CN105548123B - 一种鉴别微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的双色荧光标记方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的双色荧光标记方法，先将经封闭处理的组织切片或细胞采用β‑Tubulin抗体通过间接免疫荧光法标记裂殖增殖期的微孢子虫；再将组织切片或细胞用荧光增白剂染几丁质的方法标记孢子增殖期的微孢子虫；最后用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜对样品进行观察。本发明的方法替代了利用免疫透射电子显微镜观察不同增殖时期微孢子虫的复杂方法，操作过程简单，打破对电子显微镜的依赖性，便于观察，且易于利用多色荧光标记法进行微孢子虫蛋白的亚细胞定位，同时也适用于其他属微孢子虫，适用范围广泛。
Description
技术领域
本发明属于免疫细胞化学技术和荧光显微技术，具体涉及一种鉴别微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的双色荧光标记方法。
背景技术
家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是引起蚕业疫病家蚕微粒子病的专性细胞内寄生真核生物。家蚕微孢子虫大小为2～5μm，其生活史可分为3个阶段：感染期、裂殖增殖期、孢子增殖期。感染期为生活史中的胞外期，该时期家蚕微孢子虫为成熟孢子，在光镜下具很强折光性，适宜条件下可通过弹出极管注入孢原质或细胞内吞等方式感染宿主细胞。裂殖增殖期的家蚕微孢子虫未形成孢壁，不含有几丁质成分，孢子增殖期和感染期的微孢子虫具有由几丁质和蛋白组成的孢壁。微孢子虫的感染常常通过光学显微镜观察感染期的成熟孢子进行诊断(Cali et al.2011)，相差显微镜或微分干涉显微镜观察成熟孢子时其折光性很强。研究者们采用了多种方式以易于微孢子虫观察，包括采用传统的染色剂如姬姆萨、革兰氏和革兰氏变色酸处理对固定涂片进行制样(van Gool et al.1993；Moura etal.1997；Strano et al.1976)，通过Calcofluor White M2R等荧光染料处理(Sak etal.2011；Schwartz et al.1992)，或者使用一些特殊的染色方法如格莫瑞六亚甲基四胺银(GMS)染色、海登海因氏铁苏木精染色、萋—尼氏染色(Gray et al.1969；Strano etal.1976)或periodic acid–Schiff(PAS)染色等。但是，这些技术大多仅能便于成熟微孢子虫的观察，不能区分微孢子虫增殖的不同时期。由于正在发育过程中的微孢子虫体积太小而且位于宿主细胞内，特别是裂殖增殖期的微孢子虫，很难通过显微镜观察，因此大多数微孢子虫的结构和发育阶段都是在扫描电子显微镜(TEM)或者透射电子显微镜(SEM)的帮助下，结合免疫胶体金标记及电脑断层摄影术进行研究的。由于已报道的常规的分辨不同增殖时期的微孢子虫依赖电子显微镜且对技术要求较高，处理过程繁冗耗时，应用具有极大的局限性。因此，急需建立一种简便、有效的微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的标记方法，以促进微孢子虫生活史和功能基因组学研究。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鉴别微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的双色荧光标记方法，该方法操作简单，使用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜即可实现，打破了对电子显微镜的依赖。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种鉴别微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的双色荧光标记方法，包括如下步骤：
(1)将经封闭处理的组织切片或细胞采用β-Tubulin抗体通过间接免疫荧光法标记裂殖增殖期的微孢子虫；
(2)然后将组织切片或细胞用荧光增白剂染几丁质的方法标记孢子增殖期的微孢子虫；
(3)用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜对样品进行观察。
经封闭处理的组织切片或细胞可采用现有方法制得，其中封闭处理的细胞由以下方法制得：先将感染微孢子虫的宿主细胞固定于载玻片上；然后将固定后的细胞采用Triton X-100溶液浸浴细胞，透化15～30min；再将透化后的细胞采用细胞封闭液进行封闭即可。
本发明中，固定的方法为将质量分数为0.01～0.1％的多聚赖氨酸溶液涂抹在载玻片上，风干后得到多聚赖氨酸处理后的载玻片备用；然后将感染微孢子虫的组织切片或细胞滴加到涂有多聚赖氨酸处理的载玻片上，静置5min；吸除多余液体，滴加质量分数为4％的多聚甲醛溶液覆盖细胞固定15min，吸除固定细胞的多余液体，滴加0.01mol/L PBS溶液浸浴细胞，清洗2次，每次3min。
本发明中，所述透化为用体积分数为0.1～2％的Triton X-100溶液透化，优选为用体积分数为2％的Triton X-100溶液透化。
本发明中，所述封闭为滴加封闭液覆盖细胞，18～37℃处理1h；所述的封闭液为0.05％(V/V)Tween 20，2％(V/V)Triton X-100，0.05％(W/V)BSA和10％(V/V)山羊血清的PBS溶液。
本发明中，所述采用β-Tubulin抗体通过间接免疫荧光法标记裂殖增殖期的微孢子虫的方法为将封闭细胞用含0.05％(V/V)Tween 20的PBS溶液清洗后，将以封闭液与β-Tubulin的抗体按体积比为1：200稀释的一抗工作液浸浴细胞，18～37℃孵育1h；吸除一抗工作液液，用含0.05％(V/V)Tween 20的PBS溶液清洗后，再用以封闭液与Alexa Fluor 594标记的山羊抗小鼠IgG按体积比为1:2000稀释的二抗工作液浸浴细胞，常温孵育1h；吸除二抗工作液，再用含0.05％(V/V)Tween 20的PBS溶液清洗。
本发明中，荧光增白剂染几丁质的方法标记孢子增殖期的微孢子虫的方法如下：滴加0.1μg/mL Calcofluor White M2R染色液覆盖细胞，18～37℃孵育10min；吸除染色液，用含0.05％(V/V)Tween 20的PBS溶液清洗后滴加抗荧光淬灭封片剂即可。
本发明所述微孢子优选为家蚕微孢子虫，所述宿主优选为家蚕。
本发明的有益效果在于：本发明公开了一种鉴别微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的双色荧光标记方法，以家蚕微孢子虫为例，该方法操作简便，识别便利，适用于其他种属微孢子虫的研究；突破了现有技术只能通过制备超薄切片通过透射电子显微镜观察以区分不同增殖时期微孢子虫的限制，大大降低科研成本、技术要求和平台要求；并且本发明的方法，可采用多色荧光标记，以鉴定微孢子虫蛋白的表达时期及其在微孢子虫不同增殖时期的亚细胞定位情况；亦可应用于组织切片中各时期微孢子虫的免疫荧光标记，具有很好的应用前景。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为裂殖增殖期和孢子增殖期家蚕微孢子虫荧光标记图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
一种鉴别家蚕微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的双色荧光标记方法，包括如下步骤：
(1)感染家蚕微孢子虫的昆虫细胞固定：取50μL为0.1％(W/V，g/ml)的多聚赖氨酸溶液在载玻片上涂抹1cm的圆形区域，风干后得到多聚赖氨酸处理后的载玻片备用；然后吸取感染家蚕微孢子虫的家蚕细胞滴加到涂有多聚赖氨酸处理的载玻片上，静置5min；吸除多余液体，滴加为4％(W/V，g/ml)的多聚甲醛溶液覆盖昆虫细胞固定15min，吸除固定昆虫细胞的多余液体，滴加0.01mol/L PBS溶液浸浴细胞，清洗2次，每次3min；
(2)透化：吸除液体后滴加体积分数为2％的Triton X-100溶液浸浴细胞，透化15～30min；吸除透化多余液体，PBS溶液浸浴细胞清洗3次，每次3min；
(3)封闭：吸除液体后滴加封闭液覆盖细胞，18～37℃处理1h，期间观察样品3次，以补足封闭液避免细胞干燥；所述的封闭液为0.05％(V/V)Tween 20，2％(V/V)Triton X-100，0.05％(W/V，g/ml)BSA和10％(V/V)山羊血清的PBS溶液；
(4)间接免疫荧光法标记裂殖增殖期的家蚕微孢子虫：吸除封闭液，清洗液浸浴细胞清洗2次，每次2min，所述清洗液为含0.05％(V/V)Tween 20的PBS溶液；然后采用封闭液将β-Tubulin的抗体按体积比为1：200稀释制备一抗工作液，然后滴加一抗工作液浸浴细胞，18～37℃孵育1h；吸除一抗工作液液，滴加清洗液清洗3次，每次5min；采用封闭液将Alexa Fluor 594标记的山羊抗小鼠IgG按体积比为1:2000稀释制备二抗工作液，再滴加二抗工作液浸浴细胞，常温孵育1h；吸除二抗工作液，滴加清洗液清洗3次，每次5min；
(5)荧光增白剂染几丁质标记孢子增殖期的家蚕微孢子虫：滴加0.1μg/mLCalcofluor White M2R染色液覆盖细胞，室温孵育10min；吸除染色液，滴加清洗液清洗3次，每次2min；吸除液体，取5μL抗荧光淬灭封片剂点加到载玻片上，盖上盖玻片，指甲油封片；
(6)荧光显微镜或激光共聚焦显微镜进行观察拍照，结果如图1所示。
从图1可以看出，采用本发明的方法可以清楚地分辨裂殖增殖期的家蚕微孢子虫(红色荧光标记的家蚕微孢子虫β-Tubulin)，孢子增殖期的家蚕微孢子虫(蓝色荧光标记的家蚕微孢子虫孢子的几丁质层)。
实施例2
一种鉴别家蚕微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的双色荧光标记方法，包括如下步骤：
(1)感染家蚕微孢子虫的昆虫细胞固定：取12mm圆形玻片置于24孔细胞培养板中心位置，滴加100μL 0.01％(W/V，g/ml)的多聚赖氨酸溶液覆盖后风干，得到多聚赖氨酸处理后的载玻片备用；吸取感染家蚕微孢子虫的家蚕细胞转移至多聚赖氨酸处理的载玻片上，静置5min；吸除多余液体，向培养孔添加100μL4％(W/V，g/ml)的多聚甲醛溶液，固定15min；吸除多余液体，向培养孔添加100μL 0.01mol/L PBS溶液浸浴样品，缓慢振荡清洗2次，每次2～5min；
(2)透化：吸出多余液体后100μL(V/V)2％Triton X-100溶液，透化15～30min；吸除多余液体，PBS溶液缓慢振荡清洗3次，每次2～5min；
(3)封闭：吸除液体后滴加封闭液覆盖细胞，18～37℃处理1h，期间观察样品3次，以补足封闭液避免细胞干燥；所述的封闭液为0.05％(V/V)Tween 20，2％(V/V)Triton X-100，0.05％(W/V，g/ml)BSA和10％(V/V)山羊血清的PBS溶液；
(4)间接免疫荧光法标记裂殖增殖期的家蚕微孢子虫：吸除封闭液，清洗液浸浴细胞清洗2次，每次2min，所述清洗液为含0.05％(V/V)Tween 20的PBS溶液；然后采用封闭液将β-Tubulin的抗体按体积比为1：200稀释制备一抗工作液，然后滴加一抗工作液浸浴细胞，18～37℃孵育1h；吸除一抗工作液液，滴加清洗液清洗3次，每次2min；采用封闭液将Alexa Fluor 594标记的山羊抗小鼠IgG按体积比为1:2000稀释制备二抗工作液，再滴加二抗工作液浸浴细胞，常温孵育1h；吸除二抗工作液，滴加清洗液清洗3次，每次2min；
(5)荧光增白剂染几丁质标记孢子增殖期的家蚕微孢子虫：滴加0.1μg/mLCalcofluor White M2R染色液覆盖细胞，室温孵育5～15min；吸除染色液，滴加清洗液清洗3次，每次2min；吸除液体，取5μL抗荧光淬灭封片剂点加到载玻片上，盖上盖玻片，指甲油封片；
(6)荧光显微镜或激光共聚焦显微镜进行观察拍照，结果与图1相同。
结果表明采用本发明的方法可以清楚的分辨裂殖增殖期的家蚕微孢子虫和孢子增殖期的家蚕微孢子虫，并且不依赖电子显微镜。
由于其他种属微孢子虫的裂殖增殖期和孢子增殖期与家蚕微孢子具有相同的区别，因此该方法也适用于种属微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期区别。
本发明的标记方法也适用于宿主组织切片，只要采用β-Tubulin抗体通过间接免疫荧光法标记裂殖增殖期的微孢子虫；荧光增白剂染几丁质的方法标记孢子增殖期的微孢子虫均可采用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜分辨裂殖增殖期的家蚕微孢子虫和孢子增殖期的家蚕微孢子虫，其中宿主组织切片采用现有方法制备。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.一种鉴别微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的双色荧光标记方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）将经封闭处理的组织切片或细胞采用β-Tubulin抗体通过间接免疫荧光法标记裂殖增殖期的微孢子虫；
（2）然后将封闭的组织切片或细胞用荧光增白剂染几丁质的方法标记孢子增殖期的微孢子虫；所述荧光增白剂为Calcofluor White M2R染色液；
（3）用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜对样品进行观察。
2.根据权利要求1所述一种鉴别微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的双色荧光标记方法，其特征在于，所述封闭处理的细胞由以下方法制得：先将感染微孢子虫的宿主细胞固定于载玻片上；然后将固定后的细胞采用Triton X-100溶液浸浴细胞，透化15~30min；再将透化后的细胞采用细胞封闭液进行封闭即可；所述的封闭液为含0.05%（V/V）Tween 20，2%（V/V）Triton X-100，0.05%（W/V）BSA和10%（V/V）山羊血清的PBS溶液。
3.根据权利要求2所述一种鉴别微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的双色荧光标记方法，其特征在于：所述固定为将质量分数为0.01~0.1% 的多聚赖氨酸溶液涂抹在载玻片上，风干后得到多聚赖氨酸处理后的载玻片备用；然后将感染微孢子虫的昆虫切片或细胞滴加到涂有多聚赖氨酸处理的载玻片上，静置5 min；吸除多余液体，滴加质量分数为 4% 的多聚甲醛溶液覆盖细胞固定15 min，吸除固定细胞的多余液体，滴加0.01 mol/L PBS溶液浸浴细胞，清洗2次，每次3 min。
4.根据权利要求2所述一种鉴别微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的双色荧光标记方法，其特征在于：所述透化为用体积分数为0.1~2%的Triton X-100溶液透化。
5.根据权利要求2所述一种鉴别微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的双色荧光标记方法，其特征在于：所述封闭为封闭液覆盖细胞，18~37℃处理1 h。
6.根据权利要求1所述一种鉴别微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的双色荧光标记方法，其特征在于：步骤（1）中，所述采用β-Tubulin抗体通过间接免疫荧光法标记裂殖增殖期的微孢子虫的方法为将封闭细胞用体积分数为0.05% Tween 20的PBS溶液清洗后，以一抗工作液浸浴细胞，18~37℃孵育1 h；吸除一抗工作液，用体积分数为0.05% Tween 20的PBS溶液清洗后，再用二抗工作液浸浴细胞，18~37℃孵育1 h；吸除二抗工作液，再用体积分数为0.05% Tween 20的PBS溶液清洗；所述一抗工作液为封闭液与β-Tubulin的抗体按体积比为1：200稀释；所述二抗工作液为封闭液与Alexa Fluor 594标记的山羊抗小鼠IgG按体积比1:2000稀释。
7.根据权利要求1所述一种鉴别微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的双色荧光标记方法，其特征在于：荧光增白剂染几丁质的方法标记孢子增殖期的微孢子虫的方法如下：滴加0.1μg/mL Calcofluor White M2R染色液覆盖细胞，18~37℃孵育10 min；吸除染色液，用体积分数为0.05% Tween 20的PBS溶液清洗后滴加抗荧光淬灭封片剂即可。
8.权利要求1~7任一项所述一种鉴别微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的双色荧光标记方法，其特征在于：所述微孢子为家蚕微孢子虫，所述宿主为家蚕。
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Citations (5)
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|---|---|---|---|---|
| US7718427B2 (en) * | 2007-05-28 | 2010-05-18 | National Taiwan University | Established cell lines from Lymantria xylina |
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7718427B2 (en) * | 2007-05-28 | 2010-05-18 | National Taiwan University | Established cell lines from Lymantria xylina |
| CN101967512A (zh) * | 2009-07-27 | 2011-02-09 | 浙江大学 | 一种家蚕微粒子病荧光pcr检测方法及其试剂盒 |
| CN103243170A (zh) * | 2013-05-24 | 2013-08-14 | 江苏省蚕种公司 | 一种家蚕成品卵中微孢子虫数量水平的检测方法 |
| CN104195237A (zh) * | 2014-08-13 | 2014-12-10 | 中国农业大学 | 一种pcr检测蝗虫微孢子虫病的方法 |
| CN104726566A (zh) * | 2015-03-02 | 2015-06-24 | 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 | 多重pcr检测肠道新发原虫试剂盒及检测方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
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| Calcofluor White M2R 与 Sytox Green 双重染色法鉴别蜜蜂微孢子虫;秦浩然等;《应用昆虫学报》;20121231;第1392-1396页 * |
| 家蚕微孢子虫总蛋白两条大分子量主带的 ＬＣ;周小伟等;《蚕学通讯》;20121231;第32卷(第4期);第1-8页 * |
| 微孢子虫极管蛋白的研究进展;龙梦娴等;《蚕业科学》;20141231;第40卷(第5期);第0917-0923页 * |
| 微孢子虫检测技术的研究进展;王永宾等;《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》;20090430;第27卷(第2期);第161-166页 * |
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