体、GIP(葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽)受体和Gcg(胰高血糖素)受体三种受体的激动活性，且能够显著减轻糖尿病人体重兼具降糖的蛋白质。

本发明提供了一种多重受体激动蛋白质(简称GGGF1)，其氨基酸序列由SEQ IDNO.1所示。

所述GGGF1蛋白的氨基酸序列中，1-39位是具有活性的功能区，其氨基酸序列由SEQ ID NO.2所示。其余部分是非功能区，起着增加蛋白稳定性的作用。

所述多重受体激动蛋白质以同源二聚体的形式存在。

本发明将所述多重受体激动蛋白质基因构建至表达载体。所述表达载体为真核表达载体，可以通过瞬时转染或稳定转染的方式导入宿主细胞。

所述宿主细胞为哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾293细胞。

具体地，本发明进行了如下研究工作：

1、根据GGGF1的氨基酸序列基于CHO细胞密码子的偏爱性设计合成对应的核苷酸序列，将其构建至载体pcDNA3.4中，获得表达载体pcDNA3.4-GGGF1。

2、利用转染试剂将表达载体转染至CHO细胞中，经培养获得表达GGGF1的细胞上清。

3、通过Protein A进行GGGF1的分离纯化，并利用SDS-PAGE电泳进行检测。

4、基于GLP-1受体、GIP受体、Gcg受体检测GGGF1的生物学活性。

5、利用db/db糖尿病模型小鼠进行GGGF1的减重降糖活性研究。

经多个实验证实，本发明提供的蛋白质，具有以下功能：

1、同时激活GLP-1、GIP和Gcg多重受体(见实施例2、3、4)；

2、显著降低体重(P<0.05)(见实施例5)；

3、极显著降低非空腹血糖(NFBG)(P<0.001)、空腹血糖(FBG)水平(P<0.0001)(见实施例5)；

4、显著降低糖化血红蛋白(HbAlc)水平(P<0.01)(见实施例5)。

附图说明

图1：琼脂糖凝胶电泳检测PCR方法筛选的构建GGGF1表达载体pcDNA3.4-GGGF1阳性克隆。

图2：非还原SDS-PAGE电泳检测GGGF1表达上清；

图3：非还原SDS-PAGE电泳检测Protein A纯化的GGGF1；

图4：在db/db糖尿病模型小鼠上GGGF1蛋白降低体重效果；

图5：在db/db糖尿病模型小鼠上GGGF1蛋白降低非空腹血糖(NFBG)水平效果；

图6：在db/db糖尿病模型小鼠上GGGF1蛋白降低空腹血糖(FBG)水平效果；

图7：在db/db糖尿病模型小鼠上GGGF1蛋白降低糖化血红蛋白(HbAlc)水平效果。

序列表信息

SEQ ID NO.1：蛋白GGGF1的氨基酸序列；

SEQ ID NO.2蛋白GGGF1中功能区的氨基酸序列。

具体实施方式

以下实施例仅用于举例说明本发明的方法和装置，并不限定本发明的范围。

实施例中提到的“Dul”是对照降糖药物，中文名：度拉糖肽，外购品，礼来公司生产。

实施例1多重受体激动蛋白质GGGF1的制备

1、多重受体激动蛋白质表达载体的构建

根据CHO细胞表达的特点将GGGF1氨基酸序列优化逆翻译为核苷酸序列并进行化学合成，利用限制性内切酶EcoRI、BamHI进行酶切，胶回收试剂盒纯化获取酶切DNA片段。对载体pcDNA3.4利用相同的限制性内切酶EcoRI、BamHI进行双酶切，酶切产物经DNA纯化试剂盒进行纯化。

利用T4 DNA连接酶将EcoRI、BamHI双酶切后的基因GGGF1连接至相同双酶切后的载体pcDNA3.4上，连接子化学转化至Top 10感受态细胞。转化长出的单菌落通过菌体PCR筛选阳性克隆，若目的基因成功连接至表达载体上，则PCR产物大小为900～1000bp左右，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物图谱如图1。

挑选PCR筛选的阳性克隆pcDNA3.4-GGGF1进行测序，经序列比对分析，GGGF1核苷酸序列与理论序列一致。

2、多重受体激动蛋白质的表达

宿主细胞CHO细胞的培养条件为：培养基CHO细胞表达培养基，轨道摇床(轨道直径2.5cm)，转速120rpm，二氧化碳浓度8％，温度37℃。CHO细胞在达到4～6×10⁶个细胞/mL时传代，传代后调整细胞密度2～5×10⁵个细胞/mL。在转染前一天传代细胞，细胞密度调整为3～4×10⁵个细胞/mL。在转染前用完全培养基调整细胞密度到6×10⁶个细胞/mL。根据实验目的选择合适的转染体积。在1.5mL离心管中，按每10⁶待转细胞0.133μg的比例分别加入纯化后的实施例1中的表达载体pcDNA3.4-GGGF1，加入optiPRO SFM使终体积为每10⁶待转细胞6.7μL，温和混均。在另一个1.5mL离心管中按每10⁶细胞0.533μL ExpiFectamine CHOReagent转染试剂和6.134μL optiPRO SFM的比例加入两种试剂，温和混均。立即把稀释后的转染试剂同载体溶液混合，室温放置1～5min。逐滴把载体：转染试剂混合溶液加入到细胞悬液中，立即放入37℃、8％CO₂摇床中培养。培养20个小时后，按每10⁶待转细胞1μL和40μL的比例在摇瓶中分别加入Enhancer和Feed，同时将培养条件调整为32℃、5％CO₂，培养至第9天，离心收集培养上清至-70℃以下保存，取样进行非还原SDS-PAGE电泳检测，如图2所示，结果证实GGGF1顺利表达。

3、多重受体激动蛋白质的分离纯化

采用Protein A填料对实施例2中GGGF1蛋白表达上清进行分离纯化，平衡缓冲液为磷酸盐缓冲液PBS，洗脱缓冲液为pH3.0的100mM柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，收集洗脱峰，并置换至PBS缓冲液中，获得GGGF1蛋白，紫外法测定蛋白含量，非还原SDS-PAGE电泳检测图谱如图3所示。

实施例2蛋白质GGGF1对GLP-1(胰高血糖素样肽-1)受体激动活性实验

方法原理：

采用荧光素酶报告基因的方法检测多重受体激动蛋白质GGGF1的生物学活性。HEK293-GLP1R-CRE-Luc细胞可以稳定表达GLP-1受体，并通过CRE特异启动luciferase的表达，双重受体激动蛋白质处理的HEK293-GLP1R-CRE-Luc细胞可以通过与GLP-1受体结合后特异启动这一信号通路，最后加入底物产生化学发光信号，信号值大小与双重受体激动蛋白质生物学活性正相关，

具体步骤如下：

将多聚赖氨酸以0.1mg/mL的浓度，100μL/孔的量加入96孔板，37℃包被24h，临用前以无菌双蒸水洗涤一遍，培养箱中挥干，备用。HEK293-GLP1R-CRE-Luc细胞以3×104个/孔的细胞密度接种至96孔板。根据检测样本的量确定铺板的量，每个药物铺3(行)×9(列)细胞。将GGGF1蛋白分别稀释至10、2、0.4、0.08、0.016、0.0032、0.00064、0.000128、0nM浓度，以市售礼来制造的度拉糖肽(简称Dul)为对照，稀释相同浓度梯度，弃去各孔培养液，每孔加入100μLGGGF1的稀释液，继续培养24h后取出96孔板，每孔加入100μL配制好的提前恢复至常温的One-Glo Luciferase Assay溶液，混匀后静置裂解5min，多功能酶标仪化学发光法检测各孔数值。采用GraphPad Prism软件拟合各融合蛋白的化学发光值-浓度关系曲线(选择三参数非线性回归方程拟合)；计算出GGGF1生物学活性的EC₅₀值。

实验结果：如表1所示。

实验结论：本发明的蛋白GGGF1、度拉糖肽(Dul)均可与GLP-1(胰高血糖素样肽-1)受体结合。

实施例3蛋白质GGGF1对GIP(葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽)受体激动活性实验

方法原理：

采用GIP受体过表达细胞株(CHO-K1-GIPR)测定多重受体激动蛋白质GGGF1刺激GIP受体的生物学活性，其原理为多重受体激动蛋白质与CHO-K1-GIPR细胞作用一段时间后，细胞内环磷酸腺苷(cAMP)含量增加，且cAMP含量与药物活性在一定范围内呈正相关，通过测定细胞内cAMP信号随药物刺激浓度的变化即可反映待测药物的生物学活性。本实验中采用外加标记的cAMP竞争生成的cAMP的实验方法测定多重受体激动蛋白质刺激GIP受体的生物学活性。

具体步骤如下：

选用生长状态良好的CHO-K1-GIPR细胞，用胰酶消化，DPBS清洗细胞两次，用1×Stimulation Buffer重悬细胞并计数，调整细胞密度为6×105cells/mL，96孔板中每孔分别加入5μL细胞悬液，然后分别加入5μL相对应的最高浓度200nM，5倍梯度稀释的待测药物GGGF1，以市售礼来制造的度拉糖肽(简称Dul)为对照，稀释相同浓度梯度，同时设置cAMP标准品反应区，每孔分别加入5μL相对应浓度的cAMP，密封膜覆盖96孔板，放置于细胞培养箱中，37℃孵育30min；取出96孔板，每孔加入5μL cAMP工作液，混匀，然后每孔加入5μL Anti-cAMP-Cryptate工作液，再次混匀，密封膜覆盖，室温孵育1小时，用多功能酶标仪读取ratio值[(signal 665nm/signal 620nm)*10000]，用GraphPad Prism6软件进行数据处理分析，计算待测药物GGGF1的EC50值。

实验结果：如表1所示。

实验结论：本发明的蛋白GGGF1可与GIP(葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽)受体结合，度拉糖肽(Dul)与GIP受体无结合信号。

实施例4蛋白质GGGF1对Gcg(胰高血糖素)受体激动活性实验

方法原理：

采用Gcg受体过表达细胞株(CHO-K1-GcgR)测定多重受体激动蛋白质GGGF1刺激Gcg受体的生物学活性，其原理为多重受体激动蛋白质与CHO-K1-GcgR细胞作用一段时间后，细胞内环磷酸腺苷(cAMP)含量增加，且cAMP含量与药物活性在一定范围内呈正相关，通过测定细胞内cAMP信号随药物刺激浓度的变化即可反映待测药物的生物学活性。本实验中采用外加标记的cAMP竞争生成的cAMP的实验方法测定多重受体激动蛋白质刺激GcgR受体的生物学活性。

具体步骤如下：

选用生长状态良好的CHO-K1-GcgR细胞，用胰酶消化，DPBS清洗细胞两次，用1×Stimulation Buffer重悬细胞并计数，调整细胞密度为6×105cells/mL，96孔板中每孔分别加入5μL细胞悬液，然后分别加入5μL相对应的最高浓度10000nM，10倍梯度稀释的待测药物GGGF1，以市售礼来制造的度拉糖肽(简称Dul)为对照，稀释相同浓度梯度，同时设置cAMP标准品反应区，每孔分别加入5μL相对应浓度的cAMP，密封膜覆盖96孔板，放置于细胞培养箱中，37℃孵育30min；取出96孔板，每孔加入5μL cAMP工作液，混匀，然后每孔加入5μLAnti-cAMP-Cryptate工作液，再次混匀，密封膜覆盖，室温孵育1小时，用多功能酶标仪读取ratio值[(signal 665nm/signal 620nm)*10000]，用GraphPad Prism6软件进行数据处理分析，计算待测药物GGGF1的EC50值。

实验结果：如表1所示。

实验结论：本发明的蛋白GGGF1可与Gcg(胰高血糖素)受体结合，度拉糖肽(Dul)与Gcg受体无结合信号。

表1与三种受体结合比较(EC₅₀值)

总的实验结论：

本发明的蛋白GGGF1与糖尿病、肥胖相关的三种肠促胰素GLP-1、GIP、Gcg的三个受体的结合实验的结果证明：

1、本发明的蛋白GGGF1可同时与GLP-1、GIP、Gcg三种受体结合；

2、对照药物市售降糖药物度拉糖肽(Dul)只能与GLP-1一种受体结合；

3、而且，GGGF1比Dul与GLP-1受体亲和力更高，预示减重和降糖效果可能更好。实施列5db/db糖尿病模型鼠中考察多重受体激动蛋白质GGGF1的减重和降糖活性

实验目的：考察多重受体激动蛋白质GGGF1在db/db二型糖尿病模型小鼠体内的减重和降糖活性。

实验动物与分组：

选取db/db雄性小鼠24只进行实验，接收时为6周龄时，进入动物房适应性饲养一周。一周后，尾尖取血检测非空腹血糖(NFBG)，禁食6小时，尾尖取血检测空腹血糖(FBG)，眼后静脉丛取血50μL全血分离血浆检测糖化血红蛋白(HbAlc)。

以FBG水平为主要依据，以体重辅助，将实验动物随机分为三组：模型组(空白对照组，n＝8)、阳性对照组(Dul，市售礼来制造度拉糖肽，n＝8)、GGGF1给药组(GGGF1，n＝8)。

实验方法：

GGGF1给药组、阳性对照组每3天颈后皮下给药16.67nmol/kg；

模型组给予安慰剂；

给药前尾尖取血检测NFBG；禁食6小时，检测FBG、称量体重，持续给药16次；末次给药后3天，禁食6小时，称量体重、检测FBG、HbAlc。

实验结果：

见图4～图7，依次为GGGF1蛋白降低体重和血糖的实验结果；

具体为：

图4：在db/db糖尿病模型小鼠上的降低体重结果；

图5：降低非空腹血糖(NFBG)结果；

图6：降低空腹血糖(FBG)结果；

图7：降低糖化血红蛋白(HbAlc)水平结果。

从结果可以看出：

1、与模型组(不用药物的空白对照组)动物相比，GGGF1有如下作用：

1)显著降低体重(*，P<0.05)；

2)极显著降低非空腹血糖(NFBG)(***，P<0.001)

3)极显著降低空腹血糖(FBG)水平(****，P<0.0001)；

4)显著降低糖化血红蛋白(HbAlc)水平(**，P<0.01)。

2、与阳性药Dul(度拉糖肽)对照组相比，GGGF1在降低非空腹血糖(NFBG)方面，效果更好。

实验结论：

动物实验表明，本发明的蛋白GGGF1兼具有降低血糖和减重的功能。

序列表

<110> 江苏中新医药有限公司

<120> GLP-1、GIP和Gcg多重受体激动蛋白质

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Arg Ala Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Leu Asp Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35 39

<210> 2

<211> 283

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Arg Ala Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Leu Asp Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

35 40 45

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

50 55 60

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

65 70 75 80

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

85 90 95

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

100 105 110

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

115 120 125

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

130 135 140

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

145 150 155 160

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

165 170 175

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

180 185 190

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

195 200 205

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

210 215 220

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

225 230 235 240

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

245 250 255

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

260 265 270

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

275 280 283

Claims

1.SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白质在制备GLP-1、GIP和Gcg三种受体的激动剂中的应用。

2.SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白质在制备体重减轻制剂中的应用。

3.SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白质在制备降低血糖制剂中的应用。

4.一种降糖制剂，其特征是含有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白质。

5.一种减重制剂，其特征是含有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白质。

6.SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的蛋白质。

7.SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白质。