CN109096371B - 一种降尿酸分子及其筛选方法和应用 - Google Patents

一种降尿酸分子及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种降尿酸分子及其筛选方法和应用，所述降尿酸分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明通过采用噬菌体展示技术构建随机突变文库，并构建尿酸靶分子，采用亲和吸附原理对文库进行筛选，优化构建、筛选及鉴定方法和步骤，得到所述降尿酸分子，用于制备降尿酸药物，所述分子具有卓越的降尿酸功能，筛选方法简洁高效，值得推广应用，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

Description

一种降尿酸分子及其筛选方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种分子及其筛选方法和应用，尤其涉及一种降尿酸分子及其筛选方法和应用。
背景技术
随着人们饮食结构的改变，特别是沿海的广东地区，高营养的鱼虾类、贝类等海鲜食品以及啤酒等饮品成为了人们的主要食物，而这种高嘌呤的饮食习惯，使得我国高尿酸血症的患者以每年9.7％的速率递增，且呈现出年轻化趋势，而由此引起的痛风等并发症也已成为我国仅次于糖尿病的第二大类代谢疾病，威胁到了我们身边每一个人的生活。高尿酸血症及痛风等并发症的主要诱因是体内尿酸浓度过高所导致。不但痛风、尿酸性肾病、尿酸性肾结石等是高尿酸血症的并发症，高血压、高脂血症、冠心病、脑中风和糖尿病的病发也与高尿酸血症密切相关。如何安全有效地治疗高尿酸血症，防治痛风已成为备受人们关注的课题。高尿酸血症及其痛风等并发症的高发性和普遍性，使得越来越多的科研工作者致力于该病的预防和治疗的研究。
目前，常用的降尿酸药物主要是化学合成类药物，虽有疗效，但都有一定的毒副作用。而生物工程类药物尿酸酶，是一种人体内不存在的、能分解尿酸成为尿囊素的酶，在临床上可迅速降低尿酸浓度，但需要非消化道给药，且外源性蛋白在体内会引起免疫反应。国内对降尿酸药物的研究主要集中在中药对尿酸降低及痛风症状治疗方面，有单独用中药治疗高尿酸血症的研究报道，如痹清胶囊、痛风颗粒、泄浊除痹汤等对高尿酸血症及其痛风患者都有一定疗效，黄柏和苍术提取物可降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平。也有中西结合治疗的研究报道，如用苯溴马隆与中药联用治疗高尿酸血症的有效率是90.63％，并减少了对胃肠道刺激的副作用。中西医结合分期综合治疗痛风性关节炎也获得了不错的疗效。在中药给药也有疗效慢，服用需煎煮、有一定副作用和机理不明确等缺陷。CN107753801A涉及一种降尿酸、降嘌呤、治疗痛风的药物组合物及其制备方法，通过采用葵花盘小分子肽、茯苓、玉米须、葛根、薏苡仁、赤藓糖醇等为原料并进行适当的重量配比，制成成品。其中，葵花碱和赤藓糖醇协同作用能和人体尿酸结合生成盐随尿液排出，小分子肽、玉米须和薏苡仁促进人体尿酸排泄，葵花碱和葛根具有强效溶解尿酸盐结晶的作用；CN102697972A提出了一种降尿酸药物，包括儿茶素、茶色素、茶叶复合糖和茶氨酸，并添加了适量的维生素C、原花青素，所述各组分按照以下比例进行配比：儿茶素：10％-40％，茶色素：10％-20％，茶叶复合糖：10％-20％，茶氨酸：5％-20％，维生素C：5％-20％，原花青素：10％-30％，该降尿酸药物能通过抑制黄嘌呤氧化酶活性、直接分解尿酸、改善肾功能促进尿酸排泄、保护血管等多个层面降低尿酸、解除尿酸对人体健康损害。
但目前临床防治主要使用的中药存在治疗机理不明、化学合成类药物存在毒副作用大、生物大分子有适应症等缺陷。特别对于那些只是尿酸浓度高、但还未出现明显并发症或者是只伴有轻微关节疼痛症状的人群，应用上述药物治疗往往会出现得不偿失的结果。而生物技术类药物往往是弥补化学药物缺陷的最好方法，而生物类小分子药物是弥补这些缺陷的最好方法，利用文库筛选尿酸小分子拮抗剂还未见研究报道。
噬菌体表面呈现抗体文库技术的建立，极大地拓展了抗体分子在生命科学研究领域中的应用，也为科研工作者提供了一种很有意义的生物学研究技术。噬菌体表面呈现随机多肽文库技术，是在噬菌体抗体库基础上研发的一种新型小分子蛋白文库，它与抗体库无论是构建还是筛选方面都依据着相同的原理，因此在生物学研究方面有着类似的功能和用途，但是与抗体库相比，随机多肽文库具备了许多抗体库所没有的特性，弥补了抗体库应用方面的不足，使得随机多肽文库用途更广泛：1、具有识别天然小分子有机物的特性，该特性为小分子识别的难题提供了解决途径；2、分子量小，具有更好的穿透能力，易于到达靶位点；3、多肽结构可塑性强，分子量小，更易与配体形成稳定的嵌合体结构；4、结构简单，由单一肽链构成，在文库构建及分子改造方面更容易操作，更易获得特异性更好的结合分子；5、缺乏了免疫效应器Fc段结构，避免了由此引起的不良免疫反应；6、多肽蛋白没有糖基化，不需要翻译后修饰，更适合在原核表达系统中表达，并易于扩大化生产；随机多肽文库为研究小分子有机物提供了一个类似抗体库的生物学技术方法，而人类的许多疾病都是小分子有机物在体内代谢紊乱引起的，阐明小分子的代谢机理对相关疾病的防治意义重大。
因此，建立生物类小分子筛选技术并研发高效而又低毒的生物类小分子降尿酸药物具有深远的社会意义和广阔的经济价值。
发明内容
针对现有技术的不足及市场的需求本发明提供了一种降尿酸分子及其筛选方法和应用，通过采用噬菌体展示技术构建随机突变文库，并构建尿酸靶分子，采用亲和吸附原理对文库进行筛选鉴定，得到所述降尿酸分子，所述分子具有卓越的降尿酸功能，且筛选方法简洁高效，值得推广应用，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
为实现上述目标，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种降尿酸分子，所述降尿酸分子的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
所述SEQ ID NO.1如下所示：ACPSTLIFATCGGGS.
所述降尿酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述SEQ ID NO.2如下所示：GCT TGT CCT TCT ACT CTT ATT TTT GCT ACT TGCGGT GGA GGT TCG.
本申请的发明人参阅大量文献并结合自身以往深厚的噬菌体呈现文库构建、改造与筛选的技术积累，针对明确高尿酸血症治疗药物中存在不足，以体内存在的天然分子为主体，利用噬菌体展示技术构建随机环八肽文库，经过优化筛选鉴定方法，最终获得拮抗尿酸与URAT1结合的多肽分子(命名为antiuriney)，来解决目前治疗药物存在的化学合成药物的毒副作用大、生物药物的免疫源性、中药的药效慢及作用机理不明等问题，国内外对随机环八文库的研究比较少，将随机环八文库用于阐明尿酸代谢机理，是本申请的创新研究，国内外还未见研究报道，为建立快速、简便、易行的小分子有害物的检测方法提供了分子基础。
第二方面，本发明一种筛选降尿酸分子的方法，包括如下步骤：
(1)以人工合成的随机环八肽为骨架蛋白，采用噬菌体展示技术构建随机突变环八肽文库；
(2)对步骤(1)构建的文库的库容和多样性进行检测，获得满足筛选要求的合格文库；
(3)构建尿酸靶分子，对步骤(2)得到的合格文库进行筛选，得到与靶分子有特异结合活性的噬菌体；
(4)对步骤(3)中得到的噬菌体进行鉴定，得到所述降尿酸分子。
优选地，步骤(1)所述构建文库的方法为：
(1’)设计合成编码随机环八肽的寡核苷酸片段，延伸引物扩增得到随机环八肽的基因片段；
(2’)将步骤(1’)的基因片段通过双酶切连接至噬菌体载体，得到重组产物；
(3’)将步骤(2’)得到的重组产物转入感受态细胞，获得噬菌体展示随机环八肽库，即为随机突变环八肽文库。
步骤(1’)所述寡核苷酸片段包括；
5’-GCT TGT(NNK)8TGC GGT GGA GGT-3′正链
即SEQ ID NO.3:GCT TGT NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK TGC GGT GGAGGT.
3’-CGA ACA(NNM)8ACG CCA CCT CCA-5′负链
即SEQ ID NO.4:CGA ACA NNM NNM NNM NNM NNM NNM NNM NNM ACG CCA CCTCCA.
Ala Cys Xxx8 Cys Gly Gly Gly肽链
N＝A or T or C or G；K＝G or T；M＝A or C
优选地，步骤(2’)所述双酶切的酶包括限制性内切酶，优选为EagI和KpnI限制性内切酶。
优选地，步骤(3’)所述转入的方法包括化学转染或电转，优选为电转。
优选地，步骤(3’)所述感受态细胞包括大肠杆菌TG1和/或ER2738感受态细胞，优选为大肠杆菌ER2738感受态细胞。
优选地，步骤(2)所述检测的方法为噬斑和测序法。
优选地，步骤(2)所述的筛选要求为库容大于1.0×109。
优选地，步骤(3)所述尿酸靶分子的构建方法为：降尿酸分子与BSA偶联，得到偶联后的尿酸分子作为靶分子。
优选地，步骤(3)所述筛选的方法为：采用亲和吸附法，以ELISA板为支持物，对噬菌体突变文库进行多轮的“吸附-洗脱-扩增”，将于靶分子有特异结合获悉的噬菌体富集和扩增。
优选地，步骤(4)所述鉴定的方法为ELISA和测序法。
作为优选技术方案，本发明提供一种筛选降尿酸的方法，具体包括如下步骤：
(1)以人工合成随机环八肽为骨架蛋白，采用噬菌体展示技术构建随机突变环八肽文库；
(1’)设计合成编码随机环八肽的寡核苷酸片段，延伸引物扩增得到随机环八肽的基因片段；
(2’)将步骤(1’)的基因片段通过EagI和KpnI限制性内切酶双酶切连接至M13KE噬菌体载体，得到重组产物；
(3’)将步骤(2’)得到的重组产物电转入大肠杆菌ER2738感受态细胞，获得噬菌体展示随机环八肽库，即为随机突变环八肽文库；
(2)采用噬斑及测序法对步骤(1)构建的文库的库容和多样性进行检测，获得库容超过7.5×109的合格文库；
(3)将尿酸分子与BSA偶联，构建尿酸靶分子，采用亲和吸附法，以ELISA板为支持物对步骤(2)得到的合格文库进行多轮的“吸附-洗脱-扩增”，将与靶分子有特异结合活性的噬菌体富集和扩增，得到与靶分子有特异结合活性的噬菌体；
(4)采用ELISA和测序法对步骤(3)中得到的噬菌体进行鉴定，得到所述降尿酸分子。
第三方面，本发明一种如第一方面所述的降尿酸分子或如第二方面所述方法制备得到的降尿酸分子用于制备降尿酸药物的应用。
本发明通过细胞和动物实验初步评价其体内外降尿酸的药效学及毒性，为研发安全有效的生物类降尿酸药物奠定基础，本申请得到的所筛选的降尿酸分子有望开发成为一类新药，因此具有巨大的经济效益潜能，同时有望造福广大高尿酸血症患者，具有改善人民健康节约医疗支出的深远社会意义；另外，本申请所建立的技术平台可广泛应用于对体内其它小分子代谢的研究，有望获得一系列具有自主知识产权的产品，具有产生专利池和产品群的重要的意义。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明提供的降尿酸分子为安全有效的生物类小分子，分子量小，穿透力强，易修饰，可塑性强，易于扩大生产，无毒副作用，作用机理明确，不引起免疫反应，具有特异的靶向性，性能卓越，大鼠实验为给药七天后降低至51.8±6.2，人近端肾小管内皮细胞HK-2中加入24小时后由起始浓度400μmol/L降至79.5±5.6μmol/L；
(2)本发明提供的筛选方法简洁高效，可拓展应用与其他小分子代谢的研究，易于推广普及。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1构建随机突变文库
通过自行设计，人工合成编码随机环八肽的寡核苷酸片段，通过延伸引物扩增获得编码随机环八肽的基因片段；将编码基因片段和M13KE噬菌体载体经过EagI和KpnI限制性内切酶双酶切后进行连接，重组产物电转入大肠杆菌ER2738感受态细胞获得噬菌体展示随机环八肽库，噬斑及测序检测库容和多样性；
所述寡核苷酸片段包括；
5’-GCT TGT(NNK)8TGC GGT GGA GGT-3′正链
即SEQ ID NO.3:GCT TGT NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK TGC GGT GGA GGT
3’-CGA ACA(NNM)8ACG CCA CCT CCA-5′负链
即SEQ ID NO.4:CGA ACA NNM NNM NNM NNM NNM NNM NNM NNM ACG CCA CCT CCA
Ala Cys Xxx8 Cys Gly Gly Gly肽链
N＝A or T or C or G；K＝G or T；M＝A or C
构建的环八肽库库容超过7.5×109，构建的噬菌体展示随机环八肽库的库容量与多样性都满足筛选要求，由于随机文库的容量太大(超过10的9次方)，在此不做展示。
实施例2对随机突变文库进行筛选
将尿酸分子与BSA偶联，以偶联后的尿酸分子为靶分子，以亲和吸附原理为基础，用支持物ELISA板对噬菌体突变文库进行多轮的“吸附－洗脱－扩增”，将与靶分子有特异结合活性的噬菌体富集和扩增。
实施例3对筛选得到的噬菌体进行鉴定
采用ELISA及竞争ELISA法鉴定能特异结合尿酸的噬菌体，结果如表1所示；
表1
Figure BDA0001778442780000081
Figure BDA0001778442780000091
由表1可知，筛选得到的噬菌体与偶联后的尿酸分子具有良好的结合能力。
采用测序法对筛选得到的噬菌体进行测序，得到的编码核苷酸序列及相应的氨基酸序列如下：
SEQ ID NO.2:GCT TGT CCT TCT ACT CTT ATT TTT GCT ACT TGC GGT GGA GGTTCG(核苷酸序列)
SEQ ID NO.1:ACPSTLIFATCGGGS.(氨基酸序列)
实施例4测定体外降尿酸作用
委托公司人工合成筛选确定的降尿酸分子Antiuriney相应的多肽；
检测Antiuriney对近端肾小管内皮细胞上URTA1转运尿酸分子的影响：培养人近端肾小管内皮细胞HK-2，培养液中加入尿酸及antiuriney分子，在12，24h的不同时间点留取样品，用全自动生化分析仪测定antiuriney分子加入前后URAT1分子转运尿酸浓度的变化，分析antiuriney分子对URAT1转运尿酸的影响，结果见表2所示；
表2
起始浓度(μmol/L) 12h(μmol/L) 24h(μmol/L)
400 138.1±11.3 79.5±5.6
由表2可知，antiuriney分子能明显降低尿酸浓度，对URAT1转运尿酸产生抑制作用，拮抗尿酸与URAT1结合。
实施例5动物实验
联合使用氧嗪酸和吡嗪酰胺建立大鼠高尿酸血症模型，大鼠尾静脉给药，分析antiuriney分子在大鼠体内的降尿酸作用，测定用药3、7天后大鼠血中的尿酸含量(μmol/L)，结果见表3；
表3
0天 3天 7天
antiuriney分子 129.4±26.3 83.3±11.6 51.8±6.2
生理盐水 121.2±19.2 123.5±16.4 98.7±8.3
由表3可知，antiuriney分子在大鼠体内具有明显的降尿酸作用，七天后降低至51.8±6.2μmol/L，因此表明，筛选获得的生物类antiuriney分子具有降尿酸作用，是一种新的降尿酸分子。
综上所述，本发明提供的降尿酸分子具有卓越的降尿酸功能，靶向特异，无毒副作用，是一种新的降尿酸分子，本发明提供的筛选方法简洁高效，可拓展应用与其他小分子代谢的研究，易于推广普及。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州济恒医药科技有限公司
<120> 一种降尿酸分子及其筛选方法和应用
<130> 2018年
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
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1 5 10 15
<210> 2
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<212> DNA
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<213> 人工合成
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<223> n is a, c, g, or t
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cgaacannmn nmnnmnnmnn mnnmnnmnnm acgccacctc ca 42

Claims (3)

1.一种降尿酸分子，其特征在于，所述降尿酸分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的降尿酸分子，其特征在于，所述降尿酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种如权利要求1或2所述的降尿酸分子用于制备降尿酸药物的应用。
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