CN105734112B - 一种检测土壤外源微生物数量的示踪计数方法 - Google Patents
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Abstract
一种检测土壤外源微生物数量的示踪计数方法，步骤如下：1)配制染料储备液和工作液；2)活化培养细菌，离心获取目标菌体，固定细胞，加入染料工作液避光染色制成染色菌体；3)将染色后的细菌加入土壤中培养，培养后采集土壤样品，振荡提取目标细菌，稀释后用黑色核孔滤膜过滤，然后置于载玻片上，封片；4)用荧光显微镜在紫外下观察计数，将计数所得数量转换为每千克干土所含微生物细胞数。本发明的优点是：该方法将荧光染色计数技术与荧光标记技术结合，对加入土壤中的外源微生物的生长和繁殖情况进行跟踪及定量；所使用的荧光染料操作方便快速、灵敏度极高、稳定性好且使用量非常少，提供了一种实用可靠的土壤外源微生物示踪计数方法。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物学领域，特别是一种检测土壤外源微生物数量的示踪计数方法。
背景技术
土壤是生命赖以生存的根基，农业是人类赖以生存的物质基础，但是目前，我国乃至全世界的土壤污染问题已相当严重，生物强化技术成为一种对受污染土壤进行原位修复的有效手段。生物强化技术是向目标土壤中施加对目标污染物具有一定处理能力的外源微生物，利用其新陈代谢反应进行修复。外源微生物能否正常的生长繁殖是微生物强化技术成败与否的关键。但是，目前，所添加的外源微生物究竟在所处理的土壤中是否能够长期存活并保持繁殖能力，尚未有一个明确的表征手段。
荧光染色直接计数法是最近30年来发展起来的用于细菌计数的新方法，它具有快速、准确等特点，在水样、土壤及沉积物等环境样品中细菌数量的测定中有着广泛的应用。1973年Francisco等(参见文献：Francisco DE,Mah RA,Rabin AC.Acridine orange-epifluorescence technique for counting bacteria in naturalwaters.Transactions ofthe American microscopical society,1973,92(3):416–421.)建立了基于AO染色体系的荧光显微镜染色计数法，以测定天然水体中的细菌总数。1980年Porter等(参见文献：Porter KG,Feig YS.The use ofDAPI for identifying andcounting aquatic microflora1.Limnology and oceanography,1980,25:943-948.)开始使用DAPI对细菌进行染色。在Porter等的基础上，Velji等(参见文献：Velji IM,AlbrightLJ.The dispersion of adhered marine bacteria by pyrophosphate and ultrasoundprior to direct counting.Colloquium international central nature recherchescience,1986,3:249-259.)采用超声波对海水、沉积物中的细菌以及海藻样品进行了前处理，再经DAPI染色法进行计数，取得较好效果。但是这些技术针对从水体、土壤、沉积物中的全部细菌进行染色计数，无法针对所加入的某一种外源微生物进行计数定量。
荧光标记技术指的是利用一些能发出荧光的物质，通过物理吸附或者共价结合到目标分子的某个基团上，利用其荧光特性提供被研究对象的信息。荧光染料，由于灵敏度高，操作方便，逐渐取代了放射性同位素作为检测标记，其广泛应用于医学及生物学领域关于荧光免疫，荧光探针，细胞染色等。荧光标记的单克隆抗体技术为流式细胞仪在研究细胞膜和细胞内各种功能性抗原、肿瘤基因蛋白等领域扩展了无限的应用空间。荧光探针可以通过蛋白质交联剂共价结合在单克隆抗体上。核酸荧光染料对细胞核染色后定量测量细胞所发出的荧光强度，就可以确定细胞核中DNA、RNA的含量，并可以对细胞周期和细胞的增殖状况进行分析。
4’,6’-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6’-Diamidino-2-Phenylindole，DAPI)是一种荧光染料，它可以以非常稳定的状态与DNA分子结合，可通过荧光显微镜观测。DAPI可以穿透完整的细胞膜，因此不仅适用于活细胞的染色，还可以对固定细胞进行染色。DAPI应用于显微水平的DNA研究，比其他的荧光染料具备以下优点：采用直接染色法，操作方便快速；灵敏度非常高，能检测到2×10-4pgDNA；稳定性好，荧光衰退期要低于其他染料；使用量非常少，通常不超过0.5μg/mL。
将荧光染色计数技术与荧光标记技术结合起来，将实现对加入土壤中的外源微生物的生长和繁殖情况进行跟踪调查。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术分析，提供一种操作方便、灵敏度高、稳定性好的检测土壤外源微生物数量的示踪计数方法，从而评价加入土壤的外源微生物能否正常的生长繁殖从而发挥最大活性。
本发明的技术方案：
一种检测土壤外源微生物数量的示踪计数方法，以枯草芽孢杆菌为出发菌种，通过紫外诱变得到对重金属镉有高效耐受性和吸附能力的诱变菌种B38，步骤如下：
1.试剂的配制
1)生理盐水的配制：将氯化钠溶于蒸馏水中，氯化钠与蒸馏水的用量比为0.85g：100mL，将制得的0.85wt％生理盐水于121℃下高压灭菌30min后备用；
2)4’,6’-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)储备液的配制：用双蒸水将DAPI粉末配制成1.0mg/mL的储备液，于-20℃保存备用；
3)4’,6’-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)工作液的配制：用pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液稀释DAPI储备液至0.1μg/mL，制得DAPI工作液，于4℃保存备用；
2.DAPI染料对微生物的荧光染色方法
1)选取一环B38细菌接种于液体牛肉膏-蛋白胨培养基中，于35℃活化培养至对数生长期中段，取1mL活化的B38菌悬液，接种于100mL液体牛肉膏-蛋白胨培养基，于35℃、150rpm下，扩大培养10h；
2)取10mL菌悬液，9000rpm离心10min，弃去上清液，用灭菌的0.85wt％生理盐水重新悬浮菌体，加入37wt％的甲醛溶液固定B38细胞；取2mL固定后的菌悬液，加入0.2mL的DAPI工作液，避光染色15min，然后用0.85wt％的生理盐水洗涤6次，以洗去多余的染料；
3.DAPI标记细菌的土壤荧光示踪计数方法
将染色后的细菌加入土壤后于人工气候箱中培养，温度控制在25±1℃，光周期为12:12，定期浇水以保持一定的土壤湿度；培养后采集0.5g土壤样品，加入10mL生理盐水于室温下振荡提取土壤中的细菌；取10mL提取液，稀释至106倍；将2mL菌悬液用0.22μm的黑色核孔滤膜过滤，将核孔膜置于载玻片上，封片，用荧光显微镜在紫外下观察计数，土壤微生物数量的计算方法为，将计数所得数量转换为每千克干土所含微生物数(cells/g)。
所述步骤2.1)中液体牛肉膏-蛋白胨培养基的配制方法为：准确称取蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、牛肉膏5g/L，用1mol/L的盐酸和1mol/L的氢氧化钠调节pH＝7.2，制成牛肉膏-蛋白胨液体培养基，然后在121℃高压蒸汽灭菌30min备用。
本发明的优点是：
本发明将荧光染色计数技术与荧光标记技术结合起来，使得对加入土壤中的外源微生物的生长和繁殖情况的跟踪及定量成为可能；本发明所使用的荧光染料操作方便快速、灵敏度极高、稳定性好且使用量非常少，提供了一种实用可靠的土壤外源微生物示踪计数方法。
附图说明
图1是染色固定后的细菌通过50倍物镜观察的效果图。
图2是染色固定后的细菌菌悬液稀释106倍便于进行计数通过50倍物镜观察的效果图。
图3是外源细菌在土壤中的荧光标记示踪计数结果(不施加外源细菌的土壤为对照)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和实施例对本发明做进一步的说明，但不是限制本发明。
实施例：
一种检测土壤外源微生物数量的示踪计数方法，以枯草芽孢杆菌为出发菌种，通过紫外诱变5min得到对重金属镉有高效耐受性和吸附能力的诱变菌种B38，步骤如下：
1.试剂的配制
1)生理盐水的配制：将氯化钠溶于蒸馏水中，氯化钠与蒸馏水的用量比为0.85g：100mL，将制得的0.85wt％生理盐水于121℃下高压灭菌30min后备用；
2)4’,6’-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)储备液的配制：用双蒸水将DAPI粉末配制成1.0mg/mL的储备液，于-20℃保存备用；
3)4’,6’-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)工作液的配制：用pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液稀释DAPI储备液至0.1μg/mL，制得DAPI工作液，于4℃保存备用；
2.DAPI染料对微生物的荧光染色方法
1)选取一环B38细菌接种于液体牛肉膏-蛋白胨培养基中，于35℃活化培养至对数生长期中段，取1mL活化的B38菌悬液，接种于100mL液体牛肉膏-蛋白胨培养基，于35℃、150rpm下，扩大培养10h；所述液体牛肉膏-蛋白胨培养基的配制方法为：准确称取蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、牛肉膏5g/L，用1mol/L的盐酸和1mol/L的氢氧化钠调节pH＝7.2，制成牛肉膏-蛋白胨液体培养基，然后在121℃高压蒸汽灭菌30min备用；
2)取10mL菌悬液，9000rpm离心10min，弃去上清液，用灭菌的0.85wt％生理盐水重新悬浮菌体，加入37wt％的甲醛溶液固定B38细胞；取2mL固定后的菌悬液，加入0.2mL的DAPI工作液，避光染色15min，然后用0.85wt％的生理盐水洗涤6次，以洗去多余的染料；
图1是染色固定后的细菌通过50倍物镜观察的效果图。图中可见DAPI对诱变菌B38的荧光染色结果，视野中可见强度较为适合的荧光反应，核孔滤膜上出现一层厚厚的蓝色菌膜，染色成功，但是存在菌体浓度过高的问题，因此需要进行稀释以定量。
3.DAPI标记细菌的土壤荧光示踪计数方法
将染色后的细菌加入土壤后于人工气候箱中培养，温度控制在25±1℃，光周期为12:12，定期浇水以保持一定的土壤湿度。培养第1、5、10、20、30、60天采集0.5g土壤样品，加入10mL生理盐水于室温下200rpm振荡15min以提取土壤中的细菌。取10mL提取液，稀释至106倍。将2mL菌悬液用0.22μm的黑色核孔滤膜过滤，将核孔膜置于载玻片上，封片，用荧光显微镜在紫外下观察计数。土壤微生物数量的计算方法为，将计数所得数量转换为每千克干土所含微生物数(cells/g)。
图2是染色固定后的细菌菌悬液稀释106倍便于进行计数通过50倍物镜观察的效果图。如图可见菌体较为分散，荧光反应强度适中，因而0.1μg/mL的DAPI染料浓度、菌悬液稀释106倍的实验条件适合于进一步的示踪和计数定量研究。
初始接种菌悬液菌体浓度为(5.58±0.13)×108cells/mL，以2wt％的接种量接种于800g不同处理的土壤中，计算得到土壤B38初始浓度为(1.12±0.03)×107cells/g。采集第1、5、10、20、30、60天的土壤样品对B38诱变菌进行荧光计数。
图3是外源细菌在土壤中的荧光标记示踪计数结果(不施加外源细菌的土壤为对照)。添加未进行荧光标记的B38菌体的对照组观察不到荧光反应。添加荧光标记的B38的一组，土壤B38菌体浓度呈不断上升的状态，30d之后基本平衡，60d菌体浓度没有明显变化，趋于稳定。
DAPI示踪计数技术证明了外源细菌B38在目标土壤中生长繁殖状况良好，能够发挥应有活性，生物强化处理技术在受污染土壤上得到了成功的应用。
Claims (2)
1.一种检测土壤外源微生物数量的示踪计数方法，其特征在于以枯草芽孢杆菌为出发菌种，通过紫外诱变得到对重金属镉有高效耐受性和吸附能力的诱变菌种B38，步骤如下：
(1).试剂的配制
1)生理盐水的配制：将氯化钠溶于蒸馏水中，氯化钠与蒸馏水的用量比为0.85g：100mL，将制得的0.85wt％生理盐水于121℃下高压灭菌30min后备用；
2)4’,6’-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)储备液的配制：用双蒸水将DAPI粉末配制成1.0mg/mL的储备液，于-20℃保存备用；
3)4’,6’-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)工作液的配制：用pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液稀释DAPI储备液至0.1μg/mL，制得DAPI工作液，于4℃保存备用；
(2).DAPI染料对微生物的荧光染色方法
1)选取一环B38细菌接种于液体牛肉膏-蛋白胨培养基中，于35℃活化培养至对数生长期中段，取1mL活化的B38菌悬液，接种于100mL液体牛肉膏-蛋白胨培养基，于35℃、150rpm下，扩大培养10h；
2)取10mL菌悬液，9000rpm离心10min，弃去上清液，用灭菌的0.85wt％生理盐水重新悬浮菌体，加入37wt％的甲醛溶液固定B38细胞；取2mL固定后的菌悬液，加入0.2mL的DAPI工作液，避光染色15min，然后用0.85wt％的生理盐水洗涤6次，以洗去多余的染料；
(3).DAPI标记细菌的土壤荧光示踪计数方法
将染色后的细菌加入土壤后于人工气候箱中培养，温度控制在25±1℃，光周期为12:12，定期浇水以保持一定的土壤湿度；培养后采集0.5g土壤样品，加入10mL生理盐水于室温下振荡提取土壤中的细菌；取10mL提取液，稀释至106倍；将2mL菌悬液用0.22μm的黑色核孔滤膜过滤，将核孔膜置于载玻片上，封片，用荧光显微镜在紫外下观察计数，土壤微生物数量的计算方法为，将计数所得数量转换为每千克干土所含微生物数(cells/kg)。
2.根据权利要求1所述检测土壤外源微生物数量的示踪计数方法，其特征在于：所述步骤(2).1)中液体牛肉膏-蛋白胨培养基的配制方法为：准确称取蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、牛肉膏5g/L，用1mol/L的盐酸和1mol/L的氢氧化钠调节pH＝7.2，制成牛肉膏-蛋白胨液体培养基，然后在121℃高压蒸汽灭菌30min备用。
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