CN109297790A - 一种检测真菌的荧光染色液 - Google Patents
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Abstract
本发明属于检测领域，具体涉及一种检测真菌的荧光染色液的配置方法，荧光增白剂28 0.001‑0.003％、氢氧化钾5‑15％、二甲基亚砜3‑6％、氯化钠2‑5％、甘油5‑15％、伊文思蓝0.01‑0.03％，余量为纯化水，余量为纯化水的配比而成，本发明所提供的荧光染色液的菌丝和孢子结构清晰可见，易于识别真菌，灵敏度高，提高了染色结果判读的准确率和效率，检出率高，适用范围广。
Description
技术领域
本发明属于检测领域，具体涉及一种检测真菌的荧光染色液的配 置方法。
背景技术
真菌属于真核生物，没有质体，营养方式为吸收，无吞噬作用。 细胞壁含有甲壳质和β-葡聚糖。可引起人类，动物的疾病，称为真 菌病，还可引起植物的疾病、人类过敏性疾病和真菌毒素中毒症。真 菌侵犯人体常继发于其他疾患，如恶性肿瘤、糖尿病等慢性消耗性疾 病；大剤量X线照射；免疫抑制剂等导致免疫功能和抵抗力低下； 大量应用肾上腺皮质激素的病人，其炎症反应多受抑制，也容易感染 真菌；另外器官移植、导管插管、放疗等应用引起局部组织损伤，为 真菌的入侵提供了条件。近年来由于免疫缺陷病毒感染者的不断出现， 使原来不致病的真菌转为致病真菌。因此，真菌感染已经成为一个日 益严峻的问题。
真菌分为浅部真菌和深部真菌。浅部真菌:主要侵犯机体皮肤，寄 生和腐生于表皮，毛发和甲板的角质组织中，引起浅部真菌病，简称 癣病。临床最多见的浅部真菌病有:体癣、股癣、手癣和足癣。
真菌感染在常用的检测方法包括：直接镜检法(如KOH涂片或乳 酸酚棉蓝涂片)及染色镜检法。其中，直接镜检法缺点在于阳性率较 低，阴性结果也不能排除诊断，背景杂乱，灵敏度低，漏检率高，对 操作人员专业识别能力要求高。一般的染色镜检法包括：革兰染色、 吉姆萨染色、PAS法、六胺银法(GMS)、银氨液浸染法(G-S)、Gridley 染色法、粘蛋白卡红(Mayer’s Mucicarmin stain)染色法、巴氏染 色法等。这几种特殊染色法优点在于：在控制好染色细节的前提下， 可染出漂亮的真菌形态，容易辨识。缺点在于：1.对操作人员专业技 能要求比较高。2.操作繁琐，用时长(1小时左右)3.配套所需试 剂多，贮存管理麻烦。
发明内容
真菌为真核生物，细胞壁中含较多的几丁质及纤维素等β-多糖 类物质。而荧光增白剂可与人体各类组织或样本(包括皮屑、甲屑、 毛发、尿液、体液以及阴道分泌物等)中可能存在的细胞壁β-多糖 类物质特异性的结合，从而标记荧光进行检测。各种丝状真菌及酵母 菌均可以被荧光染色，包括念珠菌属、毛癣菌属、表皮癣菌属、小孢 子菌属、组织胞浆菌属、曲霉属等。真菌菌丝的不同发育阶段均可被 荧光染色，有助于病理诊断。荧光染色法亲和力高，反应时间只需数 十秒钟即可完，大大提高临床真菌检测灵敏度和效率。在荧光显微镜 特定的激发光波段下(340～400nm)，菌丝或孢子发出明亮的蓝绿色 荧光，真菌轮廓和黑暗背景可形成强烈对比反差，真菌形态结构较 KOH湿片法更为清晰，非常便于找寻和识别。而且真菌荧光染色液也 含10％KOH，溶解角质，使组织透化。值得注意的是，荧光染色法也 能标记植物纤维素，空气和玻片上存在的少量纤维，在荧光显微镜下 发荧光。但纤维形态一般不规则，大小、粗细、亮度等都与真菌有很 大差异，没有典型的真菌横隔和出芽结构，凭经验一般可以避免假阳 性情况的发生。本产品为单剂型染色液，不仅在操作上与KOH法步 骤一致，只需数十秒即可镜下观测(甲屑需延长1～2min)。而且标 本中菌丝、孢子荧光标记后结构清晰，显著提高了菌体辨识度。
一种检测真菌的荧光染色液，荧光染色液由以下配方按照重量百分比 混合而成：荧光增白剂280.001-0.003％、氢氧化钾5-15％、二甲基 亚砜3-6％、氯化钠2-5％、甘油5-15％、伊文思蓝0.01-0.03％，余量 为纯化水。
一种检测真菌的荧光染色液，荧光染色液由以下配方按照重量百分比 混合而成：荧光增白剂280.001％、氢氧化钾10％、二甲基亚砜4％、 甘油10％、伊文思蓝0.01％，余量为纯化水。
所述荧光染色液配置方法为：
(1)称取相应重量的氢氧化钾加入部分水进行充分搅拌溶解散热， 待冷却至室温后，加入二甲基亚砜、氯化钠和甘油，搅拌均匀至无分 层现象，此时会放热，冷却至室温备用，得到透明无色清澈液体，命 名为甲液；
(2)称取相应重量的荧光增白剂28加入部分水中进行充分搅拌溶解， 应为透明无色或淡黄色清澈液体，命名为乙液；
(3)称取相应重量的伊文思蓝加入部分水中进行充分搅拌溶解，得 到蓝紫色无析出物颗粒清澈液体，命名为丙液；
(4)将乙液加入至甲液充分混匀，确保容器内无固体沉淀或絮状物， 得到透明无色或淡黄色清澈液体，命名为丁液；
(5)最后将丙液与丁液混合，既得荧光染色液。
各配料的主要作用：
荧光增白剂：与真菌细胞壁β-多糖类物质特异性的结合，从而 标记荧光进行检测，在荧光显微镜特定的激发光波段下(340～ 400nm)，菌丝或孢子发出明亮的蓝绿色荧光。
氢氧化钾：溶解角质，使组织透化
二甲基亚砜：促进荧光增白剂在氢氧化钾溶液中溶解，同时帮助 荧光增白剂渗透进入样本中。
氯化钠：提高荧光增白剂28与真菌细胞壁结构的结合强度，在 紫外荧光激发的情况下，可以让菌体结构突显的更加清晰可见、立体， 更方便识别真菌。
甘油：保湿，保持滴了染色液的样本一定时间的湿度，便于镜下 观察。
伊文思蓝：弱化杂乱背景，使背景与真菌对比明显，便于识别。
本发明的有益效果
1、操作简单便捷，只需数十秒，极大的降低了操作人员的工作强度， 可实现大量样本的快速作业。
2、菌丝和孢子结构清晰可见，易于识别真菌，灵敏度高，提高了染 色结果判读的准确率和效率。
3、检出率高，适用范围广。
4、创造性的加入了氯化钠可提高荧光增白剂28与真菌细胞壁结构的 结合强度，在紫外荧光激发的情况下，可以让菌体结构突显的更加清 晰可见、立体，更方便识别真菌。
说明书附图
图1.足部皮屑(×10)；
图2.手部皮屑(×10)；
图3.指甲屑(×40)；
图4.阴道分泌物(×40)；
图5.阴道分泌物(×10)；
图6.腹股沟皮屑(×10)；
图7.阴道分泌物(×10)；
图8.阴道分泌物(×10)；
图9.手部皮屑(×10)；
图10.甲屑(×10)。
具体实施方式
实施例1
荧光染色液由以下配方按照重量百分比混合而成：荧光增白剂 280.001％、氢氧化钾10％、二甲基亚砜4％、氯化钠3.6％、甘油10％、 伊文思蓝0.01％，余量为纯化水；所述荧光染色液配置方法为：
(1)称取相应重量的氢氧化钾加入部分水进行充分搅拌溶解散热， 待冷却至室温后，加入二甲基亚砜、氯化钠和甘油，搅拌均匀至无分 层现象，此时会放热，冷却至室温备用，得到透明无色清澈液体，命 名为甲液；
(2)称取相应重量的荧光增白剂28加入部分水中进行充分搅拌溶解， 应为透明无色或淡黄色清澈液体，命名为乙液；
(3)称取相应重量的伊文思蓝加入部分水中进行充分搅拌溶解，得 到蓝紫色无析出物颗粒清澈液体，命名为丙液；
(4)将乙液加入至甲液充分混匀，确保容器内无固体沉淀或絮状物， 得到透明无色或淡黄色清澈液体，命名为丁液；
(5)最后将丙液与丁液混合，既得荧光染色液。
对皮屑、甲屑、阴道分泌物进行检测，其检测效果见说明书附图1-5。 从附图上可以看出菌丝和孢子结构清晰可见，易于识别真菌。
实施例2
未添加氯化钠的荧光染色液由以下配方按照重量百分比混合而 成：荧光增白剂280.001％、氢氧化钾10％、二甲基亚砜4％、甘油10％、 伊文思蓝0.01％，余量为纯化水；所述荧光染色液配置方法为：
(1)称取相应重量的氢氧化钾加入部分水进行充分搅拌溶解散热， 待冷却至室温后，加入二甲基亚砜和甘油，搅拌均匀至无分层现象， 此时会放热，冷却至室温备用，得到透明无色清澈液体，命名为甲液；
(2)称取相应重量的荧光增白剂28加入部分水中进行充分搅拌溶解， 应为透明无色或淡黄色清澈液体，命名为乙液；
(3)称取相应重量的伊文思蓝加入部分水中进行充分搅拌溶解，得 到蓝紫色无析出物颗粒清澈液体，命名为丙液；
(4)将乙液加入至甲液充分混匀，确保容器内无固体沉淀或絮状物， 得到透明无色或淡黄色清澈液体，命名为丁液；
(5)最后将丙液与丁液混合，既得荧光染色液。
对皮屑、甲屑、阴道分泌物进行检测，其检测效果见说明书附图6-10。 从附图上可以看出能够识别真菌，但菌丝和孢子结构清晰度较实施例 1中要差，菌丝结构不清晰，荧光强度也较弱。
实施例3
从医院获取197例已经有KOH湿片法镜检结果的阴道分泌物样本， 同时进行“金标准”真菌培养法、真菌荧光染色镜检法和未添加氯化 钠荧光染色液镜检法，具体操作步骤为：
一、真菌培养法
1.提前半小时打开超净工作台紫外灯消毒灭菌，操作者的衣着和手， 进行清洁和消毒。
2.拿出配置好的培养基，与妇科样本相对应进行编号。
3.按照对应编号，打开平板先在其上滴一滴已灭菌的生理盐水，将采 样拭子蘸上生理盐水后均匀涂布在平板上，盖上培养皿盖，将采样拭 子放回原管中。
4.倒置培养皿于33℃生化培养箱中培养24～72h，期间观察培养皿内 菌落生长情况。
二、真菌荧光染色镜检法
1.将样本转圈均匀涂至载玻片中间，
2.滴加真菌荧光染色液，盖上盖玻片，镜检。
三、未添加氯化钠的真菌荧光染色液镜检法
1.将样本转圈均匀涂至载玻片中间，
2.滴加未添加氯化钠的真菌荧光染色液，盖上盖玻片，镜检。 结果如下：
表1
表2
以上数据表明真菌荧光染色镜检法灵敏度(70.18％)远高于KOH 湿片法(47.37％)，同时较未添加氯化钠的真菌荧光染色镜检法的灵 敏度(61.4％)也高出近10％。
临床现用传统的方法(KOH湿片法)的漏检率为17.75％，未添加 氯化钠的真菌荧光染色液镜检法漏检率为(13.66％)，而真菌荧光染 色镜检法将漏检率降至10.9％。准确度真菌荧光染色液镜检法最高 (90.86％)。
Claims (3)
1.一种检测真菌的荧光染色液，其特征在于，荧光染色液由以下配方按照重量百分比混合而成：荧光增白剂280.001-0.003％、氢氧化钾5-15％、二甲基亚砜3-6％、氯化钠2-5％、甘油5-15％、伊文思蓝0.01-0.03％，余量为纯化水。
2.根据权利要求1所述的荧光染色液，荧光染色液的配方优选为：荧光增白剂280.001％、氢氧化钾10％、二甲基亚砜4％、氯化钠3.6％、甘油10％、伊文思蓝0.01％余量为纯化水。
3.根据权利要求1所述的荧光染色液，配置方法为：
(1)称取相应重量的氢氧化钾加入部分水进行充分搅拌溶解散热，待冷却至室温后，加入二甲基亚砜和甘油，搅拌均匀至无分层现象，此时会放热，冷却至室温备用，得到透明无色清澈液体，命名为甲液；
(2)称取相应重量的荧光增白剂28加入部分水中进行充分搅拌溶解，应为透明无色或淡黄色清澈液体，命名为乙液；
(3)称取相应重量的伊文思蓝加入部分水中进行充分搅拌溶解，得到蓝紫色无析出物颗粒清澈液体，命名为丙液；
(4)将乙液加入至甲液充分混匀，确保容器内无固体沉淀或絮状物，得到透明无色或淡黄色清澈液体，命名为丁液；
(5)最后将丙液与丁液混合，既得荧光染色液。
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