CN109845721A

CN109845721A - 一种头足类透明标本的制作方法

Info

Publication number: CN109845721A
Application number: CN201910255517.8A
Authority: CN
Inventors: 陈栋林; 郑小东
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2019-04-01
Filing date: 2019-04-01
Publication date: 2019-06-07

Abstract

本发明的目的是提供一种头足类透明标本的制作方法，更注重将表层肌肉腐蚀透明，以突出贝类标本的内部结构，同时以不同的染色剂进行染色，使得标本更具观赏性；从而解决现有技术中头足类透明标本制备效果不佳的问题。本发明的方法与传统纯粹使用酒精保存标本相比，避免了标本脱水变小、蛋白质变性使标本僵直等问题；与用福尔马林保存相比，甘油保存无毒，更加安全。由于染色以及腐蚀透明的作用，使标本更加美观，制作出的标本不仅可用于科研观察，亦可用于工艺品展示。

Description

一种头足类透明标本的制作方法

技术领域

本发明属于动物标本制备技术领域，具体是一种头足类透明标本制作方法。

背景技术

目前保存水生生物标本的主要使用福尔马林或酒精来进行保存，两种溶液都有能够长期保存标本，但都有明显的缺点。福尔马林泡过的标本容易发臭，具有腐蚀性，而且难以提取DNA；酒精泡过的标本虽然易于提取DNA，但易使标本僵硬而难以观察探究其形态。近年来，透明鱼的标本的方法正在兴起，技术日益成熟。该技术具有保存时间长，观赏性高，易于观察、提取DNA，不易发臭等优点。但将该技术应用于贝类领域中，制备的头足类透明标本的效果并不好。

在透明鱼标本的制备过程中，主要是将肌肉腐蚀殆尽后，再对骨骼进行染色，从而凸显出鱼的骨架结构。而头足类标本中，由于骨骼结构较少(例如乌贼有海标壳，而章鱼没有骨骼)，不能将肌肉完全腐蚀后再对骨骼进行染色，否则会导致标本形态不完整。因此，按照已有的透明鱼类标本制备方法来制备头足类标本的效果并不好。

发明内容

本发明的目的是提供一种头足类透明标本的制作方法，更注重将表层肌肉腐蚀透明，以突出贝类标本的内部结构，同时以不同的染色剂进行染色，使得标本更具观赏性；从而解决现有技术中头足类透明标本制备效果不佳的问题。

本发明所提供的头足类透明标本的制作方法，包括如下的步骤：

1)将新鲜的头足类去除墨囊，洗净墨汁后，放入95％的酒精中2-5天进行脱水处理

所取样品的长度要求如下：乌贼5-15cm，章鱼10-21cm，鱿鱼5-13cm；

2)将步骤1)处理后的样品放入2％KOH溶液中，进行透明处理；至标本表面色素溶解，标本变软为止；

3)将标本放入染色剂溶液中，浸泡1-2天，使标本完全染上颜色；

其中不同类型的染色剂的组成如下：

阿利新蓝溶液：阿利新蓝1.0g/L，50％的95％酒精，10％冰醋酸，40％蒸馏水；

甲苯胺蓝溶液：甲苯胺蓝1.0g/L，50％的95％酒精，10％冰醋酸，40％蒸馏水；

番红O溶液：0.1％的番红溶液；

茜素红溶液：茜素红1.0g/L，KOH20.0g/L；

4)用褪色液(KOH10g/L，20％丙三醇，80％蒸馏水)对标本进行褪色处理，处理2-3天；

5)将褪色后的标本放入透明液(KOH5g/L，50％丙三醇，50％蒸馏水)中继续透明，处理2-3周；

6.)将步骤5)处理好的标本放入甘油中封装保存，完成标本制备。

本发明的方法与传统纯粹使用酒精保存标本相比，避免了标本脱水变小、蛋白质变性使标本僵直等问题；与用福尔马林保存相比，甘油保存无毒，更加安全。由于染色以及腐蚀透明的作用，使标本更加美观，制作出的标本不仅可用于科研观察，亦可用于工艺品展示。

附图说明

图1:透明鱿鱼标本染色图，其中(a)阿利新蓝染色；(b)茜素红染色；(c)番红O染色；(d)甲苯胺蓝染色

图2：章鱼透明标本的正面观(左)和腹面观(右)，其中(a)阿利新蓝染色；(b)甲苯胺蓝染色；(c)茜素红染色；(d)番红O染色；

图3：乌贼的透明标本的正面观(左)和腹面观(右)图，其中(a)不同浓度的阿利新蓝染色；(b)甲苯胺蓝染色；(c)番红O染色；(d)茜素红染色图；

图4：未去除墨囊的头足类标本图，其中(a)章鱼；(b)乌贼(腹面观)；

图5：被过氧化氢氧化腐蚀的头足类标本，其中(a)-(c)为章鱼标本；(d)乌贼标本；

图6：标本保存效果展示(部分)，其中(a)、(e)乌贼标本；(b)章鱼标本；(c)、(d)鱿鱼标本。

具体实施方式

本发明通过对染色步骤的调节，以及染色剂、褪色液和透明液的组成的优化，使制备的贝类的透明标本的表层肌肉腐蚀透明，突出了贝类标本的内部结构，同时以不同的染色剂进行染色，主要突出了头足类标本触腕、牙齿、眼睛、海标壳(乌贼)以及内部结构，方便形态学观察。制作出的标本精致美观，方便携带，还具有工艺品的效果。

1)将新鲜的的头足类标本去除墨囊，确保洗净墨汁后，放入95％的酒精中2-5天进行脱水处理

其中不同染色剂的组成如下：

阿利新蓝溶液：阿利新蓝1.0g/L，50％的95％酒精溶液，10％冰醋酸，40％蒸馏水；

甲苯胺蓝溶液：甲苯胺蓝1.0g/L，50％的95％酒精溶液，10％冰醋酸，40％蒸馏水；

番红O溶液：0.1％的番红溶液；

茜素红溶液：茜素红1.0g/L，KOH20.0g/L；

本发明方法相比于透明鱼标本制备方法的不同之处：

1、透明鱼标本在制作前需要去除鳞片、内脏和表皮；透明头足类标本在制备时，不需要去除表皮，但需要去除墨囊，洗净墨汁，如果不去除墨汁，后期在KOH等试剂的腐蚀下墨囊容易破裂，导致墨汁流出污染标本(图4)；

2、透明鱼标本在酒精固定步骤中，需要将标本绑在玻璃片上，以保持其正常的形态；透明鱿鱼、乌贼鱿鱼由于个体较小、身体柔软，可以耐受一定的弯曲而无需固定在玻璃板上；透明章鱼由于身体较大，为防止过度形变，可放在亚克力盒中横放来进行试验，同样也不需要固定在玻璃板上

3、在用氢氧化钾腐蚀透明一步中，透明鱼标本停止透明的标志是鱼体成半透明状态，从外面能隐约地看到里面的骨骼；而透明鱿鱼、章鱼停止透明的标志是本表面色素基本溶解，标本变软，透明乌贼还能清晰地看到内部的海标壳结构；

4、在染色步骤中，透明鱼标本受制于对骨骼的染色，因而使用的染色剂的选择范围很有限，仅为1-2种，主要用茜素红；而透明头足类标本由于以肌肉、软组织为主要染色对象，可使用的染色剂十分广泛，在本实施案例中首次同时使用了4种染色剂，即阿利新蓝、番红O、茜素红和甲苯胺蓝，来对头足类透明标本进行染色。(见图1-3)

5、在染色步骤中，透明鱼标本停止染色的标志为：当骨骼染上颜色为止；而透明头足类标本由于缺少相应的硬骨结构，因此当标本通体染上较深的颜色时即可停止染色

6、在褪色步骤中，透明鱼标本制备时需要用过氧化氢进行褪色；但在头足类透明标本制备中，过氧化氢会氧化腐蚀标本(尤其是对于章鱼和乌贼)，使得标本产生大量气泡，影响透明效果(见图5)，因此在染色一步中需要适当稀释，降低染色液浓度，在褪色一步中跳过使用过氧化氢的步骤；

7、从最终染色结果上来看，透明鱼标本主要体现的是鱼的骨架结构，其肌肉、眼睛等部分基本丧失；透明头足类标本主要体现地是头足类的内部结构，其肌肉、软体组织的大致结构基本保存，并能凸显出眼睛、触腕等结构，方便形态学的观察(见图1-3)。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：鱿鱼透明标本的制作

1、取新鲜的、完整没有破损的鱿鱼标本(长度5-13cm)，为了防止墨囊破裂墨汁污染鱿鱼外套膜内结构，将鱿鱼放在清水中，用细针管在墨囊上刺破一小口，挤压墨囊将墨汁挤出，当从外表观察墨囊不成黑色且无墨汁挤出时即可认为排墨完全

2、将去除墨汁后的鱿鱼放入95％的酒精2天，使标本基本脱水

3、将标本放入2％KOH溶液中，进行透明。浸泡1-2天，使标本表面色素基本溶解，标本变软

4、将标本放入染色剂中，浸泡2天，使标本完全染上颜色为止。

不同染色剂配制方法如下：

阿利新蓝溶液：阿利新蓝1.0g，95％酒精溶液500ml，冰醋酸100ml，蒸馏水400ml；

甲苯胺蓝溶液：甲苯胺蓝1.0g，95％酒精溶液500ml，冰醋酸100ml，蒸馏水400ml；

番红O溶液：0.1％的番红溶液；

茜素红溶液：茜素红1.0g，KOH20.0g，蒸馏水1000ml；

在具体使用染色剂过程中，可针对不同的染色深度对上述染色剂进行一定浓度的稀释，本实施例中所使用的浓度如下：

使用阿利新蓝时，用蒸馏水按1:9进行稀释；使用茜素红和甲苯胺蓝时，用蒸馏水按1：19进行稀释；使用番红O时，用蒸馏水按1:29进行稀释。

5、用褪色液(KOH0.5g，丙三醇10ml，蒸馏水40ml)对标本进行褪色处理，处理2-3天；

6、将褪色后的标本放入透明液(KOH3.0g，甘油300ml，蒸馏水300ml)中继续透明，用时2周，完成标本制备

7、将做好的标本放入甘油中封装保存(见图6c-e)

制作出的透明鱿鱼标本，色彩丰富，形态美观，突出了触腕、眼睛等部位，具有观察和形态学研究价值；同时，使用纯甘油来进行保存，甘油无色、无臭、味甜，外观呈澄明黏稠液态，具有较好的生物相容性，能很好的保存标本的形态并且不对标本造成破坏；其保存时间长，同时能长期保存其颜色，具有较好的保存效果。

实施例2：乌贼透明标本的制作

1、取新鲜的、外表完整没有破损的乌贼标本(长度5-15cm)去除墨囊，洗净墨汁，放入95％的酒精中固定2天，使标本基本脱水。固定后，可观察到酒精溶液变为黄色，大量油脂溶解，且溶液底部可观察到絮状沉淀

2、将标本放入2％KOH溶液中，进行腐蚀透明。浸泡1天，使标本表面色素大部分洗去，同时能清晰的看到乌贼的海标壳结构；

3、将标本放入染色剂中，浸泡2天，使标本完全染上颜色。

不同染色剂配制方法如下：

阿利新蓝溶液：阿利新蓝1.0g，95％酒精溶液500ml，冰醋酸100ml，蒸馏水400ml

甲苯胺蓝溶液：甲苯胺蓝1.0g，95％酒精溶液500ml，冰醋酸100ml，蒸馏水400ml

番红O溶液：0.1％的番红溶液

茜素红溶液：茜素红1.0g，KOH20.0g，蒸馏水1000ml

在具体使用染色剂过程中，可针对不同的染色深度对上述染色剂进行一定浓度的稀释，本案例所使用的浓度：

使用阿利新蓝时，用蒸馏水按1:9进行稀释；使用茜素红、甲苯胺蓝、番红O时，用蒸馏水按1:39进行稀释。

4、用褪色液(KOH0.5g，丙三醇10ml，蒸馏水40ml)对标本进行褪色处理，处理2天；

5、将褪色后的标本放入透明液(KOH3.0g，甘油300ml，蒸馏水300ml)中继续透明，用时2周，完成标本制备

6、将做好的标本放入甘油中封装保存(见图6a)

制作出的透明乌贼标本，能清晰地看到其内部的海标壳结构，同时凸出了触腕、眼睛等结构；同时，使用纯甘油来进行保存，保存时间长并且能较好地保持其形态，同时能长期保存其颜色，具有较好的保存效果。

实施例3：章鱼透明标本的制作

1、取新鲜的、完整没有破损的章鱼标本(长度10-21cm)去除墨囊，洗净墨汁，放入95％的酒精中固定2天，使标本基本脱水。固定后，可观察到酒精溶液变为黄色，大量油脂溶解，且溶液底部观察到絮状沉淀

2、将标本放入2％KOH溶液中，进行腐蚀透明。浸泡3天，使标本表面色素大部分褪去

3、将标本放入阿利新蓝染色剂中，浸泡2天，使标本完全染上颜色。

不同染色剂配制方法如下：

番红O溶液：0.1％的番红溶液

茜素红溶液：茜素红1.0g，KOH20.0g，蒸馏水1000ml

6、将做好的标本放入甘油中封装保存(见图6b)

制作出的透明章鱼标本，能清晰地看到触腕上的吸盘，同时凸出了眼睛和头的内部结构；同时，使用纯甘油来进行保存，保存时间长并且能较好地保持其形态，同时能长期保存其颜色，具有较好的保存效果。

实施例4：章鱼透明标本的制作的反例

不去除墨囊，直接将章鱼标本放入95％的酒精中固定2天，使标本基本脱水。其余步骤同实施例3，最终效果见图4a

可以明显地观察到章鱼的头部变黑，这是由于在KOH等试剂的腐蚀下，墨囊破裂，墨汁流出，污染了章鱼的头部结构，极大地影响章鱼内部结构的观察。

实施例5：(乌贼透明标本的制作的反例)

不去除墨囊，直接将乌贼标本(长度10-21cm)放入95％的酒精中固定2天，使标本基本脱水。其余步骤同实施例2，最终效果见图4b

从腹面观察，可见乌贼外套膜内墨囊附近区域全部变黑，这是由于在KOH等试剂的腐蚀下，墨囊破裂，墨汁污染乌贼内部结构所致。

实施例6：(章鱼透明标本的制作的反例)

1、步骤1-3同实施例3

2、用0.5％过氧化氢溶液对标本进行初步褪色，2天后，用褪色液(KOH0.5g，丙三醇10ml，蒸馏水40ml)再次对标本进行褪色处理，处理2天；

3、其余步骤同实施例3，最终效果见图5a-5c

在章鱼的头部、触腕等处，可见大量白色气泡，连成一片，遮蔽了下层肌肉的颜色，难以看清章鱼的内部结构，同时又因为其存在于表皮之下，难以去除，极大地破坏了标本的美观性。

实施例7：(乌贼透明标本的制作的反例)

1、步骤1-3同实施例2

3.其余步骤同实施例2，最终效果见图5d。

与实施例6类似，可在乌贼的外套膜和触腕处看到大量白色气泡，极大地影响了乌贼内部结构的观察。

Claims

1.一种头足类透明标本的制作方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

4)用褪色液对标本进行褪色处理，处理2-3天；

5)将褪色后的标本放入透明液中继续透明，处理2-3周；

6)将步骤5)处理好的标本放入甘油中封装保存，完成标本制备。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样品的长度，其中乌贼5-15cm，章鱼10-21cm，鱿鱼5-13cm。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的染色剂的组成如下：

番红O溶液：0.1％的番红溶液；

茜素红溶液：茜素红1.0g/L，KOH20.0g/L。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的褪色液的组成如下：KOH10g/L，20％丙三醇，80％蒸馏水。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的透明液的组成如下：KOH5g/L，50％丙三醇，50％蒸馏水。