CN101696964A - 氟喹诺酮类抗生素的固相萃取与hplc-荧光检测方法 - Google Patents
氟喹诺酮类抗生素的固相萃取与hplc-荧光检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种氟喹诺酮类抗生素的固相萃取与HPLC-荧光检测方法，包括：将预处理后的水样通过活化的固相萃取柱，再用Na2EDTA水溶液淋洗固相萃取柱，然后抽真空，最后用浓氨体积百分比浓度为6％的浓氨甲醇溶液洗脱三次，每次0.5～2mL，所得洗脱液在空气流中吹干至0.1～0.4mL，加水定容至1.0mL，得到测试样品，进行HPLC-荧光检测。本发明采用固相萃取-HPLC-荧光检测技术，利用常规的分析仪器可同时测定水环境样品中氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星4种典型氟喹诺酮类抗生素的含量。该方法操作简单，成本低，可应用于废水、地表水中超痕量的4种典型氟喹诺酮类抗生素含量的测定。
Description
技术领域
本发明涉及氟喹诺酮类抗生素的检测方法，具体涉及一种氟喹诺酮类抗生素的固相萃取与HPLC-荧光检测方法，属于环境监测技术领域。
背景技术
氟喹诺酮类抗生素药物是近年来发展十分迅速的一类抗菌药，因其抗菌谱广、抗菌活性强、半衰期长、高效低毒、使用方便、剂型较多等优点，被广泛用于人类、牲畜和鱼类疾病的治疗和预防，也常被用作牲畜和鱼类的生长促进剂。由于氟喹诺酮类抗生素服用后很大一部分以原形排出人类及动物体外，进入下水道，其中部分药物(约70～80％)被污水处理厂去除，还有一部分药物则随排出水一起进入地表水中，或者通过以污水处理厂排出水灌溉土地、以动物粪便及污水处理厂污泥作为肥料施于土地等方式使药物进入环境。再者，渔业养殖所投加的氟喹诺酮类抗生素药物也会进入水体中或在底泥中淤积。
为了对氟喹诺酮类抗生素药物的环境风险进行评估，迫切需要这些药物在环境中的浓度、归宿等数据。目前各国的研究者已经在污水处理厂的污泥、污泥灌溉的土壤、医院废水、城市污水处理厂的排出水、地表水甚至地下水中检测到痕量氟喹诺酮类抗生素。鉴于环境样品的复杂性以及该类药物进入环境后均经过大量的稀释，检测较为困难。
现有的应用于环境样品中氟喹诺酮类抗生素药物的检测方法主要有固相萃取-GC-ESI-MS/MS法和固相萃取-HPLC-ESI-MS/MS法，其中固相萃取的操作步骤一般为：先把水样用H2SO4调pH到3左右，通过预先用甲醇-水-Na2EDTA缓冲溶液淋洗活化的萃取柱，待水样过柱后，用Na2EDTA的缓冲溶液冲洗萃取柱，最后用甲醇洗脱。洗脱液进行GC-ESI-MS/MS检测或HPLC-ESI-MS/MS，HPLC的色谱分离条件一般为：ODS-P(4.6mm×250mm)色谱柱，以乙腈-甲酸溶液作为流动相采用梯度洗脱进行检测。
例如，申请号为200810022357.4的中国专利申请中公开了一种同时检测19种喹诺酮类药物的HPLC-ESI-MS/MS测定方法，包括样品处理、液相分离、质谱检测三个步骤，对组织液中19种喹诺酮类抗生素进行正离子MRM扫描，以诺氟沙星-D5为内标，采用C18色谱柱分离，以含甲酸的水-甲醇为流动相作梯度洗脱，对洗脱液进行质谱检测；其特点为根据样品的实际情况和对检测灵敏度的不同要求，采用有机溶剂提取方法进行样品的预处理，以诺氟沙星-D5为内标，采用C18色谱柱，以含甲酸的水-甲醇为流动相作梯度洗脱。本方法前处理过程快速简便，检测结果可靠灵敏，适用于动物性食品中喹诺酮类药物残留的分析检测。
上述现有方法虽然能够满足环境样品检测的要求，但所需仪器如ESI-MS/MS分析仪非常昂贵，造成测试成本增加，不利于检测方法的普及。
发明内容
本发明提供了一种氟喹诺酮类抗生素的固相萃取与HPLC-荧光检测方法，其采用常规分析仪器对废水或地表水中氧氟沙星(OFL)、诺氟沙星(NOR)、环丙沙星(CPX)和恩诺沙星(ENRX)四种典型氟喹诺酮类抗生素进行检测，达到了采用昂贵分析仪器的检测效果，降低了测试费用，能够满足环境样品检测的要求。
一种氟喹诺酮类抗生素的固相萃取与HPLC-荧光检测方法，包括以下步骤：
(1)水样预处理：取50～2000mL含氟喹诺酮抗生素的水样过滤，滤液中添加浓度为0.1～0.4g/L的Na2EDTA水溶液，用酸调节pH至3.0～5.0，得到预处理后的水样；
(2)固相萃取：用0.5～2mL甲醇活化3次后，再用3～7mL浓度为0.1～0.4g/L的Na2EDTA水溶液活化固相萃取柱；
将预处理后的水样以1～5mL/min的速度通过活化的固相萃取柱，再用3～7mL浓度为0.1～0.4g/L的Na2EDTA水溶液淋洗固相萃取柱，然后抽真空20～40min，取浓氨水溶液与甲醇的体积比为2～3∶38～57的浓氨甲醇溶液洗脱三次，每次0.5～2mL，所得洗脱液在空气流中吹干至0.1～0.4mL，加水定容至1.0mL，得到测试样品；其中，所述的浓氨水溶液的体积百分浓度为25％；
(3)HPLC-荧光检测：采用C18色谱柱，以pH＝2.3～4.0、体积百分浓度为10～30％的甲醇水溶液作为流动相，流速为0.5～2mL/min，柱温10～50℃，设定荧光检测的激发波长为270～290nm，发射波长为450～470nm，分析测试样品，得到测试样品的色谱图，将色谱图上的峰高在工作曲线上回归，计算测试样品中氟喹诺酮抗生素的含量。
作为优选，所述的检测方法，具体包括以下步骤：
(1)水样预处理：取50～2000mL含氟喹诺酮抗生素的水样过滤，滤液中添加浓度为0.2g/L的Na2EDTA水溶液，用酸调节pH至4.0，得到预处理后的水样；
(2)固相萃取：用1mL甲醇活化3次后，再用5mL浓度为0.2g/L的Na2EDTA水溶液活化固相萃取柱；
将预处理后的水样以3mL/min的速度通过活化的固相萃取柱，再用5mL浓度为0.2g/L的Na2EDTA水溶液淋洗固相萃取柱，然后抽真空30min，取浓氨水溶液与甲醇的体积比为2～3∶38～47的浓氨甲醇溶液洗脱三次，每次1mL，所得洗脱液在空气流中吹干至0.2mL，加水定容至1.0mL，得到测试样品；其中，所述的浓氨水溶液的体积百分浓度为25％；
(3)HPLC-荧光检测：采用C18色谱柱，以pH＝4.0、体积百分浓度为20％的甲醇水溶液作为流动相，流速为1.0mL/min，柱温30℃，设定荧光检测的激发波长为281nm，发射波长为460nm，分析测试样品，得到测试样品的色谱图，将色谱图上的峰高在工作曲线上回归，计算测试样品中氟喹诺酮抗生素的含量。
所述的氟喹诺酮抗生素为氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星或恩诺沙星。
步骤(1)中，水样过滤时采用常规的过滤方法即可，例如采用中速定性滤纸和0.45μm水膜过滤，除去水样中的固体杂质。然后添加Na2EDTA水溶液，通过Na2EDTA与水样中的金属离子络合。由于本发明添加Na2EDTA是为了络合一部分金属离子，其添加量的多少对后续的检测并没有太大的影响，因此，本发明对Na2EDTA的用量不做限定。
所述的酸优选醋酸或磷酸。
步骤(2)中，所述的固相萃取柱可选用本领域常用的固相萃取柱，如填料为C18键合硅胶，即在硅胶上接十八烷基，并对键端进行处理的固相萃取柱，优选Supelco Envi-18柱。
所述的浓氨水溶液与甲醇的体积比为2～3∶38～57的浓氨甲醇溶液作为洗脱液，具有很好的洗脱效果，优选浓氨水溶液与甲醇的体积比为2～3∶38～47的浓氨甲醇溶液，最优选浓氨水溶液与甲醇的体积比为3∶47的浓氨甲醇溶液。
荧光检测波长的选择：采用LS-55荧光分光光度计测得OFL的最佳激发波长为290nm，发射波长为480nm，而NOR、CPX和ENRX的最佳激发波长为275nm，发射波长为440nm。为了兼顾OFL、NOR、CPX和ENRX四种药物的检测灵敏性，本发明设定荧光检测的激发波长为270～290nm，发射波长为450～470nm，优选荧光激发波长为281nm，发射波长为460nm。
HPLC色谱分离条件的选择：流动相中甲醇含量太低则检测信号弱且洗脱时间长，而甲醇含量过高则药物的特征峰会发生重叠，因此选用体积百分浓度为10～30％的甲醇水溶液，优选体积百分浓度为20％的甲醇水溶液；另外，流动相的pH值大于4.0或者小于2.3都会导致峰重叠或者不能有效地将样品洗脱，而pH＝2.3～4.0时，对检测结果的影响不大，优选pH值为4.0。
对流速的影响进行测试，发现流速越大，出峰越快，峰面积越大，但是同时色谱峰会发生重叠且柱压增加，为了得到较好的色谱峰，选择流速为0.5～2mL/min，优选为1.0mL/min。
在10℃～50℃范围内测试了温度对出峰时间、峰形的影响，在该范围内温度影响很小，总的来说温度越高出峰越快，峰形越尖锐，优选柱温为30℃。
线性范围的确定：按照本领域常用的工作曲线绘制方法，取氧氟沙星标准品、诺氟沙星标准品、环丙沙星标准品和恩诺沙星标准品，分别用水溶解配制成浓度均为1.0×10-3mol/L的储备液，逐级稀释成一系列由低浓度到高浓度的标准溶液。标样的逐级稀释可按10倍的梯度往低浓度稀释，比如取10mL的贮备液，稀释到100mL，得到浓度为1.0×10-4mol/L的标样；再取10mL 1.0×10-4mol/L的标样稀释到100mL，得到浓度为1.0×10-5mol/L的标样，依次逐级稀释到1.0×10-7mol/L的标样为止。用HPLC-荧光检测各标样，得到各标样的色谱图，根据色谱图的峰高与标样浓度的关系绘制工作曲线，确定线性范围。
检测限的确定：配制4种抗生素浓度均为1.0×10-7mol/L的混合液标样，连续进样测定11次，按照相对检测限的计算公式(3s/x)×c进行计算，计算得到检测限。s表示由标样11次测得的色谱峰高计算得到的标准偏差，x表示11次测得的色谱峰高的平均值，c表示选定的标样的浓度，即为1.0×10-7mol/L。
本发明所用的试剂均选用分析纯，所用的水均选用纯水或蒸馏水。
本发明具有以下有益效果：
1.选择了合适的固相萃取柱，并试验得到了合适的固相萃取的活化、净化与洗脱条件，使水样的浓缩倍数达到1000以上，在本发明适宜的条件下，固相萃取不但浓缩了待测物，同时净化了样品中的基体干扰，有利于水环境样品的测定。
2.采用具有高灵敏的荧光检测器，可以大大降低检测限，同时结合适宜的预处理条件、固相萃取的净化与浓缩实现了水环境样品中超痕量氟喹诺酮类抗生素的灵敏测定。
附图说明
图1为实施例1中标样的HPLC-荧光检测色谱示意图；
图2为实施例1中杭州市四堡污水处理厂水样的HPLC-荧光检测色谱示意图；
图3为实施例2中杭州市钱塘江水样的HPLC-荧光检测色谱示意图；
图1～图3中，1，2，3，4分别代表OFL，NOR，CPX，ENRX。
具体实施方式
实施例1
水样预处理：取100mL杭州市四堡污水处理厂排放口水样用中速定性滤纸和0.45μm水膜进行过滤，在滤液中添加5mL浓度为0.2g/L的Na2EDTA水溶液，用醋酸调节pH至4.0，得到预处理后的水样。
固相萃取：依次用1mL甲醇、1mL甲醇、1mL甲醇和5mL浓度为0.2g/L的Na2EDTA水溶液活化固相萃取柱。
将预处理后的水样以3mL/min的速度通过活化的固相萃取柱，再用5mL浓度为0.2g/L的Na2EDTA水溶液淋洗固相萃取柱，然后抽真空30min，取浓氨水溶液(体积百分浓度为25％)与甲醇的体积比为3∶47的浓氨甲醇溶液洗脱三次，每次1mL，所得洗脱液在空气流中吹干至0.2mL，加水定容至1.0mL，得到测试样品。
氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星标样的配制：
取由杭州药检所提供的氧氟沙星标准品、诺氟沙星标准品、环丙沙星标准品和恩诺沙星标准品，用超纯水溶解，配制成氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星浓度均为1.0×10-3mol/L的贮备液，避光保存。使用时逐级稀释至所需浓度，得到一系列从低浓度到高浓度的标样。标样的逐级稀释是按10倍的梯度往低浓度稀释的，取10mL的贮备液，稀释到100mL，得到浓度为1.0×10-4mol/L的标样，再取10mL 1.0×10-4mol/L的标样稀释到100mL，得到浓度为1.0×10-5mol/L的标样，依次逐级稀释到1.0×10-7mol/L的标样为止。
HPLC-荧光检测：采用C18色谱柱，以pH＝4.0、体积百分浓度为20％的甲醇水溶液作为流动相，流速为1.0mL/min，柱温30℃，进样量为20μL，设定荧光检测的激发波长为281nm，发射波长为460nm，分析标样和测试样品，分别得到各标样的色谱图以及测试样品的色谱图，根据各标样色谱图的峰高与相应的标样浓度的关系绘制工作曲线，将从测试样品色谱图上得到的峰高在工作曲线上回归，计算测试样品中氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的含量。
不同时间三次采集杭州市四堡污水处理厂的水样，检测结果见表1，每个样品平行测定3次，结果取平均值。
表1四堡污水处理厂水样测定结果
实施例2
水样预处理：取1000mL杭州市钱塘江水样用中速定性滤纸和0.45μm水膜进行过滤，在滤液中添加2mL浓度为0.2g/L的Na2EDTA水溶液，用磷酸调节pH至4.0，得到预处理后的水样。
固相萃取：依次用1mL甲醇、1mL甲醇、1mL甲醇和5mL浓度为0.2g/L的Na2EDTA水溶液活化固相萃取柱。
将预处理后的水样以3mL/min的速度通过活化的固相萃取柱，再用5mL浓度为0.2g/L的Na2EDTA水溶液淋洗固相萃取柱，然后抽真空30min，取浓氨水溶液(体积百分浓度为25％)与甲醇的体积比为2∶38的浓氨甲醇溶液洗脱三次，每次1mL，所得洗脱液在空气流中吹干至0.2mL，加水定容至1.0mL，得到测试样品。
氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星标样的配制：操作同实施例1。
HPLC-荧光检测：采用C18色谱柱，以pH＝2.3、体积百分浓度为20％的甲醇水溶液作为流动相，流速为1.0mL/min，柱温50℃，进样量为20μL，设定荧光检测的激发波长为281nm，发射波长为460nm，分析各标样和测试样品，分别得到各标样的色谱图以及测试样品的色谱图，根据各标样色谱图的峰高与相应的标样浓度的关系绘制工作曲线，将从测试样品色谱图上得到的峰高在工作曲线上回归，计算测试样品中氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的含量。
不同时间三次采集的杭州市钱塘江二桥和三桥处的水样，检测结果见表2，表中结果为每个水样平行测定3次的平均值。
表2钱塘江水样测定结果
实施例3 回收试验
取5份纯水和5份河水，每份1L且加入一定量OFL标准品、NOR标准品、CPX标准品、ENRX标准品进行回收率实验，按实施例1中的固相萃取处理步骤对水样进行富集和提取，并进行HPLC-荧光测定，根据色谱图的峰高与标准品浓度的关系绘制工作曲线，利用峰高计算回收率，结果见表3。
表3回收率试验结果
| 纯水加标准品回收率(标准品浓度均为1×10-8mol/L) | RSD(％，n＝3) | 河水加标准品回收率(标准品浓度均为1×10-8mol/L) | RSD(％，n＝3) | |
| OFL | 86.0％ | 2.99 | 85.9％ | 0.91 |
| 纯水加标准品回收率(标准品浓度均为1×10-8mol/L) | RSD(％，n＝3) | 河水加标准品回收率(标准品浓度均为1×10-8mol/L) | RSD(％，n＝3) | |
| NOR | 95.2％ | 2.53 | 84.0％ | 2.74 |
| CPX | 94.4％ | 3.52 | 83.9％ | 2.14 |
| ENRX | 83.6％ | 4.26 | 89.2％ | 1.05 |
从表3看出：回收率都在83.6～95.2％之间，RSD也都在4.3％以内，表明本发明方法抗干扰能力强，在河水复杂的基体中也能较准确地测定目标化合物。
Claims (7)
1.一种氟喹诺酮类抗生素的固相萃取与HPLC-荧光检测方法，包括以下步骤：
(1)水样预处理：取50～2000mL含氟喹诺酮抗生素的水样过滤，滤液中添加浓度为0.1～0.4g/L的Na2EDTA水溶液，用酸调节pH至3.0～5.0，得到预处理后的水样；
(2)固相萃取：用0.5～2mL甲醇活化3次后，再用3～7mL浓度为0.1～0.4g/L的Na2EDTA水溶液活化固相萃取柱；
将预处理后的水样以1～5mL/min的速度通过活化的固相萃取柱，再用3～7mL浓度为0.1～0.4g/L的Na2EDTA水溶液淋洗固相萃取柱，然后抽真空20～40min，取浓氨水溶液与甲醇的体积比为2～3∶38～57的浓氨甲醇溶液洗脱三次，每次0.5～2mL，所得洗脱液在空气流中吹干至0.1～0.4mL，加水定容至1.0mL，得到测试样品；其中，所述的浓氨水溶液的体积百分浓度为25％；
(3)HPLC-荧光检测：采用C18色谱柱，以pH＝2.3～4.0、体积百分浓度为10～30％的甲醇水溶液作为流动相，流速为0.5～2mL/min，柱温10～50℃，设定荧光检测的激发波长为270～290nm，发射波长为450～470nm，分析测试样品，得到测试样品的色谱图，将色谱图上的峰高在工作曲线上回归，计算测试样品中氟喹诺酮抗生素的含量。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)水样预处理：取50～2000mL含氟喹诺酮抗生素的水样过滤，滤液中添加浓度为0.2g/L的Na2EDTA水溶液，用酸调节pH至4.0，得到预处理后的水样；
(2)固相萃取：用1mL甲醇活化3次后，再用5mL浓度为0.2g/L的Na2EDTA水溶液活化固相萃取柱；
将预处理后的水样以3mL/min的速度通过活化的固相萃取柱，再用5mL浓度为0.2g/L的Na2EDTA水溶液淋洗固相萃取柱，然后抽真空30min，取浓氨水溶液与甲醇的体积比为2～3∶38～47的浓氨甲醇溶液洗脱三次，每次1mL，所得洗脱液在空气流中吹干至0.2mL，加水定容至1.0mL，得到测试样品；
(3)HPLC-荧光检测：采用C18色谱柱，以pH＝4.0、体积百分浓度为20％的甲醇水溶液作为流动相，流速为1.0mL/min，柱温30℃，设定荧光检测的激发波长为281nm，发射波长为460nm，分析测试样品，得到测试样品的色谱图，将色谱图上的峰高在工作曲线上回归，计算测试样品中氟喹诺酮抗生素的含量。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的浓氨甲醇溶液中浓氨水溶液与甲醇的体积比为3∶47。
4.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述的氟喹诺酮抗生素为氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星或恩诺沙星。
5.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的酸为醋酸或磷酸。
6.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的固相萃取柱为填料是C18键合硅胶的固相萃取柱。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的固相萃取柱为Supelco Envi-18柱。
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