CN114544437B - 一种煤岩流场原位荧光菌显微示踪方法 - Google Patents
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Abstract
一种煤岩流场原位荧光菌显微示踪方法，属于含瓦斯煤层水力化措施效果评价方法。本发明的显微示踪方法以双波段荧光示踪菌作为示踪介质，以正负压潮汐供给方式完成示踪介质在煤层裂隙的初级分布，借助荧光菌个体小(个体尺寸<5μm)并且不可继续分割、特定波长光照射下可被激发荧光、有双波段荧光特征、菌体可通过离心实现浓缩、具备敏感因子自主趋避特性；利用示踪菌自身的敏感因子趋避特征进一步完成菌种在介孔的分布。优点：(1)不会因为煤层水干扰导致示踪介质无限稀释；(2)双波长可被激发荧光特性决定了示踪介质容易被观测，识别敏感度高；(3)介质能够充分的分布在介孔裂隙空间，水力化措施效果评价的敏感度更高。
Description
技术领域
本发明涉及含瓦斯煤层水力化措施效果评价方法，特别是一种煤岩流场原位荧光菌显微示踪方法。
背景技术
水力化措施(水力压裂、煤层注水等)是增加煤岩体透气性、促进瓦斯解吸、提高煤层瓦斯抽采效果的有效技术途径，其具有影响范围大、增透效果显著等优势，广泛应用于低透气性煤层的增透。但是，由于水具有无色无味特征、并且煤岩体不透光，水力化措施技术实施过程中无法明确判定注入水的流动方向、影响范围、及其制约因素，从而导致水力化措施的执行效果具有极大的不确定性和不可控性。
水力化措施效果评价以及目前所采用主要的三种技术方法：
(1)有效浸润范围的含水率测定分析：水力化措施实施后的有效湿润范围、湿润程度及湿润的分布状态是衡量水力化措施的一种关键指标，常规的探测方法是采用煤样含水率增值分析法，即由取样点绘制出沿钻孔周围水分增值分布曲线或区域分布状态图，以此确定整个注水区域煤层的湿润分布状态。但由于煤层水分变化的复杂性，该方法可靠性相对较差。
(2)离子示踪法：将示踪离子与水混合注入煤岩体，在不同点位取样分析样品中示踪离子的含量，并绘制离子浓度分布曲线或区域分布状态图，确定水力化措施的有效范围。但是该种方法伴随注入液在煤层水的稀释与吸附作用下离子浓度逐步降低，同时受煤体元素构成复杂、示踪离子与煤层化学组分的化学反应等因素干扰，离子示踪法存在抗干扰能力弱、受分析设备敏感度影响大等问题；甚至当示踪粒度过度稀释后导致水力化措施远端无法准确测得的难题受当前测试技术限制无法解决。
(3)气体示踪法：该方法与离子示踪法类似，用示踪气体替代示踪离子。通过示踪气体煤岩体中的流动/渗流实现分布。通过分析不同点位样品中示踪气体含量，绘制离子浓度分布曲线或区域分布状态图，确定水力化措施的有效范围。气体示踪解决了煤层水与煤层组分的干扰问题，但是该种方法仍然存在两项技术难题：①煤层气对示踪气体具有稀释和干扰作用，当示踪气体被煤层气过度稀释时，示踪气体的测试分析难度变大，从而降低示踪技术敏感度；②受煤体介孔裂隙空间水封堵效应的影响，示踪气体难以在介孔裂隙空间有效分布，由此气体示踪只能用于大裂隙贯通情况的分析，不适用于水力化措施评价。
综合以上测试技术，水力化测试评价技术普遍存在以下技术难题：
技术难题1：煤层水和煤层气对示踪剂的稀释作用导致示踪干扰因素多，当示踪剂过度稀释时无法利用物理方法富集，致使难以测得，从而降低示踪技术敏感度。
技术难题2：受煤体介孔裂隙空间水封堵效应的影响，无论离子示踪还是气体示踪，示踪剂难以在介孔裂隙空间有效分布。
迫切需求一种新的示踪技术解决以上技术难题。
发明内容
技术问题：本发明的目的是要克服现有技术中的不足之处，提供一种可靠性高、辨识度高、操作简单、成本低廉的一种煤岩流场原位荧光菌显微示踪方法；解决为提高水力化措施效果评价需要解决的技术难题。
技术方案：本发明的目的是这样实现的，本发明的一种煤岩流场原位荧光菌显微示踪方法，利用荧光菌为示踪介质，借助荧光菌个体小(个体尺寸<5μm)并且不可继续分割、特定波长光照射下可被激发荧光、有双波段荧光特征、菌体可通过离心实现浓缩、具备敏感因子自主趋避特性。
具体技术实施方案如下：
步骤(1)菌种获取、预培育、与示踪菌剂配置：选用一种具有双波段荧光特征、个体尺寸小于5μm，并且具有敏感因子自主规避能力的菌种为示踪菌，预培育至菌群密度达到1*109个/mL，方法实施前将培育好的菌种密度稀释到1*107个/mL，并以荧光菌抑制剂量的50％浓度添加敏感因子，完成示踪菌剂的配置；
所述的菌种获取是在自然界中寻找符合以下4项条件的菌种为示踪菌；所述的自然界为海洋环境或土壤环境：
①示踪菌本身具备双波段荧光特征，两种激发光的波长差≥100nm；被激发的荧光光谱范围限制在400nm-800nm，并且两种被激发的荧光波长差≥100nm；激发光波长与被激发荧光波长之差≥50nm；
②示踪菌来源于非煤地质环境的自然界，确保示踪菌与煤层菌种具备显著荧光特征差异；
③示踪菌自身具有运动特征、有显著的敏感因子趋避特性，能够自主向低敏感因子环境移动的能力；
④示踪菌的菌株直径小于2μm，长度小于5μm。
步骤(2)煤体关键参数测定与分析：测定待实施煤层煤样的孔隙分布，并计算介孔和大孔的孔隙比表面积，记为示踪有效比表面积；所述的介孔的孔径为2～50nm，大孔的孔径＞50nm；
所述的参数测定与分析具体为：煤样粉碎分别过120目筛、180目筛、和300目筛，分别填充透析柱并压实；测定不同粒径煤粉透析柱进-出端菌种数量差，根据不同煤样粒径透析柱的孔隙分布参数求得煤孔隙荧光菌粘滞系数；煤孔隙荧光菌粘滞系数是由于煤裂隙表面对示踪菌的吸附特性，粘滞系数越高代表煤孔隙对菌种的吸附作用越显著；反之粘滞系数越低代表煤孔隙对菌种的吸附作用越弱；并且粘滞系数随煤裂隙表面光滑度增高而降低，随荧光菌细胞壁光滑度升高而降低；所述的120目筛的筛孔直径为120μm、180目筛的筛孔直径80μm、300目筛的筛孔直径48μm，所述的填充透析柱的长度1000mm，直径30mm。
所述的煤孔隙荧光菌粘滞系数是煤裂隙表面对示踪菌的吸附特性，粘滞系数越高代表煤孔隙对菌种的吸附作用越显著；反之粘滞系数越低代表煤孔隙对菌种的吸附作用越弱；并且粘滞系数随煤裂隙表面的光滑度增高而降低，随荧光菌细胞壁光滑度增高而降低。
步骤(3)菌种扩散半径设计：根据煤孔隙荧光菌粘滞系数和示踪有效比表面积，评估菌种最大扩散半径，并划分示踪菌高丰度半径(RH)、示踪菌中丰度半径(RM)、示踪菌低丰度半径(RL)、示踪菌微量分布半径(RT)、示踪菌痕量分布半径(RTA)5个范围区域，并设计空间取点布置图；所述的高丰度半径RH：煤样中菌种密度>1*106个/g煤、示踪菌中丰度半径RM：煤样中菌种密度:1*105-1*106个/g煤、示踪菌低丰度半径RL：煤样中菌种密度:1*104-1*105个/g煤、示踪菌微量分布半径RT：煤样中菌种密度:1*103-1*104个/g煤、示踪菌痕量分布半径RTA：煤样中菌种密度:<1*103个/g煤；
步骤(4)正负压潮汐法与示踪菌敏感因子趋避法的示踪菌剂供给：采用正负压潮汐供给方法在煤层裂隙中形成正压和负压震荡场，使注入到煤层中的示踪菌剂在煤层裂隙中快速、均匀分布；菌剂注入完成后静置48小时，使示踪菌利用自身敏感因子趋避特征向正负压潮汐供给未能涉及的区域运移，并吸附在煤裂隙表面并逐渐稳定；
所述的示踪菌剂供给的具体方案是：通过控制泵体单向阀的连通形式，改变泵体功能并形成注入和抽出两种动作方式；
示踪菌注入前，首先采用抽出方式将煤裂隙内压强将至-0.1KPa，抽出的煤层水放空；将泵体改为注入方式，将示踪菌剂注入煤层，直到注入压强达到8.0MPa；
然后示踪菌的注入转入正负压潮汐供给方式，此时泵体在注入与抽出方式交替进行，抽出液体暂存在缓冲水箱；
正负压潮汐供给方式中注入改为抽出的条件是:泵头压升高至8.0MPa；抽出改为注入的条件是：泵头压强降低至-0.1KPa；
正负压潮汐供给方式除了泵体动作的控制外，由于煤层中被吸附的煤层气在负压条件下更易解吸，从而正负压潮汐供给方式是泵体与介孔内解吸气相互配合下使注入的示踪菌在煤层裂隙中做类似活塞运动、以往复运行形式让示踪菌在煤层2-50μm的介孔内的分布趋于均匀。
步骤(5)取样：根据空间取点布置图，预设示踪菌丰度分布，利用定点钻采采样法定点、定深度采取粉状煤样，每点位取样100g；
步骤(6)菌液获取：根据步骤(5)预设的示踪菌丰度分布，对示踪菌高丰度半径(RH)、示踪菌中丰度半径(RM)、示踪菌低丰度半径(RL)范围内的荧光菌实施菌液提取；对示踪菌微量分布半径(RT)、示踪菌痕量分布半径(RTA)范围内的荧光菌实施浓缩菌液提取；
所述的对示踪菌高丰度半径(RH)、示踪菌中丰度半径(RM)、示踪菌低丰度半径(RL)范围内的荧光菌菌液提取方法：煤样与超纯水以质量比按3:7混合，充分震荡后3000×g离心5min，取上清液1mL为提取菌液；
所述的对示踪菌微量分布半径(RT)、示踪菌痕量分布半径(RTA)范围内的荧光菌浓缩菌液提取方法：煤样与超纯水以质量比按3:7混合，充分震荡后3000×g离心5min，取上清液100mL，然后将100mL上清液15000×g离心10min，弃上清液，留浓缩菌液1mL为浓缩菌液。
步骤(7)示踪菌分布测定与分析：提取菌液和浓缩菌液样本分别采用荧光显微镜计数，显微观察中采用一种荧光为基础测试荧光，另一种荧光为校验荧光，以减小煤中相似菌的干扰；提取菌液的计数结果即为菌种密度实际值；浓缩菌液的计数结果乘以10-2为菌种密度实际值；根据试验中采用煤样实际重量，将菌种密度实际值单位换算为：个/g煤；所述的菌种密度实际值的单位：个/mL；
步骤(8)示踪菌实际分布半径的修正：如果示踪菌微量分布半径(RT)取样中某一点数据或某一组数据的菌种密度实际值≥示踪菌低丰度半径(RL)的最小值，说明示踪菌剂更多的沿这一方向扩散，此时以注入点为圆心，菌群密度显著高于设计水平的方向为中心轴向，以±45°夹角扩大1.2倍示踪菌微量分布半径(RT)和示踪菌痕量分布半径(RTA)扩大取样范围继续取样，扩大后示踪菌微量分布半径记为：1.2RT，示踪菌痕量分布半径记为：1.2RTA；直到所有示踪菌微量分布半径(RT)取样的数值小于示踪菌低丰度半径(RL)最小值，取样结束；
步骤(9)示踪菌分布图绘制：根据各取样点的空间坐标和各样品的计数结果绘制三维示踪菌分布等高图，并完成水力化措施效果评价。
有益效果，由于采用了上述技术方案，本发明利用双波段荧光示踪菌、正负压潮汐供给方法的相互配合，能对含瓦斯煤岩体内注入液的扩散轨迹与迁移规律进行分析，对裂隙贯通标定，还能对含瓦斯煤层水力化措施效果进行评价。
针对现在技术存在的技术难题1：煤层水和煤层气对示踪剂的稀释作用导致示踪干扰因素多，当示踪剂过度稀释时无法利用物理方法富集，致使难以测得，从而降低示踪技术敏感度。
本发明利用源自非煤环境的双波段荧光示踪菌作为示踪介质，基于菌种具备不可分割特征，任意稀疏度均可通过洗脱+离心实现富集，能够显微镜下轻易被观测；基于示踪菌属于外源菌并具备双波长可被激发荧光特征，菌株荧光特征与煤层本源微生物存在显著差异，能有效排除煤层本源菌干扰对技术的影响。
针对现在技术存在的技术难题2：受煤体介孔裂隙空间水封堵效应的影响，示踪剂难以在介孔裂隙空间有效分布。
本发明所采用的正负压潮汐供给方式不同于传统高压注水；由于煤层中吸附有煤层气，当采用注入与抽出交替方式注入过程中，注入液与煤层气的解吸作用相互配合，使液体像活塞一样在煤层中运动，加速了示踪菌在煤层中的扩散，并且由于示踪菌的个体小大小于介孔尺寸，能轻易进入介孔；因为示踪菌剂中添加了50％抑制剂量浓度的敏感因子，在示踪菌的趋避运动下自主向敏感因子浓度更低的介孔水封堵空间运移。两种作用的结合充分解决了示踪介质分布受制于介孔水封堵作用的难题。
本发明提高了水力化措施效果评价精度、控制评价成本，解决了以上技术难题，其功能及有益效果如下：
(1)介质大小为μm级的微小的独立体：示踪介质大小1-10μm的独立体，具备μm尺度上的不可分割特征；
(2)介质可通过物理手段浓缩并可被光学观测：即使介质被无限稀释，仍然像水仓中的发光球；介质可通过常温物理操作实现浓缩(如离心或过滤)；特定波长光照射下能够激发荧光，为提高示踪介质的抗干扰能力，还应具有双荧光特征；可通过光学显微镜被观测；煤样中的介质计数量纲为：个/g煤；
(3)示踪介质自身具备运动特征：能主动规避具有抑制特征的敏感因子，以此可通敏感因子浓度差向低浓度区域主动移动。
优点：与现有煤炭水力化措施示踪技术相比，优点与有益效果体现在：
(1)不会因为煤层水干扰导致示踪介质无限稀释；
(2)双波长可被激发荧光特性决定了示踪介质容易被观测，识别敏感度高；
(3)介质能够充分的分布在介孔裂隙空间，水力化措施效果评价的敏感度更高。
附图说明：
图1为本发明的技术路线图。
图2为本发明的纵向取样点分布图。
图3为本发明的切面取样点分布图。
图4为本发明的示踪菌痕量取样范围扩大示意图。
具体实施方式
下面结合附图中的实施例对本发明作进一步的描述：
实施例1：本发明的一种煤岩流场原位荧光菌显微示踪方法，利用荧光菌为示踪介质，借助荧光菌个体小(个体尺寸<5μm)并且不可继续分割、特定波长光照射下可被激发荧光、有双波段荧光特征、菌体可通过离心实现浓缩、具备敏感因子自主趋避特性。
具体技术实施方案如下(图1)：
步骤(1)菌种获取、预培育、与示踪菌剂配置：选用一种具有双波段荧光特征、个体尺寸小于5μm，并且具有敏感因子自主规避能力的菌种为示踪菌，预培育至菌群密度达到1*109个/mL，方法实施前将培育好的菌种密度稀释到1*107个/mL，并以荧光菌抑制剂量的50％浓度添加敏感因子，完成示踪菌剂的配置；
所述的菌种获取是在自然界中寻找符合以下4项条件的菌种为示踪菌；所述的自然界为海洋环境或土壤环境：
①示踪菌本身具备双波段荧光特征，两种激发光的波长差≥100nm；被激发的荧光光谱范围限制在400nm-800nm，并且两种被激发的荧光波长差≥100nm；激发光波长与被激发荧光波长之差≥50nm；
②示踪菌来源于非煤地质环境的自然界，确保示踪菌与煤层菌种具备显著荧光特征差异；
③示踪菌自身具有运动特征、有显著的敏感因子趋避特性，能够自主向低敏感因子环境移动的能力；
④示踪菌的菌株直径小于2μm，长度小于5μm。
步骤(2)煤体关键参数测定与分析：测定待实施煤层煤样的孔隙分布，并计算介孔和大孔的孔隙比表面积，记为示踪有效比表面积；所述的介孔的孔径为2～50nm，大孔的孔径＞50nm；
所述的参数测定与分析具体为：煤样粉碎分别过120目筛、180目筛、和300目筛，分别填充透析柱并压实；测定不同粒径煤粉透析柱进-出端菌种数量差，根据不同煤样粒径透析柱的孔隙分布参数求得煤孔隙荧光菌粘滞系数；煤孔隙荧光菌粘滞系数是由于煤裂隙表面对示踪菌的吸附特性，粘滞系数越高代表煤孔隙对菌种的吸附作用越显著；反之粘滞系数越低代表煤孔隙对菌种的吸附作用越弱；并且粘滞系数随煤裂隙表面光滑度增高而降低，随荧光菌细胞壁光滑度升高而降低；所述的120目筛的筛孔直径为120μm、180目筛的筛孔直径80μm、300目筛的筛孔直径48μm，所述的填充透析柱的长度1000mm，直径30mm。
所述的煤孔隙荧光菌粘滞系数是煤裂隙表面对示踪菌的吸附特性，粘滞系数越高代表煤孔隙对菌种的吸附作用越显著；反之粘滞系数越低代表煤孔隙对菌种的吸附作用越弱；并且粘滞系数随煤裂隙表面的光滑度增高而降低，随荧光菌细胞壁光滑度增高而降低。
步骤(3)菌种扩散半径设计：根据煤孔隙荧光菌粘滞系数和示踪有效比表面积，评估菌种最大扩散半径，并划分示踪菌高丰度半径(RH)、示踪菌中丰度半径(RM)、示踪菌低丰度半径(RL)、示踪菌微量分布半径(RT)、示踪菌痕量分布半径(RTA)5个范围区域，并设计空间取点布置图(图2、图3所示)；所述的高丰度半径RH：煤样中菌种密度>1*106、个/g煤示踪菌中丰度半径RM：煤样中菌种密度:1*105-1*106个/g煤、示踪菌低丰度半径RL：煤样中菌种密度:1*104-1*105个/g煤、示踪菌微量分布半径RT：煤样中菌种密度:1*103-1*104个/g煤、示踪菌痕量分布半径RTA：煤样中菌种密度:<1*103个/g煤；
步骤(4)正负压潮汐法与示踪菌敏感因子趋避法的示踪菌剂供给：采用正负压潮汐供给方法在煤层裂隙中形成正压和负压震荡场，使注入到煤层中的示踪菌剂在煤层裂隙中快速、均匀分布；菌剂注入完成后静置48小时，使示踪菌利用自身敏感因子趋避特征向正负压潮汐供给未能涉及的区域运移，并吸附在煤裂隙表面并逐渐稳定；
所述的示踪菌剂供给的具体方案是：通过控制泵体单向阀的连通形式，改变泵体功能并形成注入和抽出两种动作方式；
示踪菌注入前，首先采用抽出方式将煤裂隙内压强将至-0.1KPa，抽出的煤层水放空；将泵体改为注入方式，将示踪菌剂注入煤层，直到注入压强达到8.0MPa；
然后示踪菌的注入转入正负压潮汐供给方式，此时泵体在注入与抽出方式交替进行，抽出液体暂存在缓冲水箱；
正负压潮汐供给方式中注入改为抽出的条件是:泵头压升高至8.0MPa；抽出改为注入的条件是：泵头压强降低至-0.1KPa；
正负压潮汐供给方式除了泵体动作的控制外，由于煤层中被吸附的煤层气在负压条件下更易解吸，从而正负压潮汐供给方式是泵体与介孔内解吸气相互配合下使注入的示踪菌在煤层裂隙中做类似活塞运动、以往复运行形式让示踪菌在煤层2-50μm的介孔内的分布趋于均匀。
步骤(5)取样：根据空间取点布置图(图2、图3)，预设示踪菌丰度分布，利用定点钻采采样法定点、定深度采取粉状煤样，每点位取样100g；
步骤(6)菌液获取：根据步骤(5)预设的示踪菌丰度分布，对示踪菌高丰度半径(RH)、示踪菌中丰度半径(RM)、示踪菌低丰度半径(RL)范围内的荧光菌实施菌液提取；对示踪菌微量分布半径(RT)、示踪菌痕量分布半径(RTA)范围内的荧光菌实施浓缩菌液提取；
所述的对示踪菌高丰度半径(RH)、示踪菌中丰度半径(RM)、示踪菌低丰度半径(RL)范围内的荧光菌菌液提取方法：煤样与超纯水以质量比按3:7混合，充分震荡后3000×g离心5min，取上清液1mL为提取菌液；
所述的对示踪菌微量分布半径(RT)、示踪菌痕量分布半径(RTA)范围内的荧光菌浓缩菌液提取方法：煤样与超纯水以质量比按3:7混合，充分震荡后3000×g离心5min，取上清液100mL，然后将100mL上清液15000×g离心10min，弃上清液，留浓缩菌液1mL为浓缩菌液。
步骤(7)示踪菌分布测定与分析：提取菌液和浓缩菌液样本分别采用荧光显微镜计数，显微观察中采用一种荧光为基础测试荧光，另一种荧光为校验荧光，以减小煤中相似菌的干扰；提取菌液的计数结果即为菌种密度实际值(单位：个/mL)；浓缩菌液的计数结果乘以10-2为菌种密度实际值(单位：个/mL)；根据试验中采用煤样实际重量，将菌种密度实际值单位换算为：个/g煤；
步骤(8)示踪菌实际分布半径的修正：如果示踪菌微量分布半径(RT)取样中某一点数据或某一组数据的菌种密度实际值≥示踪菌低丰度半径(RL)的最小值，说明示踪菌剂更多的沿这一方向扩散，此时以注入点为圆心，菌群密度显著高于设计水平的方向为中心轴向，以±45°夹角扩大1.2倍示踪菌微量分布半径(RT)和示踪菌痕量分布半径(RTA)扩大取样范围继续取样(图4)，扩大后示踪菌微量分布半径记为：1.2RT，示踪菌痕量分布半径记为：1.2RTA；直到所有示踪菌微量分布半径(RT)取样的数值小于示踪菌低丰度半径(RL)最小值，取样结束；
步骤(9)示踪菌分布图绘制：根据各取样点的空间坐标和各样品的计数结果绘制三维示踪菌分布等高图，并完成水力化措施效果评价。
Claims (5)
1.一种煤岩流场原位荧光菌显微示踪方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤（1）菌种获取、预培育、与示踪菌剂配置：选用一种具有双波段荧光特征、个体尺寸小于5μm，并且具有敏感因子自主规避能力的菌种为示踪菌，预培育至菌群密度达到1*109个/mL，方法实施前将培育好的菌种密度稀释到1*107个/mL，并以荧光菌抑制剂量的50%浓度添加敏感因子，完成示踪菌剂的配置；
步骤（2）煤体关键参数测定与分析：测定待实施煤层煤样的孔隙分布，并计算介孔和大孔的孔隙比表面积，记为示踪有效比表面积；
步骤（3）菌种扩散半径设计：根据煤孔隙荧光菌粘滞系数和示踪有效比表面积，评估菌种最大扩散半径，并划分示踪菌高丰度半径（RH）、示踪菌中丰度半径（RM）、示踪菌低丰度半径（RL）、示踪菌微量分布半径（RT）、示踪菌痕量分布半径（RL）5个范围区域，并设计空间取点布置图；
步骤（4）正负压潮汐法与示踪菌敏感因子趋避法的示踪菌剂供给：采用正负压潮汐供给方法在煤层裂隙中形成正压和负压震荡场，使注入到煤层中的示踪菌剂在煤层裂隙中快速、均匀分布；菌剂注入完成后静置48小时，使示踪菌利用自身敏感因子趋避特征向正负压潮汐供给未能涉及的区域自主运移，并吸附在煤裂隙表面并逐渐稳定；
步骤（5）取样：根据空间取点布置图，预设示踪菌丰度分布，利用定点钻采采样法定点、定深度采取粉状煤样，每点位取样100g；
步骤（6）菌液获取：根据步骤（5）预设的示踪菌丰度分布，对示踪菌高丰度半径（RH）、示踪菌中丰度半径（RM）、示踪菌低丰度半径（RL）范围内的荧光菌实施菌液提取；对示踪菌微量分布半径（RT）、示踪菌痕量分布半径（RTA）范围内的荧光菌实施浓缩菌液提取；
步骤（7）示踪菌分布测定与分析：提取的菌液和浓缩菌液样本分别采用荧光显微镜计数，显微观察中采用一种荧光为基础测试荧光，另一种荧光为校验荧光，以减小煤中相似菌或煤粉的干扰；提取菌液的计数结果即为菌种密度实际值；浓缩菌液的计数结果乘以10-2为菌种密度实际值；根据试验中采用煤样实际重量，将菌种密度实际值单位换算为：个/g煤；所述的菌种密度实际值的单位：个/mL；
步骤（8）示踪菌实际分布半径的修正：如果示踪菌微量分布半径（RT）取样中某一点数据或某一组数据的菌种密度实际值大于等于示踪菌低丰度半径（RL）最小值，代表示踪菌剂更多的沿这一方向扩散，此时以煤壁注入孔为圆心，该点方向为中心轴向，以±45°夹角扩大1.2倍示踪菌微量分布半径（RT）和示踪菌痕量分布半径（RTA）扩大取样范围继续取样，直到所有示踪菌微量分布半径（RT）取样的数值小于示踪菌低丰度半径（RL）最小值，取样结束；
步骤（9）示踪菌分布图绘制：根据各取样点的空间坐标和各样品的计数结果绘制三维示踪菌分布等高图，并完成水力化措施效果评价；
步骤（1）中，所述的菌种获取是在自然界中寻找符合以下4项条件的菌种为示踪菌，所述的自然界为海洋环境或土壤环境：
①示踪菌本身具备双波段荧光特征，两种激发光的波长差≥100nm；被激发的荧光光谱范围限制在400nm-800nm，并且两种被激发的荧光波长差≥100nm；激发光波长与被激发荧光波长之差≥50nm；
②示踪菌来源于非煤地质环境的自然界，确保示踪菌与煤层菌种具备显著荧光特征差异；
③示踪菌自身具有运动特征、有显著的敏感因子趋避特性，能够自主向低敏感因子环境移动的能力；
④示踪菌的菌株直径小于2μm，长度小于5μm。
2.根据权利要求1所述的一种煤岩流场原位荧光菌显微示踪方法，其特征在于：步骤（2）中，所述的参数测定与分析具体为：煤样粉碎分别过120目筛、180目筛、和300目筛，分别填充透析柱并压实；测定不同粒径煤粉透析柱进-出端菌种数量差，根据不同煤样粒径透析柱的孔隙分布参数求得煤孔隙荧光菌粘滞系数；煤孔隙荧光菌粘滞系数是由于煤裂隙表面对示踪菌的吸附特性，粘滞系数越高代表煤孔隙对菌种的吸附作用越显著；反之粘滞系数越低代表煤孔隙对菌种的吸附作用越弱；并且粘滞系数随煤裂隙表面光滑度增高而降低，随荧光菌细胞壁光滑度升高而降低。
3.根据权利要求1所述的一种煤岩流场原位荧光菌显微示踪方法，其特征在于：步骤（4）中，所述的示踪菌剂供给的具体方案是：通过控制泵体单向阀的连通形式，改变泵体功能并形成注入和抽出两种动作方式；
示踪菌注入前，首先采用抽出方式将煤裂隙内压强将至-0.1KPa，抽出的煤层水放空；将泵体改为注入方式，将示踪菌剂注入煤层，直到注入压强达到8.0MPa；
然后示踪菌的注入转入正负压潮汐供给方式，此时泵体在注入与抽出方式交替进行，抽出液体暂存在缓冲水箱；
正负压潮汐供给方式中注入改为抽出的条件是：泵头压升高至8.0MPa；抽出改为注入的条件是：泵头压强降低至-0.1KPa；
正负压潮汐供给方式除了泵体动作的控制外，由于煤层中被吸附的煤层气在负压条件下更易解吸，从而正负压潮汐供给方式是泵体与介孔内解吸气相互配合下使注入的示踪菌在煤层裂隙中做类似活塞运动、以往复运行形式让示踪菌在煤层2-50μm的介孔内的分布趋于均匀。
4.根据权利要求1所述的一种煤岩流场原位荧光菌显微示踪方法，其特征在于：步骤（6）中，所述的对示踪菌高丰度半径（RH）、示踪菌中丰度半径（RM）、示踪菌低丰度半径（RL）范围内的荧光菌菌液提取方法：煤样与超纯水以质量比按3:7混合，充分震荡后3000×g离心5min，取上清液1mL为提取菌液；
所述的对示踪菌微量分布半径（RT）、示踪菌痕量分布半径（RTA）范围内的荧光菌浓缩菌液提取方法：煤样与超纯水以质量比按3:7混合，充分震荡后3000×g离心5min，取上清液100mL，然后将100mL上清液15000×g离心10 min，弃上清液，留浓缩菌液1mL为浓缩菌液。
5.根据权利要求2所述的一种煤岩流场原位荧光菌显微示踪方法，其特征在于：所述的煤孔隙荧光菌粘滞系数是煤裂隙表面对示踪菌的吸附特性，粘滞系数越高代表煤孔隙对菌种的吸附作用越显著；反之粘滞系数越低代表煤孔隙对菌种的吸附作用越弱；并且粘滞系数随煤裂隙表面的光滑度增高而降低，随荧光菌细胞壁光滑度增高而降低。
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