CN103792232B - 一种检测二肽基肽酶ⅳ活性的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测二肽基肽酶Ⅳ活性的试剂盒,包括A液和B液，所述A液是将Gly-Pro-X多肽粉末溶解于PIPES缓冲液中制备而成，所述B液是将四氮唑盐、PMS和NaCl溶解于PIPES缓冲液中制备而成。本发明还公开了检测二肽基肽酶Ⅳ活性的试剂盒在检测二肽基肽酶Ⅳ活性方面的应用。本发明水溶性四唑盐以其独特的反应灵敏性和反应产物无毒性，将水溶性四氮唑盐作为二肽基肽酶Ⅳ活性检测的指示剂，既能达到高灵敏度的检测范围又对实验者和环境无任何污染。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种检测二肽基肽酶Ⅳ活性的试剂盒及其应用。
背景技术
二肽基肽酶Ⅳ在真核生物中能够介导T淋巴细胞和抗原递呈细胞之间的信号通路，例如涉及2型糖尿病病理过程中的信号传导过程，在免疫反应中具有重要生物学功能，目前更是成为免疫疾病治疗研究的靶分子和疾病治疗的诊断新指标；另外还广泛存在于细菌各个种属中，作为各种细菌致病性的毒力相关因子，为疾病预防和疫苗制备提供了新方向。随着对二肽基肽酶Ⅳ研究的深入，其活性检测方法也得到了不断改善。在碱性条件下，应用Gly-Pro-pNA为酶作用底物，水解后生成游离的对硝基苯胺和Gly-Pro（甘氨酸-脯氨酸）二肽，利用对硝基苯胺的化学发光性，动态检测405nm处吸光度即可测算出酶活性，此方法检测简易，但缺点是对硝基苯胺毒性为高毒物质，吸入或皮肤接触对人体有害。Promega公司推出一种基于荧光发光团的检测方法，灵敏度更高，速率更快，但检测需要特殊的荧光检测仪，且操作需要避免荧光的淬灭。
发明内容
发明目的：针对上述现有方案存在的问题和不足，本发明的第一个目的是提供了一种检测二肽基肽酶Ⅳ活性的试剂盒。本发明第二个目的是提供了试剂盒的应用。
技术方案：为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：一种检测二肽基肽酶Ⅳ活性的试剂盒,包括A液和B液，所述A液是将Gly-Pro-X多肽粉末溶解于PIPES缓冲液中制备而成，所述B液是将四氮唑盐、PMS和NaCl溶解于PIPES缓冲液中制备而成。
其中，上述PIPES缓冲液浓度为1mol/L。
其中，上述A液中Gly-Pro-X多肽浓度为50mmol/L。
其中，上述B液中水溶性四氮唑盐浓度为5mM，PMS浓度为0.2mM，NaCl浓度为0.15mM。
其中，上述水溶性四氮唑盐为市售的2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2h-四唑单钠盐。
其中，上述PMS为市售的1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯。
上述的检测二肽基肽酶Ⅳ活性的试剂盒在检测二肽基肽酶Ⅳ活性方面的应用。
本发明利用二肽基肽酶Ⅳ能够切割肽段N端倒数第二位的脯氨酸的特性，当酶进行水解反应时，切割甘氨酸-脯氨酸-X（Gly-Pro-X）生成甘氨酸-脯氨酸（Gly-Pro）二肽，同时在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）存在下，四氮唑盐接受酶反应过程中的氢离子，还原成橙黄色水溶性甲赞（formazan），动态检测450nm处吸光度测定二肽基肽酶Ⅳ的活性。一个酶活单位定义为在PH7.0，37℃条件下，每分钟消耗一个微摩尔底物Gly-Pro-X所需的酶量。其原理反应方程式见图1。
有益效果：与现有技术相比，本发明水溶性四唑盐以其独特的反应灵敏性和反应产物无毒性，将水溶性四氮唑盐作为二肽基肽酶Ⅳ活性检测的指示剂，既能达到高灵敏度的检测范围又对实验者和环境无任何污染。
附图说明
图1为本发明原理反应图；
图2为本发明试剂盒应用检测结果图。
具体实施方式
通过下面的实施例可以更详细的解释本发明，公开本发明的目的旨在保护本发明范围内的一切变化和改进，本发明并不局限于下面的实施例。
实施例1：检测二肽基肽酶Ⅳ活性的试剂盒的制备
检测二肽基肽酶Ⅳ活性的试剂盒,包括A液和B液，所述A液是将Gly-Pro-X多肽粉末溶解于PIPES缓冲液中制备而成，所述B液是将四氮唑盐、PMS和NaCl溶解于PIPES缓冲液中制备而成。
1mol/LPIPES缓冲液的配置：按配比称取PIPES（哌嗪-N，N-双（2-乙磺酸））自由酸，溶解于去离子水中，用NaOH调节PH至6.9，加去离子水定容至1mol/L，微孔滤器过滤除菌，4℃保存备用；
A液（酶反应底物溶液）的配置：将甘氨酸和脯氨酸的多肽Gly-Pro-X粉末（Gly-Pro-AMC艾美捷科技有限公司购买）溶解于1mol/LPIPES缓冲液中，配成浓度为50mmol/L，微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存。
B液（水溶性四氮唑盐指示液）的配置：按比例分别称取水溶性四氮唑盐、PMS、NaCl粉末溶解于1mol/LPIPES缓冲液中，混合均匀，微孔滤膜过滤除菌，-20℃避光保存。其中水溶性四氮唑盐指示液（B液）包含5mM水溶性四唑盐，0.2mMPMS，0.15mMNaCl。
所述的水溶性四氮唑盐为市售WST-8，即2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2，4-二磺基苯）-2H-四唑单钠盐；
所述的PMS为市售的1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）；本发明试剂盒中采用PIPES作为溶液缓冲液，能提供稳定的水溶性四氮唑盐反应条件和反应灵敏性，PIPES的pKa值接近生理pH，在通过细胞膜的时候不能被吸收，而且可透过紫外线，在37℃PIPES能稳定172小时，优于其它缓冲液，常被用来配置染液检测肿瘤细胞等。
实施例2：检测二肽基肽酶Ⅳ活性的试剂盒的应用
1、将能分泌产生二肽基肽酶Ⅳ的大肠杆菌1ml，LB培养基培养至对数培养期，离心收集细菌菌体，加入磷酸缓冲液制成1ml细菌悬液，超声裂解10min，10000rpm离心30min收集超声裂解上清，作为待测样本；
2、将待测样本每孔100μl加入96孔酶标检测板，设置三个重复孔；
3、然后在待测孔中加入10μlA液和10μlB液，空白对照设置为100μl磷酸盐缓冲液中加入10μlA液和10μlB液，37℃反应10min；
4、作为实验对照比较，使用购自其它公司的二肽基肽酶Ⅳ检测试剂(PromegaDPPIV-GloProteaseAssay(G8350)10ml)，按照步骤2，3同时进行实验；
5.酶标仪450nm，每5min检测一次吸光值，记录数据。一个酶活单位定义为每分钟消耗一微摩尔底物Gly-Pro-X所需的酶量。
实验结果见表1或图2，从表1或图2中可见，本发明配置的检测试剂盒在同样实验条件下，相比较同类试剂灵敏性更好，线性范围更宽。
本发明的试剂盒与市面上购买的试剂盒相比，检测的OD值比较：
表1
Claims (4)
1.一种检测二肽基肽酶Ⅳ活性的试剂盒,其特征在于，包括A液和B液，所述A液是将Gly-Pro-X多肽粉末溶解于PIPES缓冲液中制备而成，所述B液是将四氮唑盐、PMS和NaCl溶解于PIPES缓冲液中制备而成；A液的配置：将甘氨酸和脯氨酸的多肽Gly-Pro-X粉末溶解于1mol/LPIPES缓冲液中，配成浓度为50mmol/L，微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存；B液的配置：按比例分别称取四氮唑盐、PMS、NaCl粉末溶解于1mol/LPIPES缓冲液中，混合均匀，微孔滤膜过滤除菌，-20℃避光保存；B液包含5mM水溶性四氮唑盐，0.2mMPMS，0.15mMNaCl。
2.根据权利要求1所述的检测二肽基肽酶Ⅳ活性的试剂盒,其特征在于，所述四氮唑盐为市售的2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2h-四唑单钠盐。
3.根据权利要求1所述的检测二肽基肽酶Ⅳ活性的试剂盒,其特征在于，所述PMS为市售的1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯。
4.权利要求1~3任一项所述的检测二肽基肽酶Ⅳ活性的试剂盒在检测二肽基肽酶Ⅳ活性方面的应用。
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