CN110308031A - 一种稳定的真菌荧光染色液 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种操作简便，染色效果好，检出率高且体系稳定易于保存的真菌荧光染色液。真菌荧光染色液中的荧光素可以高亲和力地与真菌细胞壁上的β‑多糖，如儿丁质与纤维素等结合，从而标记样品中存在的真菌成分，并在荧光显微镜下可以清楚地观察到真菌形态。该染色液添加了防干扰荧光助剂，可提高荧光染料与真菌细胞壁的结合率，另在紫外激发下，荧光强度增强，使得真菌菌丝与孢子等繁殖体发出明亮的蓝白荧光，在荧光显微镜观察下，真菌轮廓清晰可见同时提高染色液组分体系的稳定性，降低染液荧光淬灭风险；且此染色液一步染色，数秒上色，操作简单，节约检测时间，同时还可提高真菌检出率。
Description
技术领域
本发明属于医学诊断技术领域，具体涉及一种真菌荧光检测染色剂。
技术背景
真菌属于真核生物，没有质体，营养方式为吸收，无吞噬作用，可引起人类，动物的疾病，称为真菌病；还可引起植物的疾病、人类过敏性疾病和真菌毒素中毒症。目前已发现真菌约有上万种，其中有大约270多种对人类具有致病性。真菌侵犯人体常继发于其他疾患，如恶性肿瘤、糖尿病等慢性消耗性疾病；大剂量X线照射、免疫抑制剂等导致免疫功能和抵抗力低下患者容易感染真菌；大量应用肾上腺皮质激素的病人，其炎症反应多受抑制，也容易感染真菌；另外器官移植、导管插管、放疗等应用引起局部组织损伤，为真菌的入侵提供了条件。近年来由于免疫缺陷病毒感染者的不断出现，使原来不致病的真菌转为致病真菌。因此，真菌感染已经成为一个日益严峻的问题。
真菌分为浅部真菌和深部真菌。
浅部真菌：主要侵犯机体皮肤，寄生和腐生于表皮，毛发和指甲板的角质组织中，引起浅部真菌病，简称癣病。临床最多见的浅部真菌病有：体癣、股癣、手癣和足癣。
深部真菌：指侵犯表皮以外组织和器官的病原菌和条件致病真菌，常见的有：念珠菌，隐球菌，组织胞浆菌，马尔尼菲青霉菌，曲霉，毛霉菌，孢子菌丝等。
目前真菌感染常用检查方法有：直接镜检、革兰染色、吉姆萨染色、PAS法、六胺银法 (GMS)、培养法、Gridley染色、粘蛋白卡红、巴氏染色法等，其中：(1)直接镜检：直接镜检的方法方便经济，可采用不染色的湿片如KOH涂片或乳酸酚棉蓝涂片。对浅表和皮下真菌感染最有帮助，一般在有菌部位发现大量真菌菌丝即可作出诊断，可在几分钟内完成，并且观察到的真菌形态可以提供有价值的临床信息；(2)革兰染色：所有真菌、放线菌均为革兰染色阳性，被染成蓝黑色。适用于酵母菌、孢子丝菌、组织胞浆菌及诺卡菌放线菌的感染；(3)吉姆萨染色：可用于骨髓涂片和其他标本中荚膜组织胞浆菌和马内菲青霉的检测； (4)PAS法：用高碘酸氧化真菌菌壁的多糖游离出醛基，后者与无色品红结合生成新的品红色复合物而被显色；(5)六胺银法(GMS)：用铬酸氧化真菌壁的多糖而暴露出醛基，醛基还原六胺银内的银离子为黑色的金属银而显色；(6)培养法：指对临床标本进行培养，目的在于分离致病真菌，以明确是否存在真菌感染，特别是在直接镜检为阴性时，可从疑似患者身上采集标本，进一步进行真菌培养。一般培养超过2至4周以上依然没有真菌生长，才可报告阴性。
以上特殊染色法以及培养法的优势在于：在控制好染色或培养细节的前提下，可染出漂亮的真菌形态，容易辨识，而且其中培养法的检测准确率非常高。但是其缺点在于：1.操作过程需要严格控制时间以及温度等，稍有失误即会影响成片效果，影响结果判断，对操作人员专业技能要求比较高；2.操作繁琐，用时长(1小时左右)，培养法则需要2-4周，容易导致诊断不及时从而延误治疗；3.每种染色法需要使用的试剂多样，管理储存不便。
为了诊断真菌感染性疾病，通常采用荧光染色液，真菌荧光染色液中的荧光素可以高亲和力地与真菌细胞壁上的β-多糖，如几丁质与纤维素等结合，从而标记样品中存在的真菌成分，并在荧光显微镜下可以清楚的观察到真菌形态，所以真菌荧光染色液作为一种快速定性检测真菌的新型染色液，有着操作方便、敏感度高、准确率高的优势，可以替代传统镜检法，与真菌培养法形成完美互补，在感染早期为真菌病患者赢得最宝贵的治疗时机。
然而真菌荧光染色液存在染色效果不佳，染色后荧光效果淬灭快，染色液长期存放不稳定，使得染色后荧光强度较低等问题。
发明内容
本发明是为了克服上述局限，提供一种操作简便，染色效果好，检出率高且体系稳定易于保存的真菌荧光染色液。
本发明的另一个目的是提供一种操作简便，染色效果好，检出率高且体系稳定易于保存的制备方法。
一种稳定的真菌荧光染色液，其特征在于，所述真菌荧光染色液由以下试剂：荧光素、渗透剂、防干扰荧光助剂、稳定剂、促溶剂背景染料以及去离子水配置而成。
进一步地，所述真菌荧光染色液由如下组分按照重量百分比组成：荧光素0.1～2％、渗透剂1～15％、背景染料0.01～1％、防干扰荧光助剂0.1～5％、稳定剂10～30％、促溶剂5～ 25％、去离子水22～83.79％。
优选地，所述荧光素为荧光增白剂-28；
更优选地，所述荧光增白剂-28的重量份数为0.5～1份。
优选地，所述渗透剂为二甲基亚砜、二甲基乙酰胺、N-N-二甲基甲酰胺的一种或几种；
更优选地，所述二甲基亚砜的重量份数为5～15份。
优选地，所述防干扰荧光助剂为2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸钾与肌醇六磷酸钾的一种或几种；
更优选地，所述防干扰荧光助剂的重量份数为0.5～3份。
优选地，所述促溶剂为氢氧化钾、氢氧化钠中的一种或几种；
更优选地，所述促溶剂的重量份数为10～20份。
优选地，所述稳定剂为丙三醇、丙二醇、山梨醇中的一种或几种；
更优选地，所述稳定剂的重量份数为15～25份。
优选地，所述背景染料为伊文思蓝，台盼蓝、滂胺天蓝、溴酚蓝、百里酚
蓝，溴甲酚蓝的一种或几种；
更优选地，所述背景染料的重量份数为0.05～1份。
本发明还提供了一种稳定的真菌荧光染色液的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)按照重量百分比取荧光素0.5～1份、渗透剂5～15份、背景染料0.05～1份、防干扰荧光助剂0.5～3份、稳定剂15～25份、促溶剂10～20份、去离子水35～68.95份；
(2)将促溶剂溶于去离了水中形成水溶液，自然冷却至室温，待用；
(3)将荧光素溶于去离子水中形成水溶液，待用；
(4)将上述(2)(3)所述水溶液混合，待用；
(5)将渗透剂、防干扰荧光助剂以及稳定剂混合，待用；
(6)将(5)所述混合液滴加入(4)所述水溶液，边加入边搅拌，混合溶解后，自然冷却后过滤即成权利要求1中所述稳定的真菌荧光染色液。
优选地，所述过滤采用的方法为正压过滤法或负压过滤法中的一种，采用的是0.22～0.5 微米孔径的纤维素膜过滤。
本发明优势是：
提供一种操作简便，染色效果好，检出率高且体系稳定易于保存的真菌荧光染色液。该染色液添加了防干扰荧光助剂2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸钾以及肌醇六磷酸钾，因为荧光素在重金属离子的影响下，会出现被氧化或导致荧光淬灭的后果，而该助剂主要作用是螯合试剂中存在或者可能存在的金属离子，提高荧光染料与真菌细胞壁的结合率，另在紫外激发下，荧光强度增强，使得真菌菌丝与孢子等繁殖体发出明亮的蓝白荧光，在荧光显微镜观察下，真菌轮廓清晰可见同时提高染色液组分体系的稳定性，降低染液荧光淬灭风险；且此染色液一步染色，数秒上色，操作简单，节约检测时间，同时还可提高真菌检出率。
附图说明
图1为实施例1中制备的染色液的荧光染色图；
图2为实施例2中制备的染色液的荧光染色图；
图3为实施例3中制备的染色液的荧光染色图；
图4为实施例4中制备的染色液的荧光染色图；
图5为实施例5中对实施例1制备的染色液在80℃避光测试结果图；
图6为实施例5中对实施例3制备的染色液在80℃避光测试结果图；
图7为实施例5中对实施例1制备的染色液在-20℃的冰箱，反复冻融后的测试结果图；
图8为实施例5中对实施例3制备的染色液在-20℃的冰箱，反复冻融后的测试结果图；
图9为实施例5中对实施例1制备的染色液进行室温存放6个月后的测试结果图；
图10为实施例5中对实施例3制备的染色液进行室温存放6个月后的测试结果图；
图11为常规10％KOH的测试效果图。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1
(1)真菌荧光染料按照以下配方重量百分比混合而成：荧光增白剂0.5份、二甲基亚砜15份、伊文思蓝0.05份、丙三醇20份、氢氧化钾10份、去离子水54.45份；
(2)称取相应重量的氢氧化钾溶于去离子水中形成水溶液，自然冷却至室温，待用；
(3)称取相应重量的荧光增白剂-28溶于去离子水中形成水溶液，待用；
(4)将上述(2)(3)所述水溶液混合，待用；
(5)称取相应重量的二甲基亚砜、2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸钾以及丙三醇混合，待用；
(6)将(5)所述混合液滴加入(4)所述水溶液，边加入边搅拌，混合溶解后，自然冷却后过滤，即得所述真菌荧光染色液试剂1。
对曲霉菌样本进行检测，其检测效果见说明书附图1。从附图上可以见菌丝和孢子，但是菌丝与孢子结构不清晰，荧光强度较弱。
实施例2
(1)真菌荧光染料按照以下配方重量百分比混合而成：荧光增白剂0.5份、二甲基亚砜 15份、伊文思蓝0.05份、2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸钾1份、丙三醇20份、氢氧化钾10份、去离子水53.45份；
(2)称取相应重量的氢氧化钾溶于去离子水中形成水溶液，自然冷却至室温，待用；
(3)称取相应重量的荧光增白剂-28溶于去离子水中形成水溶液，待用；
(4)将上述(2)(3)所述水溶液混合，待用；
(5)称取相应重量的二甲基亚砜、2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸钾以及丙三醇混合，待用；
(6)将(5)所述混合液滴加入(4)所述水溶液，边加入边搅拌，混合溶解后，自然冷却后过滤，即得所述真菌荧光染色液试剂2。
对曲霉菌样本进行检测，其检测效果见说明书附图2。从附图上可以见菌丝和孢子，菌丝与孢子结构较图一清晰，荧光强度较强，真菌易于识别。
实施例3
(1)真菌荧光染料按照以下配方重量百分比混合而成：荧光增白剂0.5份、二甲基亚砜 15份、伊文思蓝0.05份、2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸钾3份、丙三醇20份、氢氧化钾10份、去离子水51.45份；
(2)称取相应重量的氢氧化钾溶于去离子水中形成水溶液，自然冷却至室温，待用；
(3)称取相应重量的荧光增白剂-28溶于去离子水中形成水溶液，待用；
(4)将上述(2)(3)所述水溶液混合，待用；
(5)称取相应重量的二甲基亚砜、2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸钾以及丙三醇混合，待用；
(6)将(5)所述混合液滴加入(4)所述水溶液，边加入边搅拌，混合溶解后，自然冷却后过滤，即得所述真菌荧光染色液试剂3。
对曲霉菌样本进行检测，其检测效果见说明书附图3。从附图上可以见菌丝和孢子，菌丝与孢子结构清晰，荧光强度强，真菌易于识别。
实施例4
(1)真菌荧光染料按照以下配方重量百分比混合而成：荧光增白剂0.5份、二甲基亚砜 15份、伊文思蓝0.05份、2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸钾5份、丙三醇20份、氢氧化钾10份、去离子水49.45份；
(2)称取相应重量的氢氧化钾溶于去离子水中形成水溶液，自然冷却至室温，待用；
(3)称取相应重量的荧光增白剂-28溶于去离子水中形成水溶液，待用；
(4)将上述(2)(3)所述水溶液混合，待用；
(5)称取相应重量的二甲基亚砜、2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸钾以及丙三醇混合，待用；
(6)将(5)所述混合液滴加入(4)所述水溶液，边加入边搅拌，混合溶解后，自然冷却后过滤，即得所述真菌荧光染色液试剂4。
对曲霉菌样本进行检测，其检测效果见说明书附图4。从附图上可以见菌丝和孢子，菌丝与孢子结构清晰，荧光强度强，真菌易于识别。
实施例5溶液稳定性试验
将试剂1、2、3、4分别进行低温实验，高温实验以及常温实验。
(1)高温实验
将染色液测试样品放置于80℃条件下，避光，一周后取出；然后对曲霉菌样本进行染色处理。从染色效果判断试剂的稳定性，结果如表1所示。
(2)低温实验
将染色液测试样品置于-20℃冰箱，反复冻融10次后取出；然后对曲霉菌样本进行染色处理。从染色效果判断试剂的稳定性，结果如表1所示。
(3)常温实验
将染色液测试样品置于不透明塑料瓶中，室温放置6个月后取出。然后对曲霉菌样本进行染色处理。从染色效果判断试剂的稳定性，结果如表1所示。
表1
结果表明，高温实验后，试剂1的外观颜色略微变红，染色效果很差，具体表现为视野暗淡，真菌荧光强度下降，真菌结构不清晰，与背景颜色对比非常弱；试剂2，3，4的染液外观与染色效果均没有发生改变，菌体结构清晰，镜检效果以试剂3、5尤佳；而低温实验中，试剂1、2、3、4的外观颜色均没有变化，灵敏度也高，无结晶，其中试剂1染色效果较其他三组稍差；常温实验中，四组实验染色效果都好，真菌荧光较强，菌丝及孢子结构清晰可见。
本发明可用于其他不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概括。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施案例都只可能以为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，因此，在于本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应以为是包括在权利要求书的范围。
Claims (10)
1.一种稳定的真菌荧光染色液，其特征在于，所述真菌荧光染色液由以下试剂：荧光素、渗透剂、防干扰荧光助剂、稳定剂、促溶剂背景染料以及去离子水配置而成。
2.根据权利要求1所述的稳定的真菌荧光染色液，其特征在于，所述真菌荧光染色液由如下组分按照重量百分比组成：荧光素0.1～2％、渗透剂1～15％、背景染料0.01～1％、防干扰荧光助剂0.1～5％、稳定剂10～30％、促溶剂5～25％、去离子水22～83.79％。
3.根据权利要求2所述的稳定的真菌荧光染色液，其特征在于，所述荧光素为荧光增白剂-28。
4.根据权利要求2所述的稳定的真菌荧光染色液，其特征在于，所述渗透剂为二甲基亚砜、二甲基乙酰胺、N-N-二甲基甲酰胺的一种或几种。
5.根据权利要求2所述的稳定的真菌荧光染色液，其特征在于，所述防干扰荧光助剂为2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸钾与肌醇六磷酸钾的一种或者几种。
6.根据权利要求2所述的稳定的真菌荧光染色液，其特征在于，所述促溶剂为氢氧化钾、氢氧化钠中的一种或几种。
7.根据权利要求2所述的稳定的真菌荧光染色液，其特征在于，所述稳定剂为丙三醇、内二醇、山梨醇中的一种或几种。
8.根据权利要求2所述的稳定的真菌荧光染色液，其特征在于，所述背景染料为伊文思蓝、台盼蓝、滂胺天蓝、溴酚蓝、百里酚蓝，溴甲酚蓝的一种或几种。
9.根据权利要求1所述的稳定的真菌荧光染色液制备步骤如下：
(1)按照重量百分比取荧光素0.1～2％、渗透剂1～15％、背景染料0.01～1％、防干扰荧光助剂0.1～5％、稳定剂10～30％、促溶剂5～25％、去离子水22～83.79％。；
(2)将促溶剂溶于去离子水中形成水溶液，自然冷却至室温，待用；
(3)将荧光素溶于去离子水中形成水溶液，待用；
(4)将上述(2)(3)所述水溶液混合，待用；
(5)将渗透剂、防干扰荧光助剂以及稳定剂混合，待用；
(6)将(5)所述混合液滴加入(4)所述水溶液，边加入边搅拌，混合溶解后，自然冷却后过滤即成权利要求1中所述稳定的真菌荧光染色液。
10.根据权利要求9所述的稳定的真菌荧光染色液的制备方法，其特征在于，所述过滤采用的方法为正压过滤法或负压过滤法中的一种，采用的是0.22～0.5微米孔径的纤维素膜过滤。
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