CN109632758A - 一种时间分辨荧光免疫分析内质控的方法 - Google Patents

一种时间分辨荧光免疫分析内质控的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种时间分辨荧光免疫分析内质控的方法，包括如下内容：1.在铕离子示踪的TRFIA试剂中同时添加一定量的钐标记的抗体或抗原；2.在TRFIA分析过程中通过钐标记的固定量的抗原抗体反应的荧光计数来监测铕离子示踪的TRFIA的结果；3.洗涤结束后加增强液，用可进行双波长测量的时间分辨荧光仪(DELFIA1235、DELFIA1420等型号仪器)分别测定每一孔的铕离子和钐离子的荧光强度，通过钐离子的荧光强度来判断铕离子示踪的TRFIA是否有误。本方法可评估TRFIA的反应是否正常，及时发现因包被错误、抗体失活、加样及洗涤产生的误差。

Description

一种时间分辨荧光免疫分析内质控的方法
技术领域
本发明涉及到一种对时间分辨荧光免疫分析中内质控的方法，具体内容是采用在铕标免疫分析试剂中添加互不干扰的钐标免疫分析系统为对照，判断铕标免疫分析试剂是否正常进行的方法，属于时间分辨荧光免疫分析技术领域。
背景技术
时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)是是利用免疫反应的高度特异性和标记示踪物的高度灵敏性相结合而建立的一类微量物质检测技术。采用三价稀土离子(铕、钐、铽、锑等)标记蛋白质、多肽、抗体、激素等，当反应形成免疫复合物后，通过清洗，洗去未结合的抗原抗体，加增强液后用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系被分析物的浓度，达到定量分析之目的。但在免疫分析过程中有许多的影响因素，如反应时间、反应温度、抗原抗体的活性是否变化等，所以一般的免疫反应都会做一条标准曲线，标准品与样品同时进行反应，排除上述变化的影响，但在每一个测试孔中，还有一些独立的影响因素，如加样不准确，洗涤不干净等，这无法通过标准曲线来发现，而且是随机产生，很难判断，这使检测会出现假阳性或假阴性。为了及时发现该误差，本发明在常规的铕离子标记的免疫分析系统中，加入一套固定的钐离子标记的免疫分析系统作为内质控，两者试剂混在一起，同时加样、反应、洗涤及检测。若在加样、反应、洗涤过程中产生错误，如标记抗体少加或多加，洗涤不干净等，固定的钐离子标记的免疫分析系统的荧光计数就会偏离预设值。由于铕离子和钐离子的发射光的波长不同，铕离子最大激发波长340nm，最大发射波长613nm，钐离子的最大激发波长340nm，最大发射波长600nm，因此钐离子对铕离子没有干扰，用时间分辨荧光仪(DELFIA1235、DELFIA1420等可以检测双波长的仪器)进行铕离子和钐离子的双波长检测，所以钐标记可作为在铕标记的TRFIA试剂反应中的内质控。
发明内容
本发明的目的，是在不影响正常的免疫反应过程中，对铕标记的TRFIA中的误差及时发现，从而避免一些由于操作误差造成的分析结果的假阳性或假阴性。
为达上述目的，本发明提供一种在常用的铕离子标记的TRFIA中添加内质控的方法，它包括如下工作步骤：1、在铕离子标记的TRFIA试剂中的标记物中添加固定量的钐离子标记的免疫分析系统,用于对免疫反应的检测和评估。当铕离子标记的TRFIA进行的同时，钐离子标记的免疫分析系统也同时进行；2、在微孔板上进行的TRFIA分析过程中通过洗涤去除未结合的铕标记物，同时也清洗钐标记物；3、洗涤结束后加增强液，5分钟后检测，用可进行双波长测量的时间分辨荧光仪分别测定每一孔的铕离子和钐离子的荧光强度cps，偏差＝钐离子的(实测值-预设值)/预设值×100％，如果偏差大于20％，则判定该孔实验有误，结果不可信。
本发明的有益效果：本发明方法是一种操作简便，对原有TRFIA分析过程不造成干扰的方法，对铕标记的TRFIA过程进行评估监测，及时发现失误，从而避免一些由于操作误差造成的分析结果的假阳性或假阴性。
具体实施方式
实施例1：促甲状腺激素(TSH)对于甲状腺功能的判断具有重要的意义，甲亢患者血清中TSH浓度降低,甲减患者中TSH浓度升高，若检测失误出现异常升高或降低都会引起临床上的误判，所以检测结果要非常准确，促甲状腺激素(TSH)时间分辨荧光测定(包被载体为微孔板模式)含内质控的检测，该方法包括如下工作步骤：
1、微孔板的包被，将TSH包被单克隆抗体与少量的鼠抗兔抗体混合后进行包被，24小时后弃去包被液，封闭后，抽干保存。
2、取TSH标记抗体1mg，溶解在含0.155mol/L NaCl的50mmol/L Na2CO3-NaHCO3PH9.0缓冲液中，加入0.2mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)，30℃磁力搅拌反应20小时。反应液用Sepharose CL-6B柱层析，A280监测收集蛋白峰。
3、取兔IgG1mg，溶解在含0.155mol/L NaCl的50mmol/L Na2CO3-NaHCO3PH9.0缓冲液中，加入0.2mg的Sm3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Sm3+-DTTA)，30℃磁力搅拌反应20小时。反应液用Sepharose CL-6B柱层析，A280监测收集蛋白峰。
4、在Eu3+标记的TSH抗体中添加少量的Sm3+标记兔IgG，使在进行TSH-TRFIA过程的同时也进行兔IgG的TRFIA，反应后的Sm3+荧光计数的设定值在3000cps左右。
5、免疫分析步骤：取包被有TSH包被单克隆抗体与少量的鼠抗兔抗体的混合包被板，每孔加入50μL的TSH标准或样品，再加入150μL缓冲液，25℃振荡孵育1小时，洗涤2次，再加入用缓冲液稀释的含有钐标记兔IgG和铕标TSH单抗溶液200μL，25℃振荡孵育1小时，洗涤6次。每孔加入增强液200μL，25℃振荡孵育5分钟后进行荧光检测：测定每一孔的铕离子和钐离子的荧光强度cps，铕离子的荧光强度cps用于TSH含量的检测，钐离子的荧光强度cps用于监测反应是否正常。
6、误差判定：偏差＝钐离子的荧光强度(实测值-预设值)/预设值×100％(表1)，如果大于±20％，则判定该孔实验有误，结果不可信,如表1中的7#孔钐离子计数少了23.67％，偏差大于20％，结果不可信，可能是包被时加样量少了，也有可能加标记物时量少了，这都会造成负误差。表1中的8#孔钐离子计数多了30.3％，偏差大于20％，结果不可信，可能是包被量多了，或者洗涤不干净，这都会造成正误差。
表1:TSH测定时铕离子、钐离子的结果判定
实施例2：促甲状腺激素(TSH)时间分辨荧光测定(包被载体为磁珠模式)含内质控的检测，该方法包括如下工作步骤：
1、将TSH包被单克隆抗体通过EDC法偶联到磁珠上，稀释后保存。
2、鼠抗兔抗体通过EDC法偶联到磁珠上，稀释后保存。
3、将TSH抗体磁珠与鼠抗兔抗体磁珠按一定比例相混合。
4、Eu3+-DTTA标记TSH标记抗体，反应液用Sepharose CL-6B柱层析，A280监测收集蛋白峰。
5、Sm3+-DTTA标记兔IgG，反应液用Sepharose CL-6B柱层析，A280监测收集蛋白峰。
6、在Eu3+标记的TSH抗体中添加少量的Sm3+标记兔IgG，使在进行TSH-TRFIA过程的同时也进行兔IgG的TRFIA，反应后的Sm3+荧光计数的设定值在5000cps左右。
7、免疫分析步骤：取包被有TSH包被单克隆抗体磁珠和包被有鼠抗兔抗体磁珠的混合液100μL加到反应孔中，每孔加入50μL的TSH标准或样品，再加入用缓冲液稀释的含有钐标记兔IgG和铕标TSH单抗溶液50μL，25℃振荡孵育20min，洗涤6次。每孔加入增强液200μL，25℃振荡孵育5分钟后进行荧光检测：测定每一孔的铕离子和钐离子的荧光强度cps，铕离子的荧光强度cps用于TSH含量的检测，钐离子的荧光强度cps用于监测反应是否正常.
8、误差判定：偏差＝钐离子的荧光强度(实测值-预设值)/预设值×100％，如果大于±20％，则判定该孔反应有误，结果不可信,如包被磁珠或标记物加样量少了，会造成负误差。洗涤不干净，会造成正误差。
以上只举了两个实施例，其它的采用稀土离子标记的免疫反应都可适用于此方法，内质控可以采用互不干扰的任意的另一种免疫反应。

Claims (7)

1.一种时间分辨荧光免疫分析内质控的方法，其特征在于：包括如下工作步骤：
(1)在铕离子标记的免疫反应试剂中添加钐离子标记的免疫反应试剂，两者进行反应；
(2)在固相包被载体上进行的TRFIA分析过程中当含有钐标系统的铕标试剂与微孔板或磁珠上的物质反应完毕之后，进行6次洗液，通过洗涤去除未结合的铕标记物，同时也洗涤去除未结合的钐标记物；
(3)洗涤结束后加增强液，5分钟后检测，用进行双波长测量的时间分辨荧光仪分别测定每一孔的铕离子和钐离子的荧光强度cps，根据钐离子的荧光强度判断反应是否正常；计算钐离子实际荧光强度cps与预设值的差别：(实测值-预设值)/预设值×100％，如果偏差大于20％，则判定该反应不正常，偏差很大，结果不可信。
2.如权利要求1所述的时间分辨荧光免疫分析内质控的方法，其特征在于：在铕离子标记的TRFIA试剂中的标记物中添加一定量的钐离子标记的其它的抗原或抗体,当用反应缓冲液稀释铕离子标记物时，同时稀释钐离子标记物，反应体系中同时进行铕离子标记的被测物的免疫反应和钐离子标记的内质控物的免疫反应，内质控物的免疫反应用于评估全部反应过程中是否产生误差。不同稀土离子标记的免疫反应都可适用于此方法，内质控可以采用互不干扰的任意的另一种免疫反应。
3.如权利要求1所述的时间分辨荧光免疫分析内质控的方法，其特征在于：固相包被载体可以是微孔板也可以是磁珠等具有捕获作用的载体。
4.如权利要求1所述的时间分辨荧光免疫分析内质控的方法，其特征在于：在TRFIA反应过程中，洗涤以去除未反应的铕标试剂，与此同时，去除未反应钐标试剂。
5.如权利要求1所述的时间分辨荧光免疫分析内质控的方法，其特征在于：钐离子荧光强度cps预设值范围在100-100000cps，磁珠的直径范围在10-10000nm之间，免疫检测的反应时间在5-200min之间。
6.如权利要求1所述的时间分辨荧光免疫分析内质控的方法，其特征在于：固相包被的是两种不同的款或抗体的混合物。铕离子标记的可以是抗原也可以是抗体，钐离子标记的是其它的抗原或抗体，铕离子标记抗体(抗原)与固相抗体(抗原)的免疫反应体系与钐离子标记的抗体(抗原)与固相抗体(抗原)的免疫反应体系同时进行但相互不干扰。
7.如权利要求1所述的时间分辨荧光免疫分析内质控的方法，其特征在于：在TRFIA反应过程中，用洗液清洗之后，每孔加200μL增强液，振荡5分钟，用时间分辨荧光仪进行铕离子和钐离子的双波长检测，得到每一孔的铕离子和钐离子的荧光强度cps值；计算钐离子实际荧光强度cps与预设值的差别：偏差＝(实测值-预设值)/预设值×100％，如果偏差大于±20％，则判定该反应不正常，偏差很大，结果不可信。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114544437A (zh) * 2022-02-28 2022-05-27 中国矿业大学 一种煤岩流场原位荧光菌显微示踪方法
CN115524485A (zh) * 2022-10-09 2022-12-27 江苏三联生物工程股份有限公司 用于加样准确度定量质控的蛋白芯片试剂盒与应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0566948A1 (de) * 1992-04-23 1993-10-27 Bayer Ag Verbessertes Verfahren zur Kennzeichnung von Kunststoff
CN101324574A (zh) * 2008-07-16 2008-12-17 江苏省原子医学研究所 时间分辨荧光免疫分析中检测洗涤残留干扰的一种方法
CN104730247A (zh) * 2015-03-12 2015-06-24 广州市丰华生物工程有限公司 一种适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测amh和inhb的试剂盒及其使用方法
CN105785016A (zh) * 2016-05-11 2016-07-20 江苏省原子医学研究所 基于pg磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒
CN105929157A (zh) * 2016-05-25 2016-09-07 苏州新波生物技术有限公司 一种联合检测hiv抗原抗体的诊断试剂盒及其制备方法
CN106153927A (zh) * 2016-04-12 2016-11-23 上海奥普生物医药有限公司 一种快速定量同时检测cTnI、CKMB、Myo的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法
CN106404731A (zh) * 2016-08-30 2017-02-15 王燕 一种同时检测细菌性和病毒性脑膜炎的pct与crp双标记时间分辨荧光免疫分析方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0566948A1 (de) * 1992-04-23 1993-10-27 Bayer Ag Verbessertes Verfahren zur Kennzeichnung von Kunststoff
CN101324574A (zh) * 2008-07-16 2008-12-17 江苏省原子医学研究所 时间分辨荧光免疫分析中检测洗涤残留干扰的一种方法
CN104730247A (zh) * 2015-03-12 2015-06-24 广州市丰华生物工程有限公司 一种适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测amh和inhb的试剂盒及其使用方法
CN106153927A (zh) * 2016-04-12 2016-11-23 上海奥普生物医药有限公司 一种快速定量同时检测cTnI、CKMB、Myo的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法
CN105785016A (zh) * 2016-05-11 2016-07-20 江苏省原子医学研究所 基于pg磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒
CN105929157A (zh) * 2016-05-25 2016-09-07 苏州新波生物技术有限公司 一种联合检测hiv抗原抗体的诊断试剂盒及其制备方法
CN106404731A (zh) * 2016-08-30 2017-02-15 王燕 一种同时检测细菌性和病毒性脑膜炎的pct与crp双标记时间分辨荧光免疫分析方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘斌: "《细胞培养》", 31 January 2018, 世界出版社 *
蒲杰: "《预防艾滋病、梅毒和乙肝母婴传播技术与进展》", 31 December 2015, 四川科学技术出版社 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114544437A (zh) * 2022-02-28 2022-05-27 中国矿业大学 一种煤岩流场原位荧光菌显微示踪方法
CN114544437B (zh) * 2022-02-28 2023-12-19 中国矿业大学 一种煤岩流场原位荧光菌显微示踪方法
CN115524485A (zh) * 2022-10-09 2022-12-27 江苏三联生物工程股份有限公司 用于加样准确度定量质控的蛋白芯片试剂盒与应用
CN115524485B (zh) * 2022-10-09 2023-12-05 江苏三联生物工程股份有限公司 用于加样准确度定量质控的蛋白芯片试剂盒与应用

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