CN116413106A - 一种骨组织脱钙组合物及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种骨组织脱钙组合物及制备方法，包括以下原料成分：浓盐酸2‑4份、EDTA4‑6份、有机酸4‑8份、氯化钠4‑8份、甲醛8‑10份、表面活性剂0.1‑0.3份、复合脱钙剂1‑2份、Tris缓冲液6‑12份、PBS 61.6‑68.9份；有机酸包括冰醋酸、甲酸；表面活性剂包括TritonX‑100、CAB35、SDS；复合脱钙剂包括磷酸氢二钠、EDTA‑2Na、钙离子螯合剂。本发明骨组织脱钙组合物中盐酸的加入量比较低，但是脱钙效率良好。使用本发明得到的脱钙产物，不会导致免疫组化抗原破坏，染色效果很好。本发明骨组织脱钙组合物脱钙效率高，脱钙时间较快。
Description
技术领域
本发明涉及病理检测技术领域，具体涉及一种骨组织脱钙组合物及制备方法。
背景技术
骨组织标本是病理科常见标本之一，骨组织与其他组织相比最大的特点是细胞基质中有大量的钙盐沉积，从而使骨组织成为最坚硬的组织。随着骨及相关组织的医学研究和科学探索的持续深入，对于骨组织的病理鉴定需要日益增加，但是由于骨组织强度、硬度很高，在病理切片过程中不能直接切割，须脱钙软化后才能进行后续的病理检测实验，因此，对于骨组织脱钙的研究需求也在逐渐增大。
目前，已知的脱钙液配方功能较为单一，温和的EDTA脱钙液脱钙时间较长，对于含钙量高、结构坚硬的骨组织，脱钙时间长达一周以上；硝酸、盐酸等酸类脱钙液配方对于骨组织形态的破坏比较大，而且后期相关骨细胞的染色鉴定也存在较大问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种骨组织脱钙组合物，该骨组织脱钙组合物与现有技术相比，具有脱钙时间短，可以保持骨组织原有形态、细胞染色效果好等特点。
本发明方案为：
一种骨组织脱钙组合物，按重量份计，包括以下原料成分：
所述有机酸包括冰醋酸、甲酸中的至少一种；
所述表面活性剂包括TritonX-100、CAB35、SDS中的至少一种；表面活性剂TritonX-100、SDS、CAB35(椰油酰胺丙基甜菜碱)可以降低细胞膜厚度，改变细胞膜的通透性，一方面可以促使细胞内钙离子、钠离子等离子流出，加快脱钙速率，另一方面，可以使后续的生物学染色更加便捷。
所述复合脱钙剂包括磷酸氢二钠、EDTA-2Na、钙离子螯合剂，磷酸氢二钠、EDTA-2Na、钙离子螯合剂BAPTA的质量比为1：0.7-0.8：0.2-0.3。
磷酸氢二钠、EDTA-2Na、钙离子螯合剂BAPTA对于溶液中的钙、镁离子有着优异的螯合作用，与单一的螯合剂相比，本发明采用复合脱钙剂，螯合效率更高，可以更加快速降低溶液中钙、镁离子的浓度。
所述钙离子螯合剂BAPTA纯度为≥97％，采购于北京百奥莱博科技有限公司。
进一步的，所述表面活性剂为0.15份TritonX-100、0.15份CAB35。
进一步的，所述有机酸为冰醋酸2-4份、甲酸2-4份。
进一步的，所述复合脱钙剂还含有N,N-二乙基癸酰胺。N,N-二乙基癸酰胺可促进各组分快速渗透骨组织，提高脱钙效率。
进一步的，所述复合脱钙剂为磷酸氢二钠、EDTA-2Na、钙离子螯合剂BAPTA和N,N-二乙基癸酰胺按照质量比1：0.7-0.8：0.2-0.3：0.6-1复配而成。
进一步的，所述的骨组织脱钙组合物，按重量份计，包括以下原料成分：
所述有机酸为4份冰醋酸和4份甲酸；
所述表面活性剂为0.15份TritonX-100和0.15份CAB35；
所述复合脱钙剂为磷酸氢二钠、EDTA-2Na、钙离子螯合剂BAPTA按照1：0.7：0.3配比复配而成。
进一步的，所述的骨组织脱钙组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取PBS，加入Tris缓冲液，开始机械搅拌10min，搅拌机转速300转/min；
(2)依次加入氯化钠、复合脱钙剂，继续搅拌30min，搅拌机转速500转/min；
(3)继续加入EDTA、有机酸、浓盐酸、甲醛、表面活性剂，机械搅拌30min，搅拌机转速300转/min，待完全溶解后，即得骨组织脱钙组合物。
本发明的脱钙机理：盐酸、EDTA、甲酸等与骨组织沉积钙盐发生反应，从而使骨组织中的沉积钙盐形成Ca2+，溶液中的Ca2+浓度逐渐增大，复合脱钙剂与Ca2+发生螯合反应，快速降低溶液中Ca2+浓度，进而促进酸性物质与沉积钙盐进一步反应，如此反复，最终使骨组织达到可以切割的形态。
在本发明中，采用Tris缓冲液和1×PBS缓冲液作为溶剂，并在溶液中加入氯化钠，可以使本发明所述脱钙组合物的渗透压保持均衡，在酸性较强的情况下，仍然能够维持骨组织的环境稳定，与单纯使用去离子水作为溶剂相比，骨组织环境更加稳定、温和，对于细胞形态和细胞核结构有良好的保护作用。
以盐酸与甲酸、冰醋酸复合酸体系作为酸剂，甲酸、冰醋酸等单体有机酸虽然酸性比较弱，与沉积钙盐的反应速率较慢，但具有很强的穿透性，可以进入深层骨组织，为强酸进入打开通道，从而加快整个骨组织的脱钙反应。而且，与现有技术相比，本发明中盐酸的加入量比较低，只有传统盐酸脱钙液的一半左右，但是脱钙效率与传统盐酸脱钙液相当。使用传统盐酸脱钙液会导致免疫组化抗原破坏、HE染色细胞核发红等现象，使用本发明得到的脱钙产物，不会导致免疫组化抗原破坏，HE染色效果很好，而且更加便捷。
在本体系中，复合脱钙剂可以与表面活性剂相互配合，加快细胞内钙离子流出，使后期染色更加便捷；复合脱钙剂与酸体系配合，加快脱钙速率；这是本发明的创新之处。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明骨组织脱钙组合物中盐酸的加入量比较低，只有传统盐酸脱钙液的一半左右，但是脱钙效率与传统盐酸脱钙液相当。
使用本发明得到的脱钙产物，不会导致免疫组化抗原破坏，HE染色效果很好，而且更加便捷。
本发明骨组织脱钙组合物操作简单、价廉、脱钙效率高，脱钙时间较快。
附图说明
图1脱钙液脱钙后的家兔肩胛骨组织横切面HE染色(×100)
图2脱钙液脱钙后周围骨骼肌肌肉(肩胛冈上肌、冈下肌)组织横切面HE染色(×100)
图3脱钙液脱钙后软骨HE染色(×400)
图4脱钙后骨小梁HE染色(×100)
图5脱钙后骨组织韧带和骨骼肌天狼猩红染色(×100)
图6脱钙后组织的III型胶原免疫组化(×100)
图7骨组织脱钙后透明软骨二型胶原免疫组化(×400)
图8脱钙后肩胛骨组织一型胶原免疫组化(×100)
图9脱钙后肩胛骨HE染色(×100)
图10脱钙后骨外软组织HE染色(×100)
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员更好的理解本发明技术内容，下面结合具体实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1
骨组织脱钙组合物由以下重量组分原料组成：
所述浓盐酸质量分数为36％-38％，分析纯，采购于西陇化学；
所述有机酸为冰醋酸4份、甲酸2份；
所述表面活性剂为TritonX-100；
所述复合脱钙剂为磷酸氢二钠、EDTA-2Na、钙离子螯合剂BAPTA按照质量比1：0.8：0.2配比复配而成；
所述脱钙组合物的制备工艺包括以下步骤：
1.称取PBS，加入Tris缓冲液，开始机械搅拌10min，搅拌机转速300转/min；
2.依次加入氯化钠、复合脱钙剂，继续搅拌30min，搅拌机转速500转/min；
3.继续加入EDTA、有机酸、浓盐酸、甲醛、表面活性剂，机械搅拌30min，搅拌机转速300转/min，待完全溶解后，即得到所需骨组织脱钙组合物。
实施例2
骨组织脱钙组合物由以下重量组分原料组成：
所述浓盐酸质量分数为36％-38％，分析纯，采购于西陇化学；
所述有机酸为甲酸；
所述表面活性剂为SDS 0.1份、TritonX-100 0.1份；
所述复合脱钙剂为磷酸氢二钠、EDTA-2Na、钙离子螯合剂BAPTA按照质量比1：0.8：0.2配比复配而成；
所述脱钙组合物的制备工艺包括以下步骤：
1.称取PBS，加入Tris缓冲液，开始机械搅拌10min，搅拌机转速300转/min；
2.依次加入氯化钠、复合脱钙剂，继续搅拌30min，搅拌机转速500转/min；
3.继续加入EDTA、有机酸、浓盐酸、甲醛、表面活性剂，机械搅拌30min，搅拌机转速300转/min，待完全溶解后，即得到所需骨组织脱钙组合物。
实施例3
骨组织脱钙组合物由以下重量组分原料组成：
所述浓盐酸质量分数为36％-38％，分析纯，采购于西陇化学；
所述有机酸为冰醋酸；
所述表面活性剂为SDS；
所述复合脱钙剂为磷酸氢二钠、EDTA-2Na、钙离子螯合剂BAPTA按照质量比1：0.8：0.2配比复配而成；
所述脱钙组合物的制备工艺包括以下步骤：
1.称取PBS，加入Tris缓冲液，开始机械搅拌10min，搅拌机转速300转/min；
2.依次加入氯化钠、复合脱钙剂，继续搅拌30min，搅拌机转速500转/min；
3.继续加入EDTA、有机酸、浓盐酸、甲醛、表面活性剂，机械搅拌30min，搅拌机转速300转/min，待完全溶解后，即得到所需骨组织脱钙组合物。
实施例4
骨组织脱钙组合物由以下重量组分原料组成：
所述浓盐酸质量分数为36％-38％，分析纯，采购于西陇化学；
所述有机酸为4份冰醋酸、4份甲酸；
所述表面活性剂为0.15份TritonX-100、0.15份CAB35；
所述复合脱钙剂为磷酸氢二钠、EDTA-2Na、钙离子螯合剂BAPTA按照质量比1：0.7：0.3配比复配而成。
所述脱钙组合物的制备工艺包括以下步骤：
1.称取PBS，加入Tris缓冲液，开始机械搅拌10min，搅拌机转速300转/min；
2.依次加入氯化钠、复合脱钙剂，继续搅拌30min，搅拌机转速500转/min；
3.继续加入EDTA、有机酸、浓盐酸、甲醛、表面活性剂，机械搅拌30min，搅拌机转速300转/min，待完全溶解后，即得到所需骨组织脱钙组合物。
实施例5
常规盐酸骨组织脱钙液由以下重量份原料组成：
实施例6
常规盐酸骨组织脱钙液由以下重量份原料组成：
EDTA-2Na 10份
甲醛 10份
纯水 80份
上述实施例中，实施例1-4为本发明所述的组织脱钙组合物，实施例5、实施例6为对照脱钙液。
本发明的测试以新西兰大白兔肩胛骨为实验对象，其他动物样本可根据样本的坚硬程度以及组织样本的大小，参考本试验方法进行时间以及用量上的调整。
测试过程包括以下步骤：
1.将待脱钙组织样本放置于4％甲醛PBS的液体中固定10h；
2.将固定好的组织样本放置于本发明所述的脱钙液组合物中进行脱钙，等到骨组织可以钢针扎、刀片切割无阻力，即达到所需的脱钙效果；
3.采用冰冻切片或石蜡切片；
4.采用HE、天狼猩红染色；
5.免疫组化分析；
性能检测结果：
表1不同实施例的脱钙时间
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | |
| 脱钙时间(h) | 10 | 8.5 | 8 | 7.5 | 8 | 160 |
注：10次平行试验取平均值
苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色；天狼猩红染色液可将胶原染成红色。
本发明图1-8为采用实施例4所述脱钙组合物进行脱钙后的检测图片，图9、图10为采用实施例5脱钙后的图片。
图1、图2为脱钙液脱钙后的家兔肩胛骨及其周围骨骼肌肌肉(肩胛冈上肌、冈下肌)组织横切面HE染色，如图所示细胞核在苏木素的作用下呈现结构和边缘清晰的蓝紫色，与伊红染色的粉红色呈现鲜明对比组织形态较为清晰。由此可以证明在本发明所述脱钙液快速脱钙后，细胞的酸碱性没有明显破坏，组织结构和纤维走向也保持着较为鲜活的状态。
图3为软骨脱钙后HE染色，从图中可以看到，脱钙后软骨细胞结构清晰，细胞外基质结构完整。
图4为脱钙后骨小梁HE染色，从图中可以看到，网状结构组织完整，细胞结构清晰可见。
图5为脱钙后骨组织韧带和骨骼肌天狼猩红染色，狼猩红染色可将胶原染为红色，从图中可以看到，组织结构清晰，由此可以证明在经过本发明脱钙液处理后，细胞或组织呈现的蛋白没有被破坏。
图6脱钙后组织的III型胶原免疫组化，组织可以与III型胶原抗体特异性结合，使得阳性部分呈现棕色，从图中可以看到，组织结构清晰，经过脱钙后组织依然保有较好的III型胶原的抗体活性。
图7骨组织脱钙后透明软骨Ⅱ型胶原免疫组化，图中细胞核清晰，细胞外基质组织完整，在透明软骨细胞内的Ⅱ型胶原分布清晰，脱钙后组织依然保有较好的Ⅱ型胶原的抗性活性。
图8脱钙后肩胛骨组织I型胶原免疫组化，组织可以与一型胶原抗体特异性结合，使得阳性部分呈现棕色，从图中可以看到，组织结构清晰，经过脱钙后，组织依然保有较好的I型胶原的抗体活性。
图9为快速脱钙后的肩胛骨HE染色，从图中可以看到，细胞核发红，染色效果很差。
图10为快速脱钙后周围组织HE染色，从图中可以看到，组织结构混乱，细胞外基质结构基本被破坏。
实施例7
骨组织脱钙组合物由以下重量组分原料组成：
浓盐酸 3份
EDTA 4份
所述浓盐酸质量分数为36％-38％，分析纯，采购于西陇化学；
所述有机酸为冰醋酸4份、甲酸4份；
所述表面活性剂为TritonX-100；
所述复合脱钙剂为磷酸氢二钠、EDTA-2Na、钙离子螯合剂BAPTA按照质量比1：0.7：0.3配比复配而成。
所述脱钙组合物的制备工艺包括以下步骤：
1.称取PBS，加入Tris缓冲液，开始机械搅拌10min，搅拌机转速300转/min；
2.依次加入氯化钠、复合脱钙剂，继续搅拌30min，搅拌机转速500转/min；
3.继续加入EDTA、有机酸、浓盐酸、甲醛、表面活性剂，机械搅拌30min，搅拌机转速300转/min，待完全溶解后，即得到所需骨组织脱钙组合物。
实施例8
骨组织脱钙组合物由以下重量组分原料组成：
所述浓盐酸质量分数为36％-38％，分析纯，采购于西陇化学；
所述有机酸为冰醋酸4份、甲酸4份；
所述表面活性剂为CAB35；
所述复合脱钙剂为磷酸氢二钠、EDTA-2Na、钙离子螯合剂BAPTA按照质量比1：0.7：0.3配比复配而成。
所述脱钙组合物的制备工艺包括以下步骤：
1.称取PBS，加入Tris缓冲液，开始机械搅拌10min，搅拌机转速300转/min；
2.依次加入氯化钠、复合脱钙剂，继续搅拌30min，搅拌机转速500转/min；
3.继续加入EDTA、有机酸、浓盐酸、甲醛、表面活性剂，机械搅拌30min，搅拌机转速300转/min，待完全溶解后，即得到所需骨组织脱钙组合物。
实施例9
骨组织脱钙组合物由以下重量组分原料组成：
所述浓盐酸质量分数为36％-38％，分析纯，采购于西陇化学；
所述有机酸为冰醋酸4份、甲酸4份；
所述表面活性剂为0.15份TritonX-100、0.15份CAB35；
所述复合脱钙剂为磷酸氢二钠、EDTA-2Na、钙离子螯合剂BAPTA、N,N-二乙基癸酰胺按照质量比1：0.7：0.3：1配比复配而成。
所述脱钙组合物的制备工艺包括以下步骤：
1.称取PBS，加入Tris缓冲液，开始机械搅拌10min，搅拌机转速300转/min；
2.依次加入氯化钠、复合脱钙剂，继续搅拌30min，搅拌机转速500转/min；
3.继续加入EDTA、有机酸、浓盐酸、甲醛、表面活性剂，机械搅拌30min，搅拌机转速300转/min，待完全溶解后，即得到所需骨组织脱钙组合物。
实施例10
骨组织脱钙组合物由以下重量组分原料组成：
所述浓盐酸质量分数为36％-38％，分析纯，采购于西陇化学；
所述有机酸为冰醋酸4份、甲酸4份；
所述表面活性剂为0.15份TritonX-100、0.15份CAB35；
所述复合脱钙剂为磷酸氢二钠、EDTA-2Na、钙离子螯合剂BAPTA、N,N-二乙基癸酰胺按照质量比1：0.7：0.3：0.6配比复配而成。
所述脱钙组合物的制备工艺包括以下步骤：
1.称取PBS，加入Tris缓冲液，开始机械搅拌10min，搅拌机转速300转/min；
2.依次加入氯化钠、复合脱钙剂，继续搅拌30min，搅拌机转速500转/min；
3.继续加入EDTA、有机酸、浓盐酸、甲醛、表面活性剂，机械搅拌30min，搅拌机转速300转/min，待完全溶解后，即得到所需骨组织脱钙组合物。
统计实施例7～10的脱钙时间，结果如表2所示。
表2不同实施例的脱钙时间
| 实施例7 | 实施例8 | 实施例9 | 实施例10 | |
| 脱钙时间(h) | 9.5 | 8.3 | 5 | 5 |
以上实施例7-实施例10脱钙后的染色效果与实施例4相似，但脱钙时间与实施例4相比，有显著差异。对比实施例4、实施例7和实施例8可知，选择TritonX-100和CAB35复配作为表面活性剂，可有效缩短脱钙时间，提高脱钙效率。对比实施例4、实施例9和实施例10可知，复合脱钙剂中添加N,N-二乙基癸酰胺可进一步显著提高脱钙效率，脱钙时间缩短至5h。
以上所述仅为本发明的部分实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种骨组织脱钙组合物，其特征在于，按重量份计，包括以下原料成分：
所述有机酸包括冰醋酸、甲酸中的至少一种；
所述表面活性剂包括TritonX-100、CAB35、SDS中的至少一种；
所述复合脱钙剂包括磷酸氢二钠、EDTA-2Na、钙离子螯合剂BAPTA，磷酸氢二钠、EDTA-2Na、钙离子螯合剂BAPTA质量比为1：0.7-0.8：0.2-0.3。
2.根据权利要求1所述的骨组织脱钙组合物，其特征在于，所述表面活性剂为0.15份TritonX-100、0.15份CAB35。
3.根据权利要求1所述的骨组织脱钙组合物，其特征在于，所述有机酸为冰醋酸2-4份、甲酸2-4份。
4.根据权利要求1所述的骨组织脱钙组合物，其特征在于，所述复合脱钙剂还含有N,N-二乙基癸酰胺。
5.根据权利要求1所述的骨组织脱钙组合物，其特征在于，所述复合脱钙剂为磷酸氢二钠、EDTA-2Na、钙离子螯合剂BAPTA和N,N-二乙基癸酰胺按照1：0.7-0.8：0.2-0.3：0.6-1质量比复配而成。
6.根据权利要求1所述的骨组织脱钙组合物，其特征在于，按重量份计，包括以下原料成分：
所述有机酸为4份冰醋酸和4份甲酸；
所述表面活性剂为0.15份TritonX-100和0.15份CAB35；
所述复合脱钙剂为磷酸氢二钠、EDTA-2Na、钙离子螯合剂BAPTA按照1：0.7：0.3配比复配而成。
7.权利要求1至权利要求6任一项所述的骨组织脱钙组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取PBS，加入Tris缓冲液，开始机械搅拌10min，搅拌机转速300转/min；
(2)依次加入氯化钠、复合脱钙剂，继续搅拌30min，搅拌机转速500转/min；
(3)继续加入EDTA、有机酸、浓盐酸、甲醛、表面活性剂，机械搅拌30min，搅拌机转速300转/min，待完全溶解后，即得骨组织脱钙组合物。
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|---|---|---|---|---|
| CN117582557A (zh) * | 2024-01-19 | 2024-02-23 | 四川恒普科技有限公司 | 脱矿骨纤维及其制备方法 |
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