CN112798385B - 一种环保苏木素染色液、巴氏染色液及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及细胞染色领域，具体公开了一种环保苏木素染色液、巴氏染色液及其制备方法与应用。其中，环保苏木素染色液包括以下重量份的原料：苏木素2‑3g/L、95％乙醇100‑125mL/L、丙三醇50‑100 mL/L、乙二醇100‑125 mL/L、硫酸铝钾10‑17g/L、碘酸钠0.2‑0.3g/L、柠檬酸1‑2g/L和水；其制备方法为：将苏木素加入95％乙醇、丙三醇和乙二醇的混合溶液中，搅拌混匀得到苏木素酒精液；将硫酸铝钾加水搅拌溶解得到硫酸铝钾溶液；将苏木素酒精液加入硫酸铝钾溶液中，并加入碘酸钠和柠檬酸，搅拌混匀后加水得到环保苏木素染色液。本申请的环保苏木素染色液可用于对分泌物、体液、体腔、体表脱落细胞涂片进行染色，具有减小巴氏染色试剂对人体造成危害的目的，具有环保、安全的优点。
Description
技术领域
本申请涉及细胞染色领域，更具体地说，它涉及一种环保苏木素染色液、巴氏染色液及其制备方法与应用。
背景技术
巴氏(Papanicolaou)染色法是一种经典的细胞化学染色方法，广泛应用于细胞脱落学、病理学等领域。巴氏染色法不但具有显示细胞核结构清晰、分色明显、透明度好、胞浆受色鲜艳等特点，而且所染标本不易脱色，可长久保存。巴氏染色法是脱落细胞染色中最好的染色方法，适用于妇科液基细胞学涂片染色，如筛查宫颈癌和癌前病变，也适用于胸水、腹水、痰液等非妇科细胞样本的染色。
传统的巴氏染色液成分复杂，包括多种浓度梯度酒精，如75％酒精、85％酒精、95％酒精，还包括无水乙醇、苏木素染色液、盐酸乙醇、碳酸锂饱和液(或3％氨水)、氧化汞、橙黄G6、EA50、二甲苯、磷钨酸和乙酸等。
其中，苏木素是对细胞核进行染色的主要物质，但是苏木素本身并不具备染色的能力。通过在苏木素中添加氧化汞，苏木素能够转变为具备发色团和助色团的苏木红，苏木红与金属媒染剂结合成带正电荷的色精，色精再与带负电荷的细胞核相结合，从而实现苏木素的染色功能。
然而，氧化汞是一种剧毒、有刺激性的重金属，如果操作人员长期进行巴氏染色操作，会不可避免的接触到这些有毒有害物质，长期以往会对人体造成危害。
发明内容
为了减小巴氏染色试剂对人体造成的危害，本申请提供一种环保苏木素染色液、巴氏染色液及其制备方法与应用。
第一方面，本申请提供一种环保苏木素染色液，采用如下的技术方案：
一种环保苏木素染色液，包括以下重量份的原料：
苏木素 2-3g/L
95％乙醇 100-125mL/L
丙三醇 50-100mL/L
乙二醇 100-125mL/L
硫酸铝钾 10-17g/L
碘酸钠 0.2-0.3g/L
柠檬酸 1-2g/L；
还包括水。
通过采用上述技术方案，本申请通过苏木素、95％乙醇、丙三醇、乙二醇、硫酸铝钾、碘酸钠、柠檬酸和水的相互配合，得到一种全新的环保苏木素染色液。本申请通过添加碘酸钠等原料对苏木素进行人工氧化，使苏木素发生氧化作用脱去两个氢原子而转变为苏木红，从而为苏木素的染色作用提供物质基础。可见，本申请无需使用氧化汞也能够实现苏木素的染色功能，而且各种原料均为无毒无害物质，大大减少了危化品及有毒重金属对人体造成的危害，达到减小巴氏染色试剂对人体造成危害的目的，具有环保、安全的效果。
丙三醇使人工氧化后的苏木素在使用过程中能够自然氧化，持续的补充发色团和助色团，以达到相对稳定的染色环境。
丙三醇和乙二醇还能够将95％乙醇包裹，抑制95％乙醇挥发，使苏木素被氧化后能够更好的溶解于无水乙醇，从而更好的对细胞进行染色，具有提升细胞染色效果的效果。
硫酸铝钾作为媒染剂，与苏木素被氧化后产生的苏木红结合，再与细胞核结合，从而将细胞核与苏木红结合，进而将细胞核染色。
优选的，所述环保苏木素染色液包括以下重量份的原料：
苏木素 2.2-2.8g/L
95％乙醇 105-115mL/L
丙三醇 70-90mL/L
乙二醇 105-115mL/L
硫酸铝钾 12-16g/L
碘酸钠 0.2-0.3g/L
柠檬酸 1.3-1.8g/L；
还包括水。
第二方面，本申请提供一种巴氏染色液，采用如下的技术方案：
一种巴氏染色液，包括上述方案中所述的一种环保苏木素染色液，还包括复合脱水固定酒精、复合缓冲液和复合EA染色液。
通过采用上述技术方案，经过测试，采用本申请的巴氏染色液对细胞进行染色，染色效果好，能够清晰的显示细胞的结构，而且不易脱色，有利于长久保存。
优选的，所述复合脱水固定酒精包括无水乙醇700-800mL/L和200-300mL/L异丙醇。
通过采用上述技术方案，复合脱水固定酒精中的无水乙醇作为脱水剂，高浓度的乙醇能够对细胞起到脱水、固定的作用，使细胞的环境与组织相仿，有利于细胞的着色。无水乙醇代替了传统巴氏染色固定步骤中75％、85％、95％、无水乙醇梯度的酒精，并且代替了透明步骤中的二甲苯，减少了试剂的种类，试剂配制更加简单，染色操作更加方便，同时不会对染色效果造成影响。
异丙醇与无水乙醇之间存在协同作用，能够增加无水乙醇的脱水及透明作用，从而使染色效果更好。
优选的，所述复合缓冲液包括TRIS 1-4g/L、盐酸0.1-2mL/L、苯甲酸钾0.5-1g/L和水。
通过采用上述技术方案，TRIS、盐酸、苯甲酸钾和水配制而成的复合缓冲液能够代替传统巴氏染色试剂中的盐酸乙醇、碳酸锂饱和液(或3％氨水)进行分化和蓝化，能够减少使用碳酸锂饱和液或氨水等危险性物质，试剂配制和染色操作均更加安全，同时能够保证染色效果。
优选的，所述复合EA染色液包括亮绿0.15-0.4g/L、水溶性伊红3-5g/L、甲醇200-300mL/L、草酸铵3-5g/L、橙黄G 0.05-0.1g/L、无水乙醇450-600mL/L和水。
通过采用上述技术方案，亮绿、水溶性伊红、甲醇、草酸铵、橙黄G、无水乙醇和水配制而成的复合EA染色液用于胞浆染色，其无需使用重金属磷钨酸和刺激性挥发物质乙酸也能达到良好的染色效果，进一步提高巴氏染色液的环保性能和安全性能。
优选的，所述复合脱水固定酒精和复合EA染色液还包括N-甲基吡咯酮烷。
通过采用上述技术方案，N-甲基吡咯酮烷具有减少固定收缩同时包裹抑制挥发的作用，具有增强固定、透明以及胞浆染色的作用，使细胞的染色效果更加突出。
第三方面，本申请提供一种巴氏染色液的制备方法，采用如下的技术方案：
一种巴氏染色液的制备方法，按照处理工序依次按照处理工序依次包括以下步骤：
S1：将苏木素加入95％乙醇、丙三醇和乙二醇的混合溶液中，搅拌混匀得到苏木素酒精液；将硫酸铝钾加水搅拌溶解得到硫酸铝钾溶液；将苏木素酒精液加入硫酸铝钾溶液中，并加入碘酸钠和柠檬酸，搅拌混匀后加水得到环保苏木素染色液；
S2：将无水乙醇、N-甲基吡咯酮烷和异丙醇混合，搅拌混匀得到复合脱水固定酒精；
S3：将TRIS和苯甲酸钾加入盐酸，搅拌混匀后再加水得到复合缓冲液；
S4：将亮绿、水溶性伊红、草酸铵、橙黄G加入甲醇、N-甲基吡咯酮烷和无水乙醇的混合溶液中，搅拌混匀后加水得到复合EA染色液。
第三方面，本申请提供一种巴氏染色液的应用，采用如下的技术方案：
一种巴氏染色液的应用，所述巴氏染色液应用于分泌物、体液、体腔、体表脱落细胞涂片的染色。
通过采用上述技术方案，采用本申请的巴氏染色液对细胞进行染色，不仅对人体危害小，而且得到的细胞结构清晰可见，更加容易辨认，方便观察与评价，并且不易脱色，能够应用于临床病理学辅助诊断，有助于提高检出率，降低漏诊率和误诊率，还有助于样本的保存留底。
优选的，所述巴氏染色液的应用按照处理工序依次包括以下步骤：
T1：复合脱水固定酒精固定；
T2：复合缓冲液冲洗；
T3：环保苏木素染色液染色；
T4：复合缓冲液冲洗；
T5：复合EA染色液染色；
T6：复合脱水固定酒精脱色脱水透明；
T7：封片。
通过采用上述技术方案，本申请的巴氏染色液的染色方法，包括固定、冲洗、细胞核染色、冲洗、胞浆染色、透明和封片七个步骤，相比传统巴氏染色将进二十个步骤来说大大的优化精简了操作步骤，使得染色操作更加简便，操作难度更小，染色周期更短、效率更高，扩大了巴氏染色液的使用范围，适合大力推广。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请无需使用氧化汞也能够实现苏木素的染色功能，而且原料均为无毒无害物质，大大减少了危化品及有毒重金属对人体造成的危害，达到减小巴氏染色试剂对人体造成危害的目的，具有环保、安全的效果。
2、本申请的巴氏染色方法结果易掌握，不但具有显示细胞核结构清晰、分色明显、透明度好、胞浆受色鲜艳等特点，而且所染标本不易脱色，可长久保存。
3、本申请的巴氏染色液的试剂配制方便简单，应用操作简单，优化精简了巴氏染色的操作步骤，降低了成本，并有效延长了检测结果的稳定性和长效性。
附图说明
图1是实施例11的涂片中细胞染色后的镜下放大图；
图2是实施例12的涂片中细胞染色后的镜下放大图；
图3是实施例14的涂片中细胞染色后的镜下放大图。
具体实施方式
以下结合从实施例对本申请作进一步详细说明。
巴氏染色法是一种经典的细胞化学染色方法，广泛应用于细胞脱落学、病理学等领域。为了实现巴氏染色液中苏木素对细胞的染色，不可避免的引入了氧化汞。然而，氧化汞是一种剧毒、有刺激性的重金属，长期接触很容易对人体造成危害。
为了解决该问题，本申请人对巴氏染色液的成分进行了大量研究，以图找到能够减小巴氏染色试剂对人体造成危害的方法。结果，本申请人发现，使用碘酸钠等原料对苏木素进行人工氧化，就能够减小巴氏染色试剂对人体造成的危害，从而成功解决了本申请所要解决的技术问题。本申请正是基于上述发现做出的。
以具体实施例作具体说明，实施例中的原料均由市场购买获得。
实施例
实施例1
实施例1公开一种环保苏木素染色液，包括以下重量份的原料：
苏木素 2g
95％乙醇 100mL
丙三醇 50mL
乙二醇 100mL
硫酸铝钾 10g
碘酸钠 0.2g
柠檬酸 1g；
还包括水，加水至体系为1000mL。
实施例2
实施例2公开一种巴氏染色液，包括实施例1的环保苏木素染色液，还包括复合脱水固定酒精、复合缓冲液和复合EA染色液，原料及原料的重量见表1。
实施例2还公开一种巴氏染色液的制备方法，按照处理工序依次包括以下步骤：
S1：将苏木素加入95％乙醇、丙三醇和乙二醇的混合溶液中，搅拌混匀得到苏木素酒精液；将硫酸铝钾加水搅拌溶解得到硫酸铝钾溶液；将苏木素酒精液加入硫酸铝钾溶液中，并加入碘酸钠和柠檬酸，搅拌混匀后加水得到环保苏木素染色液；
S2：将无水乙醇和异丙醇混合，搅拌混匀得到复合脱水固定酒精；
S3：将TRIS和苯甲酸钾加入盐酸，搅拌混匀后再加水得到复合缓冲液；
S4：将亮绿、水溶性伊红、草酸铵、橙黄G加入甲醇和无水乙醇的混合溶液中，搅拌混匀后加水得到复合EA染色液。
实施例3-9
实施例3-9均公开一种巴氏染色液，原料及原料的重量见表1。
实施例3-9还公开一种巴氏染色液的制备方法，步骤与实施例2相同。其中，实施例7-9中，S2：将无水乙醇、N-甲基吡咯酮烷和异丙醇混合，搅拌混匀得到复合脱水固定酒精；S4：将亮绿、水溶性伊红、草酸铵、橙黄G加入甲醇、N-甲基吡咯酮烷、无水乙醇和水的混合溶液中，搅拌混匀得到复合EA染色液。
表1实施例2-9的巴氏染色液的原料及原料的重量
实施例10-17
实施例10-17均公开一种巴氏染色液的应用，分别采用实施例2-9的巴氏染色液，应用于分泌物脱落细胞涂片的染色，按照处理工序依次包括以下步骤：
T1：将细胞涂片置于复合脱水固定酒精中固定15min；
T2：将细胞涂片用复合缓冲液冲洗20±10s；
T3：将细胞涂片置于环保苏木素染色液中染色4±1min；
T4：将细胞涂片用复合缓冲液冲洗2次，每次20±10s；
T5：将细胞涂片置于复合EA染色液中染色4±1min；
T6：将细胞涂片置于复合脱水固定酒精中脱色脱水透明3次，每次1.5±0.5s；
T7：采用中性树脂对细胞涂片进行封片。
对比例
对比例1
对比例1公开一种巴氏染色液，与实施例2的不同之处在于，环保苏木素染色液不添加丙三醇和乙二醇。
对比例2
对比例2公开一种巴氏染色液，与实施例2的不同之处在于，复合脱水固定酒精不添加异丙醇。
对比例3
对比例3公开一种巴氏染色液，与实施例2的不同之处在于，原料的用量不同，原料及原料的重量见表2。
对比例4
对比例4公开一种巴氏染色液，与实施例2的不同之处在于，原料的用量不同，原料及原料的重量见表2。
表2对比例1-4的巴氏染色液的原料及原料的重量
对比例5-8
对比例5-8均公开一种巴氏染色液的应用，与实施例10的不同之处在于，分别采用对比例1-4的巴氏染色液。
染色性能试验
准备若干例2020年1-6月期间在深圳市多家医院检验科和体检科收集的宫颈分泌物样本，将样本的脱落细胞制出120个涂片。分别通过实施例10-17、对比例5-8的巴氏染色液的应用，对涂片进行染色，每个实施例和对比例各染10个涂片，观察并统计各实施例和对比例中细胞核结构清晰、分色明显、透明度好、胞浆受色鲜艳的涂片数量，测试结果见表3。
表3各实施例和对比例的染色性能试验结果
通过表3可以看出，实施例10-14的50个涂片中有47个涂片的细胞染色后均细胞核结构清晰、分色明显、透明度好、胞浆受色鲜艳。如图1-3所示，将涂片置于显微镜下观察，细胞结构清晰、均匀、形态完整，细胞核特异性的呈蓝紫色，胞浆因不同成分或物质而呈红色、绿色、橙黄色，细胞核和胞浆颜色分明，无背景着色，细胞结构可明显区分。其余3个涂片的细胞均只有单方面的缺陷。通过上述结果与分析，表明本申请的巴氏染色液具有非常优异的染色性能，其是环保苏木素染色液、复合脱水固定酒精、复合缓冲液和复合EA染色液相互配合、相互作用的结果。
从环保苏木素染色液、复合脱水固定酒精、复合缓冲液和复合EA染色液的原料来看，均没有有毒、有害、刺激性、挥发性物质的存在，大大减少了危化品及有毒重金属对人体造成的危害，达到减小巴氏染色试剂对人体造成危害的目的，具有环保、安全的效果，相比传统的巴氏染色液取得了很大的进步。
从巴氏染色的操作步骤来看，巴氏染色液的试剂配制方便简单，应用操作简单，优化精简了巴氏染色的操作步骤，降低了成本，并有效延长了检测结果的稳定性。
其中，染色性能试验中巴氏染色液应用于宫颈分泌物脱落细胞，在实际应用中，巴氏染色液还可以用于对体液、体腔、体表等脱落细胞进行染色，辅助临床病理学诊断，助力临床医学的发展和进步。
对比实施例10-14与实施例15-17，实施例15-17的巴氏染色液在原料中添加了N-甲基吡咯酮烷，相应的，实施例15-17的涂片中细胞全部都细胞核结构清晰、分色明显、透明度好、胞浆受色鲜艳，检测结果稳定，因此证明了N-甲基吡咯酮烷能够有效的提升细胞的染色效果，保障细胞的染色质量，有助于降低漏检率。
对比实施例10-14与对比例5，对比例5的巴氏染色液省去了丙三醇和乙二醇，导致细胞的染色效果大幅度降低，特别是细胞核不清晰和分色不明显的涂片数量仅有4个。可见丙三醇和乙二醇是影响细胞整体染色效果的重要因素之一，丙三醇和乙二醇能够大大的提高细胞的染色效果，两者共同协同发挥作用，是本申请的巴氏染色液中不可缺少的原料。
对比实施例10-14与对比例6，对比例6的巴氏染色液省去了异丙醇，使无水乙醇的作用发挥不明显，从而导致细胞脱水和透明的效果较不佳，仅有6个涂片的透明度保持良好，因此可以看出异丙醇与无水乙醇之间存在协同作用，两者协同提升细胞的染色效果。
对比实施例10-14与对比例7，对比例7的巴氏染色液中乙醇和乙二醇的重量均为130mL，虽然相比实施例10-14的重量变多了，但是细胞的染色效果却变差了，个别细胞的细胞核结构不清晰，细胞核与胞浆界线模糊，说明乙醇和乙二醇的添加量也会影响细胞的染色效果，只有在特定范围内的添加量才会对染色效果产生正向影响。
对比实施例10-14与对比例8，对比例8的巴氏染色液中乙醇和乙二醇的重量分别为100mL和110mL，虽然乙醇和乙二醇的重量均没有过量，但是细胞的染色效果仍然变差了。通过分析发现，实施例10-14中乙醇和乙二醇的重量比均为1：1，而对比例8中乙醇和乙二醇的重量比为1：1.1，因此可以得出，乙醇和乙二醇的重量比也会影响细胞的染色效果，当两者的比例为1:1时，细胞的染色效果更好。同时，通过对比对比例7和对比例8还可以发现，乙醇和乙二醇的重量比相对乙醇和乙二醇的添加量对细胞染色效果的影响更大。
保存性能试验
将染色性能试验后的实施例10-17、对比例5-8的各10个涂片均置于-20℃保存12个月，观察并统计各实施例和对比例涂片的脱色情况，测试结果见表4。
表4各实施例和对比例的保存性能试验结果
通过表4可以看出，与其他实施例和对比例相比，实施例15-17均未出现缺少原料、原料超量或者原料用量不成比例的现象，而实施例15-17的涂片均未脱色和脱色不明显，因此可以很好的证明本申请巴氏染色液的配方是一个完整的配方，涂片良好的保存性能是所有原料之间相互配合的结果，这样的涂片有利于样本的长期保存。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (3)
1.一种巴氏染色液，其特征在于：包括苏木素染色液、复合脱水固定酒精、复合缓冲液和复合EA染色液；所述苏木素染色液包括以下重量份的原料：
苏木素2-3g/L
95％乙醇100-125mL/L
丙三醇50-100 mL/L
乙二醇100-125 mL/L
硫酸铝钾10-17g/L
碘酸钠0.2-0.3g/L
柠檬酸1-2g/L；
还包括水；所述复合脱水固定酒精包括无水乙醇700-800mL/L和200-300mL/L异丙醇；所述复合缓冲液包括TRIS 1-4g/L、盐酸0.1-2mL/L、苯甲酸钾0.5-1g/L和水；所述复合EA染色液包括亮绿0.15-0.4g/L、水溶性伊红3-5g/L、甲醇200-300mL/L、草酸铵3-5g/L、橙黄G0.05-0.1g/L、无水乙醇450-600mL/L和水；所述复合脱水固定酒精和复合EA染色液还包括N-甲基吡咯烷酮。
2.根据权利要求1所述的一种巴氏染色液，其特征在于：所述苏木素染色液包括以下重量份的原料：
苏木素2.2-2.8g/L
95％乙醇105-115mL/L
丙三醇70-90 mL/L
乙二醇105-115 mL/L
硫酸铝钾12-16g/L
碘酸钠0.25-0.35g/L
柠檬酸1.3-1.8g/L；
还包括水。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的巴氏染色液的制备方法，其特征在于：按照处理工序依次包括以下步骤：
S1：将苏木素加入95％乙醇、丙三醇和乙二醇的混合溶液中，搅拌混匀得到苏木素酒精液；将硫酸铝钾加水搅拌溶解得到硫酸铝钾溶液；将苏木素酒精液加入硫酸铝钾溶液中，并加入碘酸钠和柠檬酸，搅拌混匀后加水得到苏木素染色液；
S2：将无水乙醇、N-甲基吡咯烷酮和异丙醇混合，搅拌混匀得到复合脱水固定酒精；
S3：将TRIS和苯甲酸钾加入盐酸，搅拌混匀后再加水得到复合缓冲液；
S4：将亮绿、水溶性伊红、草酸铵、橙黄G加入甲醇、N-甲基吡咯烷酮和无水乙醇的混合溶液中，搅拌混匀后加水得到复合EA染色液。
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