CN105651579B - 一种α-丁酸萘酚酯酶染色试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种α‑丁酸萘酚酯酶染色试剂盒。本发明所述试剂盒包括固定液、α‑丁酸萘酚酯溶液、重氮盐、基础缓冲液、复染液，其中固定液为含有乙醇、甲醛、海藻糖、海藻酸钠和多元醇的缓冲液。本发明调整了α‑NBE染色中的固定液配方组成，在甲醛基础上加入了能够完善固定效果以及增强染色效果的乙醇、海藻糖、海藻酸钠和多元醇，不仅能够降低甲醛的危害作用，而且在保证优异的染色效果前提下将样品保存时间延长至30天，同时在基础缓冲液中增加了泊洛沙姆407，可配合固定液进一步增强染色效果，弥补了现有α‑NBE染色方法的缺陷。

Description

一种α-丁酸萘酚酯酶染色试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及α-丁酸萘酚酯酶(α-NBE)染色液(化学染色法)，即一种α-丁酸萘酚酯酶染色试剂盒。

背景技术

细胞化学染色技术在上世纪中期盛行于血液病实验室，用化学染色方法来观察细胞内某些成分或代谢产物，弥补细胞形态学的不足，对白血病辅助鉴别诊断的提高有重要的价值。因此，临床上细胞化学染色成为辅助诊断白血病必要的、有力的手段，对急性白血病的类型鉴别诊断、发病机制研究、疗效观察和预后评估起着十分重要的作用。

α-丁酸萘酚酯酶(α-Naphthyl Butyrate Esterase，α-NBE)是一种非特异性酯酶，其主要存在于单核细胞中，而在各期粒细胞均为阴性反应，较其它酶对单核细胞特异性强。α-丁酸酯反应细胞化学染色法为1985年国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的非特异性酯酶染色方法，其检测原理为细胞内的α-NBE在一定pH条件下水解基质液中的α-丁酸萘酚，释放出α-萘酚，后者再与重氮盐偶联形成有色沉淀，定位于酶活性所在的部位，沉淀物的显色深浅与α-NBE活性成正比。单核细胞阳性产物能被氟化钠抑制，而其他细胞系的阳性产物不能被氟化钠抑制。α-NBE染色能够很好显示出粒细胞和单核细胞各自的特点，可以大幅度的提高鉴别白血病中的粒、单细胞的准确率。特别是M4、M5型急性非淋巴细胞白血病(ANLL)异质性显著，粒细胞系统和单核细胞系统在骨髓中均有不同比例的改变，很难确定单核细胞和粒细胞系统的成分，通过细胞化学染色技术可以辅助鉴别和区分单核细胞系统和粒细胞系统。

影响细胞化学染色结果的因素众多，其中标本的制备和保存方式及固定剂的选择，对酶染色结果有直接的影响。目前，细胞化学染色制片方法均为抽取病人的血或骨髓细胞后进行涂片染色，但是在实际工作中，从标本收集到染色常需要一定的时间，如样本采集后不能及时染色测定，搁置时间过久，细胞暴露干燥从而会损害细胞的结构，最终影响染色结果。因此在血细胞涂 片后需加入适量固定液对细胞进行固定，以保持细胞结构及化学成分特别是细胞内的蛋白质、酶类等活性，目前市售染色试剂盒多是以福尔马林或丙酮为基础的固定液，其成分对酶的活性有抑制作用，且用甲醛处理久存后，易氧化产生甲酸，使溶液pH降低，影响染色效果。高浓度的甲醛和丙酮毒性和刺激性较大，对环境和操作人员有伤害。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供α-丁酸萘酚酯酶(α-NBE)染色液(化学染色法)，即一种含有特定固定液的α-丁酸萘酚酯酶染色试剂盒，使所述固定液能够在保证染色效果的前提下延长保存样本的时间，同时使所述试剂盒应用于α-NBE检测时能够提高样本的染色效果，阴阳性区别显著。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种α-丁酸萘酚酯酶染色试剂盒，包括固定液、α-丁酸萘酚酯溶液、重氮盐、基础缓冲液、复染液。所述固定液为含有乙醇、甲醛、海藻糖、海藻酸钠和多元醇的缓冲液。

本发明所述试剂盒中的固定液添加了一定比例的乙醇、多元醇、海藻糖和海藻酸钠。乙醇的加入可在降低毒性较强的甲醛浓度的同时保持固定液的固定效果；海藻糖和海藻酸钠具有超强的保持细胞活力和生物大分子活性的性质，可在细胞表层形成一层特殊的保护膜，保护细胞，还可帮助细胞在玻片上充分分散开，使得制片更简易；多元醇可防止样本细胞在制片过程中干燥，多元醇选择甘油时，还可对酶活性的维持起一定的作用。

在本发明所述试剂盒中，固定液各组分浓度优选如下：

乙醇的体积百分比浓度为15～70％、甲醛的体积百分比浓度为0.3～2.0％，海藻糖的质量2.0～6.0％、海藻酸钠的质量体积百分比浓度为0.01～2.0％、多元醇体积百分比浓度为0.5～4.0％。

上述体积百分比浓度是指该组分体积/固定液体积的百分比，而质量体积百分比浓度为该组分质量/固定液体积的百分比。进一步优选地，所述多元醇为甘油。在本发明的具体实施方式中，各组分可选择如下：

乙醇的体积百分比浓度为40％、甲醛的体积百分比浓度为0.8％，海藻糖的质量2.0％、海藻酸钠的质量体积百分比浓度为0.03％、甘油体积百分比浓度为2.0％。

所述固定液中的缓冲液优选为2-吗啉代乙磺酸缓冲液(MES)、1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷缓冲液(Bis-Tris)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液(PIPES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液(MOPS)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液(Tricine)、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris)、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液中一种；进一步优选的，所述缓冲液的浓度为0.005～0.1M，pH为6.5～7.5。在本发明的具体实施方式中，所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液，浓度0.01M，pH为7.0。

本发明所述试剂盒中的基础缓冲液可包含泊洛沙姆407。泊洛沙姆407属新型非离子表面活性剂，无色、无臭、无味、无毒具有良好的乳化性，用于人血细胞可增加细胞膜的通透性且无溶血作用。泊洛沙姆407的加入可增加细胞膜的通透性，使底物更容易进入细胞内，配合固定液进一步增强染色效果。

所述基础缓冲液优选为2-吗啉代乙磺酸(MES)、1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷(Bis-Tris)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液之一。

其中，所述泊洛沙姆407在基础缓冲液中的质量体积百分比浓度优选为0.001～1.0％；所述基础缓冲液浓度优选为0.01～0.2M，pH为6.0～7.0。在本发明的具体实施方式中，所述泊洛沙姆407在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中的质量体积百分比浓度为0.01％，所述基础缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，浓度为0.1M，pH为6.6。

本发明固定液中的缓冲液或是试剂盒中的基础缓冲液能调节和维持反应体系的pH与离子强度，为酶反应提供合适的反应体系，本领域技术人员可根据本发明提供的缓冲液选择进行浓度和pH的调整。

本发明所述试剂盒中α-丁酸萘酚酯溶液、重氮盐、复染液均可以采用本领域常规α-NBE染色法中的选择，例如α-丁酸萘酚酯为α-丁酸萘酚酯酶反应底物，溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、乙二醇单甲醚中的一种，优选DMF；重氮盐可选自坚牢紫GBC、坚牢蓝B中的一种；复染液可选自中性红、甲基绿、苏木素、核固红、沙黄中的一种，复染液选择苏木素，可选择为Harry`s苏木素、Weigert氏铁苏木素、Ehrlich氏苏木素(1886)、Mayer`s苏木素、改良Lillie-Mayer`s苏木素的一种，优选改良的Lillie-Mayer`s苏木素。

此外，本发明还提供了本发明试剂盒的染色方法，主要包括以下步骤：

步骤1：将样本与固定液按体积比为1:5比例混匀，涂片，室温干燥30min。

步骤2：将α-丁酸萘酚酯溶液、重氮盐置于基础缓冲液中混匀配制基质液。

步骤3：将步骤1所得的涂片置入步骤2所得的基质液中，37℃放置60min，然后连缸流水冲洗数分钟。

步骤4：用复染液复染1～2min，水洗待干，镜检。

若作NaF抑制试验，步骤2中配制两缸基质液，其中一份加入NaF，使其浓度为0.04M；另一份不加氟化钠作对照。

本发明中α-丁酸萘酚酯、重氮盐的选择以及浓度可根据本领域已有的做法根据实际情况调整，本发明上述步骤3中所述基质液中α-丁酸萘酚酯是α-丁酸萘酚酯酶反应底物，参考浓度为0.05～1.0g/L，优选为0.1g/L；重氮盐选择坚牢紫GBC时，参考浓度为0.5～2.0g/L，优选为1.0g/L。

在和现有的α-NBE染色方法的对比中，本发明固定液和现有的40％甲醛固定液一同固定相同血液样品，在2-8℃下放置30天后再进行染色，结果显示，本发明阴性胞质内无色素沉淀物，阳性胞质内出现棕红色沉淀物，阴阳性区别显著。同现有方法比较，细胞形态维持完整，阳性棕红色沉淀定位好，染色背景清晰。样本储存30天本发明试剂盒染色胞质内棕红色颗粒明显，表明本方法保存的酶活性维持较好，而传统方法染色阴阳性区别不显著。

由以上技术方案可知，本发明调整了α-NBE染色中的固定液配方组成，在甲醛基础上加入了能够完善固定效果以及增强染色效果的乙醇、海藻糖、海藻酸钠和多元醇，不仅能够降低甲醛的危害作用，而且在保证优异的染色效果前提下将样品保存时间延长至30天，弥补了现有α-NBE染色方法的缺陷。

附图说明

图1所示为用本发明试剂盒染色的血细胞涂片镜检结果；

图2所示为用现有方法染色的血细胞涂片镜检结果；

图3所示为用本发明固定液固定30天后染色的血细胞涂片镜检结果；

图4所示为用现有甲醛固定方法固定30天后染色的血细胞涂片镜检结果。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种α-丁酸萘酚酯酶染色试剂盒及其中的固定液。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的固定液和试剂盒已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种α-丁酸萘酚酯酶染色试剂盒及其中的固定液进行详细说明。

实施例1：本发明所述染色试剂盒及染色方法

1、本发明试剂盒的组成及制备方法

固定液：0.01M Tris、乙醇40％(v/v)、甲醛0.8％(v/v)、海藻糖2.0％(w/v)、海藻酸钠0.03％(w/v)、甘油2％(v/v)，pH 7.0(25℃)。以2.5ml/瓶分装，2～8℃冰箱储存待用。

α-丁酸萘酚酯溶液：12g/Lα-丁酸萘酚酯的DMF溶液，以1ml/瓶分装。

重氮盐：坚牢紫GBC粉末，以30mg/瓶分装。

基础缓冲液：0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，0.01％泊洛沙姆407，pH 6.6，以29ml/瓶分装。

复染液：分别用20ml无水乙醇溶解2.5g苏木素，330ml蒸馏水溶解5g硫酸铝钾，然后两液混合后，依次加入250mg碘酸钠、150ml甘油和10ml冰醋酸。

2、本发明所述染色试剂盒的染色方法

步骤1：将样本与固定液在2～8℃按体积比为1:5比例混匀，取混匀后的样本制备2份相同的涂片，室温干燥30min，水洗。

步骤2：将α-丁酸萘酚酯溶液、重氮盐各1瓶置入基础缓冲液中充分混匀成为基质液。

步骤3：上述将步骤1所得2份涂片分别置入两缸基质液中，一缸中加入NaF，37℃孵育60min，然后连缸流水冲洗数分钟。

步骤4：用复染液复染1～2min，水洗待干镜检。

实施例2：现有α-NBE染色方法

1、现有α-NBE染色试剂的制备

固定液：40％甲醛；

染色液：将α-丁酸萘酚0.01ml溶于0.5ml丙酮，再与0.1M磷酸缓冲液(pH 8.0)10ml和坚牢蓝BB盐15mg混匀，过滤后立即使用；

复染液：分别用20ml无水乙醇溶解2.5g苏木素，330ml蒸馏水溶解5g硫酸铝钾，然后两液混合后，依次加入250mg碘酸钠、150ml甘油和10ml冰醋酸。

2、染色方法

步骤1：新鲜干燥涂片用甲醛蒸气固定5min，水洗，待干。

步骤2：置于染色液(37℃)作用1h，水洗，待干。

步骤3：苏木素复染2min，水洗，待干，镜检。

实施例3：染色效果对比试验

取正常人外周血，以实施例1本发明方法与实施例2现有染色方法分别进行染色，染色后的血涂片镜检并拍照，如图1和图2。

取正常人外周血，本发明方法与现有染色方法分别用固定液处理，放置30天后进行染色，镜检并拍照，如图3和图4。

结果判断：阴性胞质内无色素沉淀物，阳性胞内出现棕红色沉淀物。

染色结果分析：本发明阴性胞质内无色素沉淀物，阳性胞质内出现棕红色沉淀物，阴阳性区别显著。同现有方法比较，细胞形态维持完整，阳性棕 红色沉淀定位好，染色背景清晰。样本储存30天本发明试剂盒染色胞质内棕红色颗粒明显，表明本方法保存的酶活性维持较好，而现有方法染色阴阳性区别不显著，胞质内棕红色颗粒不明显。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (11)

1.一种α-丁酸萘酚酯酶染色试剂盒，其特征在于，包括固定液、α-丁酸萘酚酯溶液、重氮盐、基础缓冲液和复染液，所述固定液为含有乙醇、甲醛、海藻糖、海藻酸钠和多元醇的缓冲液。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述固定液中乙醇的体积百分比浓度为15～70％、甲醛的体积百分比浓度为0.3～2.0％，海藻糖的质量体积百分比浓度为2.0～6.0％、海藻酸钠的质量体积百分比浓度为0.01～2.0％、多元醇体积百分比浓度为0.5～4.0％。

3.根据权利要求1或2所述试剂盒，其特征在于，所述多元醇为甘油。

4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为2-吗啉代乙磺酸缓冲液、1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液中一种。

5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述缓冲液浓度为0.005～0.1M，pH为6.5～7.5。

6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述基础缓冲液包含泊洛沙姆407。

7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述基础缓冲液为2-吗啉代乙磺酸、1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、哌嗪-1,4-二乙磺酸、3-(N-吗啉基)丙磺酸、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液之一。

8.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述泊洛沙姆407在基础缓冲液中的质量体积百分比浓度为0.001～1.0％。

9.根据权利要求根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述基础缓冲液浓度为0.01～0.2M，pH为6.0～7.0。

10.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述重氮盐选自坚牢紫GBC、坚牢蓝B中的一种。

11.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述复染液选自中性红、甲基绿、苏木素、核固红、沙黄中的一种。