CN101324574A - 时间分辨荧光免疫分析中检测洗涤残留干扰的一种方法 - Google Patents

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Abstract

时间分辨荧光免疫分析中检测洗涤残留干扰的一种方法，属于时间分辨荧光免疫分析技术领域。本发明方法采用如下工作步骤：1.在铕离子标记的TRFIA试剂中的标记物中添加一定量的钐离子；2.在微孔板上进行的TRFIA分析过程中通过洗涤去除未结合的铕标记物，同时也清洗钐离子；3.洗涤结束后加增强液，5分钟后检测，用可进行双波长测量的时间分辨荧光仪(DELFIA1235、DELFIA1420等型号仪器)分别测定每一孔的铕离子和钐离子的荧光强度cps，计算钐离子的残留量，如果大于设定的残留比例，则判定有洗涤残留的干扰。本方法可有效的发现TRFIA中由于洗涤残留造成的干扰，避免一些由于操作失误造成的假阳性或假阴性。

Description

时间分辨荧光免疫分析中检测洗涤残留干扰的一种方法
技术领域
本发明涉及到一种对时间分辨荧光免疫分析中洗涤残留干扰进行检测的方法，具体内容是采用在铕标试剂中添加钐离子为对照物判断是否有洗涤残留干扰的方法，属于时间分辨荧光免疫分析技术领域。
背景技术
时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)是医学领域超微量检测中一项新兴的检测技术，是利用免疫反应的高度特异性和标记示踪物的高度灵敏性相结合而建立的一类微量物质检测技术。TRFIA法的原理为用三价稀土离子(最常用的是铕离子)标记蛋白质、多肽、抗体、激素等，当体系反应发生后，用时间分辨荧光仪，测定最后产物的荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系被分析物的浓度，达到定量分析之目的。在DELFIA的免疫分析中，增强液具有非常重要的作用，结合于免疫复合物上的稀土离子荧光信号非常微弱，增强液可使免疫复合物上的稀土离子解离下来，荧光信号可放大100万倍以上，起到放大荧光效果的作用。
在TRFIA免疫分析中，由于增强液的强烈增强效果，一方面提高了检测的灵敏度，同时也容易放大误差，所以在洗涤时，有可能会残留未结合的稀土离子，如果大于0.1％，就会明显造成结果出现假阳性或假阴性。由于铕离子和钐离子在溶液中是同时均匀分布的，铕离子的残留比例与钐离子相同，由于铕离子和钐离子的发射光的波长不同，铕离子最大激发波长340nm，最大发射波长613nm，钐离子的最大激发波长340nm，最大发射波长600nm，因此钐离子对铕离子没有干扰，用时间分辨荧光仪(DELFIA1235、DELFIA1420等)进行铕离子和钐离子的双波长检测，所以钐离子可作为在铕标记的TRFIA试剂反应中洗涤残留的示踪剂。
发明内容
本发明的目的，旨在找到一种灵敏度高，操作简便，对分析过程不造成影响的方法，对铕标记的TRFIA中的洗涤残留干扰进行检测，从而避免一些由于操作误差造成的分析结果的假阳性或假阴性。
为达到上述目的，本发明的技术方案：一种在常用的铕离子标记的时间分辨荧光免疫分析法TRFIA中检测洗涤残留的方法，它采用如下工作步骤：
(1)在铕离子标记的TRFIA试剂中的标记物中添加2-6万cps/μL的钐离子，添加无生物活性的钐离子仅用于示踪洗涤残留的量；当用反应缓冲液稀释铕离子标记物时，同时稀释钐离子，钐离子的最终荧光强度计数控制在100000-200000cps/孔；
(2)在微孔板上进行的TRFIA分析过程中当含有钐离子的铕标试剂与微孔板上的物质反应完毕之后，用洗液洗板6次，通过洗涤去除未结合的铕标记物，同时也洗涤去除钐离子；
(3)洗涤结束后加增强液，5分钟后检测，用进行双波长测量的时间分辨荧光仪分别测定每一孔的铕离子和钐离子的荧光强度cps，计算钐离子的残留量，判断残留中铕离子是否超标；计算钐离子的残留比例：实测值/理论值×100％，如果大于0.1％，则判定有洗涤残留的干扰，该孔结果不可信。
本发明的有益效果：本发明方法是一种灵敏度高，操作简便，对分析过程不造成影响的方法，对铕标记的TRFIA中的洗涤残留干扰进行检测，从而避免一些由于操作误差造成的分析结果的假阳性或假阴性。
具体实施方式
实施例1：肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)测定时的洗涤残留干扰的检测，该方法包括如下工作步骤：
1、钐离子的添加：在铕标CEA单抗的溶液中，加入一定量的钐离子，使钐离子浓度达到5万cps/μL。
2、铕标抗体的反应：取CEA单抗包被板12孔，每孔加入25μL的标准或样品，再加入200μL缓冲液(含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、50μmol/L DTPA、0.1ml/LTween-80和0.1％NaN3的50mmol/L Tris-HCl pH7.8)，25℃振荡孵育3小时，洗涤2次(洗涤液为14.5mmol/L NaCl、0.2mL/L Tween-80和0.2％NaN3的50mmol/L pH 7.8的Tris-HCl缓冲液，下同)，再加入用缓冲液1∶100稀释的含有钐离子的铕标CEA单抗溶液200μL，25℃振荡孵育1小时，洗涤6次，去除孔内多余的液体。每孔加入增强液(1升pH 3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含：15μmolβ-萘甲酰三氟丙酮(β-NTA)，50μmol三正辛基氧化膦(TOPO)和1mL曲拉通X-100)200μL，25℃振荡孵育5分钟后进行荧光检测：用DELFIA1235时间分辨荧光仪测定每一孔的铕离子和钐离子的荧光强度cps，铕离子的荧光强度cps用于CEA含量的检测，钐离子的荧光强度cps用于计算钐离子的残留比例：实测值/理论值×100％(表1)，如果大于0.1％，则判定有洗涤残留的干扰，该孔结果不可信。
表1：CEA测定时钐离子的残留判定
Figure A20081002261900041
实施例2：甲胎蛋白(AFP)测定时的洗涤残留干扰的检测，该方法包括如下工作步骤：
1、钐离子的添加：在铕标AFP单抗的溶液中，加入一定量的钐离子，使钐离子浓度达到3.75万cps/μL。
2、铕标抗体的反应：取AFP单抗包被板12孔，每孔加入25μL的标准或样品，再加入用缓冲液(缓冲液组成同实施例1)1∶75稀释的含有钐离子的铕标AFP单抗溶液200μL，25℃振荡孵育1小时，洗涤6次，去除孔内多余的液体。每孔加入增强液(增强液组成同实施例1)200μL，25℃振荡孵育5分钟后进行荧光检测：用DELFIA1420时间分辨荧光仪测定每一孔的铕离子和钐离子的荧光强度cps，铕离子的荧光强度cps用于CEA含量的检测，钐离子的荧光强度cps用于计算钐离子的残留比例：实测值/理论值×100％(表2)，如果大于0.1％，则判定有洗涤残留的干扰，该孔结果不可信。
表2：AFP测定时钐离子的残留判定
Figure A20081002261900051

Claims (1)

1、一种在常用的铕离子标记的时间分辨荧光免疫分析法TRFIA中检测洗涤残留的方法，其特征在于，它采用如下工作步骤：
(1)在铕离子标记的TRFIA试剂中的标记物中添加2-6万cps/μL的钐离子，添加无生物活性的钐离子仅用于示踪洗涤残留的量；当用反应缓冲液稀释铕离子标记物时，同时稀释钐离子，钐离子的最终荧光强度计数控制在100000-200000cps/孔；
(2)在微孔板上进行的TRFIA分析过程中当含有钐离子的铕标试剂与微孔板上的物质反应完毕之后，用洗液洗板6次，通过洗涤去除未结合的铕标记物，同时也洗涤去除钐离子；
(3)洗涤结束后加增强液，5分钟后检测，用进行双波长测量的时间分辨荧光仪分别测定每一孔的铕离子和钐离子的荧光强度cps，计算钐离子的残留量，判断残留中铕离子是否超标；计算钐离子的残留比例：实测值/理论值×100％，如果大于0.1％，则判定有洗涤残留的干扰。
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