CN101897328B - 一种原虫样本的染色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种原虫样本的染色方法，包括一个配制溶液的步骤，所述的溶液包括聚乙烯醇固定液、三色染液和Masson三色染液，包括一个制作刮片标本的步骤，还包括一个染色的步骤。本发明应用相对低毒环保的聚乙烯醇固定液替代传统的肖氏固定液，同时通过复合三色染色法增强虫体的着色来达到传统三色染色的效果，并且可以长期保存标本。本发明应用的聚乙烯醇固定液无毒、环保，对人体无明显危害，而且虫体经复合染色后内部色彩更加丰富，结构更清晰。
Description
技术领域：
本发明涉及生物领域，尤其涉及一种将病理切片染色方法与原虫涂片染色方法相结合来实现原虫样本长期保存的方法，具体来说是一种原虫样本的染色方法。
背景技术：
蓝氏贾第鞭毛虫简称贾第虫，主要寄生在人和某些哺乳动物的小肠内，引起以腹泻为主要症状的蓝氏贾第鞭毛虫病。本病多见于儿童和旅游者，故又称“旅游者腹泻”。贾第虫感染呈世界性分布，感染率为1％～20％，儿童、年老体弱者和免疫功能缺陷者尤其易感。我国的流行也相当普遍，呈全国性分布。贾第虫病的感染不同于其他肠道寄生虫，它不仅多见于经济落后、卫生状况不良的国家和地区，而且在工业发达的国家也出现流行或暴发流行。如今贾第虫病已被列为全世界危害人类健康的十种主要寄生虫病之一。
诊断贾第虫常用的病原学检查方法是用生理盐水直接涂片法或滴加2％的碘液从粪便中查到滋养体或包囊。虽然这种方法用于临床诊断简便易行，但是无法用于保存标本，而且由于内部结构不能清晰显示，因此将其用于实验教学的效果并不理想。
相反，三色染色的标本色彩鲜艳，虫体内部结构清晰，长期保存颜色基本保持不变。经三色染色的贾第虫虫体包囊呈淡绿色，椭圆形，囊壁较厚，不着色。核偏于一端，核仁、轴柱、丝状物均呈深紫色。传统的三色染色要求粪检标本在载玻片上涂成薄膜并且放入肖氏固定液中固定30分钟。而肖氏固定液的主要成分之一氯化高汞为剧毒化学品，常温下微量挥发，对人体危害严重，并且污染周围环境。因此，用一种相对低毒环保的固定液来替代肖氏固定液，同时又能达到原有的染色效果，一方面可以将标本保留存档，另一方面也有助于教学和传统技术的传承。
发明内容：
本发明的目的是提供一种原虫样本的染色方法，所述的这种原虫样本的染色方法要解决现有技术中的固定标本的液体太毒，对人体危害严重，并且污染周围环境的技术问题以及染色标本的褪色问题。
本发明提供了一种原虫样本的染色方法，包括一个配制溶液的步骤，所述的溶液包括聚乙烯醇固定液、三色染液和Masson三色染液，包括一个制作刮片标本的步骤，在所述的制作刮片标本的步骤中，首先在固定液中加入冰醋酸，搅拌混匀，然后将粪样加入固定液，搅拌混匀，吸干固定液，将粪渣刮至载玻片上保存，还包括一个染色的步骤，首先将粪便刮片放入乙醇中清洗，将粪便刮片放在三色染液中染色，吸干染色液后，在添加有冰醋酸的乙醇中清洗，吸干后，将粪便刮片放入Weigert氏铁苏木素染液10-15分钟，水洗，然后采用盐酸酒精分化，再用丽春红酸性品红染液染5-10分钟，水洗，再用磷钼酸溶液处理，吸干后用苯胺蓝染液复染5-10分钟，再用冰醋酸处理，酒精脱水，二甲苯透明处理和中性树胶封固。
进一步的，所述的聚乙烯醇固定液通过如下步骤配制，
a)配制硫酸铜水溶液，硫酸铜水溶液的质量百分比浓度在15-20％之间；
b)在上述的硫酸铜水溶液中加入聚乙烯醇，充分溶解，聚乙烯醇的加入量为硫酸铜水溶液的质量的1％-1.2％，然后在其中加入占硫酸铜水溶液的体积50-70％的90-99％质量百分比浓度的乙醇，充分混匀；
c)使用前以硫酸铜水溶液计算，按照10∶0.8-1.2的比例加入冰醋酸。
进一步的，所述的三色染液通过如下步骤配制：首先配制一个三色基础液，所述的三色基础液由变色酸2R、亮绿、磷钨酸和水组成，所述的变色酸2R占所述的三色染液的重量百分比为0.5-0.7％，所述的亮绿占所述的三色染液的重量百分比为0.2-0.4％，所述的磷钨酸占所述的三色染液的重量百分比为0.6-0.8％，余量为水，然后在三色基础液中加入冰醋酸，所述的冰醋酸的加入量为所述的三色基础液的体积的0.8-1.2％。
进一步的，所述的Masson三色染色液通过如下步骤配制，
1)配制Weigert氏铁苏木素染液：
A液：配制苏木素酒精溶液，使得苏木素在酒精中的质量百分比浓度为0.8％-1.2％；
B液：将重量百分比浓度为25-35％的三氯化铁水溶液加入水中，三氯化铁水溶液占B液的体积百分比为3-5％，然后在水中加入质量百分比浓度为25-40％的浓盐酸，浓盐酸占B液的体积百分比为0.8-1.2％；
使用前取A液与B液等量混合即可；
2)配制丽春红酸性品红溶液：
所述的丽春红酸性品红溶液由丽春红、酸性品红、冰醋酸和水组成，在配制丽春红酸性品红溶液的的步骤中，包括一个配制丽春红酸性品红基础溶液的步骤，在丽春红酸性品红基础溶液中，丽春红占丽春红酸性品红基础溶液的质量百分比为0.5-0.9％，所述的酸性品红占丽春红酸性品红基础溶液的质量百分比为0.2-0.4％，余量为水，然后在丽春红酸性品红基础溶液中加入冰醋酸，所述的冰醋酸的加入量为丽春红酸性品红溶液体积的0.8-1.2％；
3)配制磷钼酸水溶液：
所述的磷钼酸水溶液由水和磷钼酸组成，其中磷钼酸在水溶液中的质量百分比为0.8-1.2％，余量为水；
4)配制苯胺蓝溶液：
所述的苯胺蓝溶液由苯胺蓝、冰醋酸和水组成，在配制所述的苯胺蓝溶液的过程中，包括一个配制苯胺蓝基础溶液的步骤，在苯胺蓝基础溶液中，苯胺蓝占苯胺蓝基础溶液的质量百分比浓度为1.8-2.2％，余量为水，然后在苯胺蓝基础溶液中加入冰醋酸，冰醋酸的加入量为苯胺蓝溶液的体积的1.8-2.2％。
本发明应用相对低毒环保的固定液替代传统的肖氏固定液，同时通过复合三色染色法增强虫体的着色来达到传统三色染色的效果，并且可以长期保存标本。
本发明与传统三色染色法相比具有如下优点：
1.聚乙烯醇固定液无毒、环保，对人体无明显危害。
2.虫体经复合染色后内部色彩更加丰富，结构更清晰。
附图说明：
图1显示了采用复合染色的蓝氏贾第鞭毛虫包囊囊壁边缘呈淡蓝色轮廓的一个照片，核呈紫红色或深紫色。轴柱呈深紫色，丝状物呈淡玫瑰红色。
图2显示了显示了采用复合染色的蓝氏贾第鞭毛虫包囊囊壁边缘呈淡蓝色轮廓另一个照片，核呈紫红色或深紫色。轴柱呈深紫色，丝状物呈淡玫瑰红色。
图3显示了传统染色的蓝氏贾第鞭毛虫包囊囊壁不着色，核、轴柱、丝状物均呈深紫色。
具体实施方式：
实施例1：
(一)聚乙烯醇固定液的配制方法：
1.硫酸铜饱和溶液CuSO4·5H2O 20克加入100℃蒸馏水中，混匀直至充分溶解，定容至1000毫升。
2.PVA固定液：聚乙烯醇5克加入500毫升硫酸铜饱和溶液中充分混匀溶解，再加300毫升95％的乙醇充分混匀。临用时按10∶1的比例加入冰醋酸。
(二)粪便刮片标本的制作：
取10毫升配制好的PVA液装于15毫升带帽的离心管中，如果PVA有析出则应充分混匀，加粪便1克，搅拌混匀，充分振摇后倒至滤纸上，待PVA液被滤纸吸干后用盖玻片一侧取滤纸上粪渣刮至载玻片上，4℃保存。
(三)三色染液配制：
变色酸2R 0.6克，亮绿0.3克，磷钨酸0.7克，冰醋酸1毫升，加双蒸水定容至100毫升。
(四)Masson三色染色液的配制：
1.Weigert氏铁苏木素染液：
A液：将苏木素1克溶于100毫升无水酒精，让其慢慢氧化成熟，约四周以后，便可以使用。
B液：29％三氯化铁水溶液4毫升加入95毫升蒸馏水中，再加入浓盐酸1毫升。使用前取A液与B液等量混合即成。
2.丽春红酸性品红溶液：
丽春红0.7克，酸性品红0.3克，加入99毫升蒸馏水中充分溶解，再加入1毫升冰醋酸。
3.磷钼酸水溶液：磷钼酸1克溶解于蒸馏水中，定容至100毫升。
4.苯胺蓝溶液：苯胺蓝2克，冰醋酸2毫升溶解于蒸馏水中，定容至100毫升。
实施例2：单份或小样本的染色
1.准备工作：包括固定液、三色染液、Masson三色染液的配制。PVA溶解于饱和硫酸铜溶液时需要在水浴锅中边加热边摇匀，同时由于温度达到摄氏95-100度左右，为防止水分挥发，试剂瓶需盖上瓶盖。三色染液与Masson三色染液需密闭保存在棕色瓶中。
2.刮片标本的制作：固定液在临用前需加入冰醋酸，充分摇匀。如果PVA析出较多，则在加冰醋酸之前最好通过加热使PVA重新溶解，加热时盛放固定液的管子同样需盖上盖子。粪样加入固定液后需用竹签充分搅拌混匀以使粪便得到完全固定。用于吸干固定液的滤纸最好采用快速定性滤纸以加快吸干固定液的速度。刮片时粪膜不可太厚，否则会影响结果观察。刮片标本需晾干后才能染色。
3.染色：
染色操作步骤如下：
1)将粪便刮片依次放入70％的乙醇2次，每次1分钟。
2)三色染液中染色10分钟。
3)取出并彻底吸干后，在加1％冰醋酸的90％乙醇中洗10-15分钟。
4)水洗后吸干玻片，放入Weigert氏铁苏木素染液中10-15分钟，流水稍洗。
5)1％盐酸酒精分化，流水冲洗数分钟。
6)丽春红酸性品红染液染5-10分钟，蒸馏水稍冲洗。
7)磷钼酸溶液处理约5分钟，吸干后不用水洗直接用苯胺蓝染液复染5-10分钟。
8)1％冰醋酸处理1分钟，95％酒精两次脱水。
9)无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
10)染色结果：贾第虫包囊囊壁边缘呈淡蓝色轮廓，核呈紫红色
或深紫色。轴柱呈深紫色，丝状物呈淡玫瑰红色。
另外需要注意的是：整个染色过程中染液须将粪膜全部覆盖。含冰醋酸的溶液须在临用时加入冰醋酸。Weigert氏铁苏木素染液的A、B两夜须在临用时等比例混合。流水冲洗时水流不可过大以免冲掉粪膜。
4.结果观察：高倍镜下仅可见虫体轮廓，要看清内部结构须在油镜下观察(如图1、图2所示)。
实施例3：大样本的染色
当粪便样本较多来不及及时处理染色时，需要事先准备好固定液，分装入15毫升离心管中待用。临刮片时分别加入冰醋酸混匀，刮好的标本晾干后可以在4度保存数月分批染色观察。
Claims (1)
1.一种原虫样本的染色方法，其特征在于：包括一个配制溶液的步骤，所述的溶液包括聚乙烯醇固定液、三色染液和Masson三色染液，包括一个制作刮片标本的步骤，在所述的制作刮片标本的步骤中，首先在固定液中加入冰醋酸，搅拌混匀，然后将粪样加入固定液，搅拌混匀，吸干固定液，将粪渣刮至载玻片上保存，还包括一个染色的步骤，首先将粪便刮片放入乙醇中清洗，将粪便刮片放在三色染液中染色，吸干染色液后，在添加有冰醋酸的乙醇中清洗，吸干后，将粪便刮片放入Weigert氏铁苏木素染液，水洗，然后采用盐酸酒精分化，再用丽春红酸性品红染液染5-10分钟，水洗，再用磷钼酸溶液处理，吸干后用苯胺蓝染液复染5-10分钟，再用冰醋酸处理、酒精脱水、二甲苯透明处理和中性树胶封固；
所述的聚乙烯醇固定液通过如下步骤配制，
a)配制硫酸铜水溶液，硫酸铜水溶液的质量百分比浓度在15-20％之间；
b)在上述的硫酸铜水溶液中加入聚乙烯醇，充分溶解，聚乙烯醇的加入量为硫酸铜水溶液的质量的1％-1.2％，然后在其中加入占硫酸铜水溶液的体积50-70％的90-99％质量百分比浓
度的乙醇，充分混匀；
c)使用前以硫酸铜水溶液计算，按照10∶0.8-1.2的比例加入冰醋酸；
所述的三色染液通过如下步骤配制：首先配制一个三色基础液，所述的三色基础液由变色酸2R、亮绿、磷钨酸和水组成，所述的变色酸2R占所述的三色染液的重量百分比为0.5-0.7％，所述的亮绿占所述的三色染液的重量百分比为0.2-0.4％，所述的磷钨酸占所述的三色染液的重量百分比为0.6-0.8％，余量为水，然后在三色基础液中加入冰醋酸，所述的冰醋酸的加入量为所述的三色基础液的体积的0.8-1.2％；
所述的Masson三色染液通过如下步骤配制，
1)配制Weigert氏铁苏木素染液：
A液：配制苏木素酒精溶液，使得苏木素在酒精中的质量百分比浓度为0.8％-1.2％；
B液：将重量百分比浓度为25-35％的三氯化铁水溶液加入水中，三氯化铁水溶液占B液的体积百分比为3-5％，然后在水中加入质量百分比浓度为25-40％的浓盐酸，浓盐酸占B液的体积百分比为0.8-1.2％；
使用前取A液与B液等量混合即可；
2)配制丽春红酸性品红染液：
所述的丽春红酸性品红染液由丽春红、酸性品红、冰醋酸和水组成，在配制丽春红酸性品红染液的步骤中，包括一个配制丽春红酸性品红基础溶液的步骤，在丽春红酸性品红基础溶液中，丽春红占丽春红酸性品红基础溶液的质量百分比为0.5-0.9％，所述的酸性品红占丽春红酸性品红基础溶液的质量百分比为 0.2-0.4％，余量为水，然后在丽春红酸性品红基础溶液中加入冰醋酸，所述的冰醋酸的加入量为丽春红酸性品红染液体积的0.8-1.2％；
3)配制磷钼酸溶液：
所述的磷钼酸溶液由水和磷钼酸组成，其中磷钼酸在水溶液的质量百分比为0.8-1.2％，余量为水；
4)配制苯胺蓝染液：
所述的苯胺蓝染液由苯胺蓝、冰醋酸和水组成，在配制所述的苯胺蓝染液的过程中，包括一个配制苯胺蓝基础溶液的步骤，在苯胺蓝基础溶液中，苯胺蓝占苯胺蓝基础溶液的质量百分比浓度为1.8-2.2％，余量为水，然后在苯胺蓝基础溶液中加入冰醋酸，冰醋酸的加入量为苯胺蓝染液的体积的1.8-2.2％。
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