CN104777156B - 一种基于碳点荧光关‑开模式检测肌醇六磷酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种肌醇六磷酸的分析检测方法，用三价铁离子将碳点荧光猝灭，然后加入肌醇六磷酸样品，荧光被恢复，随着待测样品浓度的增加，恢复的荧光发生由弱到强的变化，实现定性和定量的检测。包括制备碳点荧光探针；配置一系列浓度的肌醇六磷酸标准溶液；测定中碳点/三价铁和肌醇六磷酸反应前后的荧光强度，根据肌醇六磷酸浓度和相对荧光强度变化值之间的关系建立标准曲线；测定待测样品和碳点/Fe(III)混合溶液反应前后的荧光强度变化，计算相对荧光强度变化值，得到待测样品中肌醇六磷酸的含量。本发明建立的荧光分析法，能够快速有效地检测肌醇六磷酸，提高了样品检测效率，缩短了样品检测时间，且操作简便快捷。

Description

一种基于碳点荧光关-开模式检测肌醇六磷酸的方法
技术领域
本发明涉及一种肌醇六磷酸的分析检测方法，具体地说是一种基于碳点荧光关-开模式检测肌醇六磷酸的方法，属于荧光分析检测技术领域。
背景技术
肌醇六磷酸，又称植酸，广泛存在于谷类和豆类等植物性食物中。肌醇六磷酸是一种重要的有机磷系添加剂，以其独特的结构、化学性质、生理和药理功能，广泛地应用于食品、医药、化工、日化、冶金等行业中。通常认为肌醇六磷酸是一种抗营养剂，然而近年来许多研究表明它具有诸多生理活性作用，因而，肌醇六磷酸越来越受到人们的关注。为深入理解其生理作用并为日常饮食摄入提供有效指导，肌醇六磷酸的定量分析尤为重要。目前肌醇六磷酸的检测方法主要有沉淀法、比色法和高压液相色谱法。沉淀法和比色法较为直观，但选择性和灵敏度较差。液相色谱法存在仪器价格昂贵，检测成本高，操作人员需经专业培训等不足，难以用于现场检测。
荧光分析法由于灵敏度高、选择性好、操作简便快捷等特点而具有明显的检测优势，在环境监测和食品安全等领域得到广泛应用。荧光碳点不仅具有优良的光学性能与小尺寸特性，而且具有良好的生物相容性，易于实现表面功能化，在生化传感、成像分析、环境检测、光催化技术及药物载体等领域具有很好的应用潜力。近年来，碳点的荧光性质已经广泛应用于检测各种离子、有机小分子和生物大分子。同时，通过表面功能化可以调控碳点表面性质，进而设计多种高效检测体系。因此，基于碳点优异的荧光特性，将荧光分析和纳米技术相结合，建立针对肌醇六磷酸的高灵敏、快速、低成本的荧光检测方法，具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单、快速、经济、灵敏和高选择性的检测食品中肌醇六磷酸的荧光方法。
本发明的原理是：本发明利用碳点荧光猝灭(关)和荧光恢复(开)的性质，将其应用到肌醇六磷酸检测中，开发出一种碳点荧光关-开模式的检测方法。首先用三价铁离子(Fe(III))将碳点荧光猝灭，然后加入待测样品，荧光被恢复，随着待测样品浓度的增加，恢复的荧光发生由弱到强的变化，从而实现定性和定量的检测。
本发明的技术方案如下：
一种基于碳点荧光关-开模式检测肌醇六磷酸的方法；用三价铁离子将碳点荧光猝灭，然后加入肌醇六磷酸样品，荧光被恢复，随着待测样品浓度的增加，恢复的荧光发生由弱到强的变化，实现定性和定量的检测。
本发明的基于碳点荧光关-开模式检测肌醇六磷酸的方法的方法，包括如下步骤：
(1)制备碳点荧光探针；
(2)配置一系列浓度的肌醇六磷酸标准溶液；
(3)向碳点溶液中加入三价铁，使碳点逐渐荧光猝灭，得到碳点/三价铁溶液；
(4)向步骤(3)中荧光猝灭的溶液中加入肌醇六磷酸，使碳点荧光恢复；
(5)测定中碳点/三价铁和肌醇六磷酸反应前后的荧光强度，根据肌醇六磷酸浓度和相对荧光强度变化值之间的关系建立标准曲线；
(6)定量检测：测定待测样品和碳点/Fe(III)混合溶液反应前后的荧光强度变化，计算相对荧光强度变化值，对比步骤(3)中获得的标准曲线，得到待测样品中肌醇六磷酸的含量。
碳点荧光探针的制备方法：按柠檬酸和赖氨酸质量比为2.5～3：1，以及按每升水中105克柠檬酸计，将柠檬酸和赖氨酸加入水中，得到混合溶液；混合溶液在温度为200℃下反应5小时；反应结束后将溶液置于纯水溶液中透析36h以上，去除杂质。
柠檬酸和赖氨酸质量比优选为2.87：1。
肌醇六磷酸标准品的配置方法为：用10～100毫摩尔每升的吗啉乙磺酸缓冲液配制肌醇六磷酸的标准样品储备液，储备液浓度为0.1～10毫摩尔每升。
吗啉乙磺酸缓冲液pH 5.0-6.0。
相对荧光强度变化值根据公式(F-FA)/FA×100％计算，其中FA表示碳点/Fe(III)的荧光强度，F表示碳点/Fe(III)与不同浓度肌醇六磷酸反应后的荧光强度。
在步骤(3)中，所述碳点溶液为用10～100毫摩尔每升(pH 5.0-6.0)吗啉乙磺酸缓冲液稀释后的溶液，其中碳点浓度为0.1～0.2毫克每升。所述三价铁离子在混合溶液中的最终浓度为100微摩尔每升。
在步骤(5)中，所述荧光强度的测量可以通过任意一款荧光光谱仪实现；所述相对荧光强度变化值根据公式(F-FA)/FA×100％计算得到，其中FA表示碳点/Fe(III)的荧光强度，F表示碳点/Fe(III)与不同浓度肌醇六磷酸反应后的荧光强度；所述荧光强度的测试条件如下：荧光发射波长为碳点荧光发射光谱的波峰，荧光激发波长为相应激发光谱的波峰。
与现有检测方法相比，本发明的优点在于：(1)本发明所述荧光探针即碳点，具有成本低廉、生物相容性好和荧光稳定性好等优点，且对肌醇六磷酸有较好的选择性和较高的灵敏度； (2)本发明建立的荧光分析法，能够快速有效地检测肌醇六磷酸，提高了样品检测效率，缩短了样品检测时间，且操作简便快捷；(3)本发明提供的荧光分析法具有响应快速、操作简便、成本低廉和高灵敏度等优点。同时，由于高选择性，该方法适用于食品中的肌醇六磷酸酸的精确分析和定量检测。
附图说明
图1：为碳点/Fe(III)与不同浓度肌醇六磷酸反应后的荧光发射光谱图。
图2：为荧光检测方法测定肌醇六磷酸的检测限和线性范围。
具体实施方式
实施例1：
以玉米种子中所含肌醇六磷酸为检测对象，具体操作步骤如下：
(1)制备碳点荧光探针：将4.2g柠檬酸和2.1g赖氨酸加入到40mL超纯水中。经搅拌2～3分钟后，加入到反应釜中。混合溶液在200℃下反应5小时。反应结束后将溶液置于纯水溶液中透析36h，去除杂质，用10mmol/L(pH＝5.7)吗啉乙磺酸缓冲液将透析所得碳点稀释至0.2mg/L；
(2)配置肌醇六磷酸标准溶液：用10mmol/L(pH＝5)的吗啉乙磺酸缓冲液配制肌醇六磷酸的标准样品储备液，储备液浓度为0.1mmol/L至10mmol/L，用吗啉乙磺酸缓冲液将储备液配置成不同浓度的标准溶液；
(3)荧光猝灭：向2mL 0.2mg/L碳点溶液中加入20μL 10mM FeCl3溶液，使碳点逐渐荧光猝灭，使用荧光光谱仪测量猝灭后的荧光强度FA＝63，(见图1中a曲线)；
(4)荧光恢复：向上述碳点/Fe(III)混合溶液中加入0.68，1.35，2.71，5.40，8.08，13.41，18.68，23.91，29.08，34.21μM肌醇六磷酸，使碳点荧光恢复，使用荧光光谱仪测量荧光强度F，分别为64.26，65.52，68.37，71.33，75.56，79.21，85.91，94.62，114.63，118.30(见图1中b-k曲线)；
(5)建立标准工作曲线：由公式(F-FA)/FA×100％计算相对荧光强度变化值(以0.68μM肌醇六磷酸为例，(F-FA)/FA×100％＝(64.26—63)/63×100％＝0.02)，根据肌醇六磷酸浓度与相对荧光强度变化值之间的关系建立标准曲线，结果见图2。
(6)定量检测：取0.5g玉米种子经干燥后粉碎，加入10mL 0.5M盐酸，振荡2小时后，离心，过滤，收集滤液；将滤液通过阴离子交换柱，以0.7M氯化钠溶液洗脱，用10mM pH5.7吗啉乙磺酸缓冲液将收集的洗脱液稀释至50mL。利用荧光光谱仪，测定50μL待测样品和碳点/Fe(III)混合溶液反应前后的荧光强度变化，计算相对荧光强度变化值，(F-FA)/FA×100％＝(76.23—63)/63×100％＝0.21，对比步骤(5)中获得的标准曲线，得到待测样品中肌醇六磷酸的含量为10.14μM。
实施例2：
具体操作步骤如下：
(1)制备碳点荧光探针：将4.2g柠檬酸和1.4g赖氨酸加入到40mL超纯水中。经搅拌2～3分钟后，加入到反应釜中。混合溶液在200℃下反应5小时。反应结束后将溶液置于纯水溶液中透析36h，去除杂质，用10mmol/L(pH＝5.7)吗啉乙磺酸缓冲液将透析所得碳点稀释至0.1mg/L；
(2)配置肌醇六磷酸标准溶液：用10mmol/L(pH＝6)的吗啉乙磺酸缓冲液配制肌醇六磷酸的标准样品储备液，储备液浓度为0.1mmol/L至10mmol/L，用吗啉乙磺酸缓冲液将储备液配置成不同浓度的标准溶液；
(3)荧光猝灭：向2mL 0.1mg/L碳点溶液中加入20μL 10mM FeCl3溶液，使碳点逐渐荧光猝灭，测量猝灭后的荧光强度FA＝31；
(4)荧光恢复：向上述碳点/Fe(III)混合溶液中加入0.68，1.35，2.71，5.40，8.09，13.41，18.69，23.91，29.08，34.21μM肌醇六磷酸，使碳点荧光恢复，测量荧光强度F，分别为31.62，32.24，33.64，35.10，37.18，39.02，42.27，45.78，52.40，56.93；
(5)建立标准工作曲线：由公式(F-FA)/FA×100％计算相对荧光强度变化值：以0.68μM肌醇六磷酸为例，(F-FA)/FA×100％＝(31.62—31)/31×100％＝0.02，根据肌醇六磷酸浓度与相对荧光强度变化值之间的关系建立标准曲线，结果见图2。
(6)定量检测：取0.5g玉米种子经干燥后粉碎，加入10mL 0.5M盐酸，振荡2小时后，离心，过滤，收集滤液；将滤液通过阴离子交换柱，以0.7M氯化钠溶液洗脱，用10mM pH5.7吗啉乙磺酸缓冲液将收集的洗脱液稀释至50mL。利用荧光光谱仪，测定50μL待测样品和碳点/Fe(III)混合溶液反应前后的荧光强度变化，计算相对荧光强度变化值，(F-FA)/FA×100％＝(37.5—31)/31×100％＝0.209对比步骤(5)中获得的标准曲线，得到待测样品中肌醇六磷酸的含量为10.12μM。
本发明同样适用于其它谷物食品中肌醇六磷酸的精确分析和定量检测，如小麦、大麦种子等。上述内容均在本发明保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基于碳点荧光关-开模式检测肌醇六磷酸的方法，用三价铁离子将碳点荧光猝灭，然后加入肌醇六磷酸样品，荧光被恢复，随着待测样品浓度的增加，恢复的荧光发生由弱到强的变化，实现定性和定量的检测，其特征是，该方法包括如下步骤：
(1)制备碳点荧光探针；
(2)配置一系列浓度的肌醇六磷酸标准溶液；
(3)向碳点溶液中加入三价铁，使碳点逐渐荧光猝灭，得到碳点/三价铁溶液；
(4)向步骤(3)中荧光猝灭的溶液中加入肌醇六磷酸，使碳点荧光恢复；
(5)测定中碳点/三价铁和肌醇六磷酸反应前后的荧光强度，根据肌醇六磷酸浓度和相对荧光强度变化值之间的关系建立标准曲线；
(6)定量检测：测定待测样品和碳点/Fe(III)混合溶液反应前后的荧光强度变化，计算相对荧光强度变化值，对比步骤(3)中获得的标准曲线，得到待测样品中肌醇六磷酸的含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是碳点荧光探针的制备方法：按柠檬酸和赖氨酸质量比为2.5～3：1，以及按每升水中105克柠檬酸计，将柠檬酸和赖氨酸加入水中，得到混合溶液；混合溶液在温度为200℃下反应5小时；反应结束后将溶液置于纯水溶液中透析36h以上，去除杂质。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是柠檬酸和赖氨酸质量比为2.87：1。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是肌醇六磷酸标准品的配置方法为：用10～100毫摩尔每升的吗啉乙磺酸缓冲液配制肌醇六磷酸的标准样品储备液，储备液浓度为0.1～10毫摩尔每升。
5.如权利要求4所述的方法，其特征是吗啉乙磺酸缓冲液pH 5.0-6.0。
6.如权利要求1所述的方法，其特征是相对荧光强度变化值根据公式(F-FA)/FA×100％计算，其中FA表示碳点/Fe(III)的荧光强度，F表示碳点/Fe(III)与不同浓度肌醇六磷酸反应后的荧光强度。
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