CN113945440A - 一种巴氏染色试剂盒及其制备方法和染色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种巴氏染色试剂盒及其制备方法和染色方法。该试剂盒包括苏木素染色液、EA/OG染色液、缓冲液、清洗液；苏木精染色液包括苏木精、碘酸钠、硫酸铝、亚硫酸钠、乙醇、乙二醇、丙三醇、乙酸、水；苏木素染色液pH值为2.0～3.0；EA/OG染色液包括橘黄G、磷钨酸、亮绿SF淡黄、水溶伊红、亚硫酸钠、乙醇、乙二醇、甲醇、异丙醇、乙酸、水；EA/OG染色液pH值为5.0～6.0；缓冲液pH值为6.8～7.2。本发明巴氏染色液染色效果均匀、细胞结构清晰、细胞着色鲜艳，易于临床上观察诊断，其配制方便，染色步骤简洁，效果稳定，细胞对比度清晰，使用寿命长。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种巴氏染色试剂盒及其制备方法和染色方法。
背景技术
巴氏染色是细胞学临床检验最基本的染色方法之一，不仅适用于妇科细胞学涂片染色如筛查宫颈癌和癌前病变，也适用于胸水、腹水、痰液、细针穿刺等非妇科细胞样本的染色，其染色效果鲜艳、透明性好以及核膜、核仁、染色质结构清晰。细胞中含有多种氨基酸，具有酸碱化学物质，且带有不同电荷，与巴氏染色液中的酸碱化学物质起化学反应，与巴氏染色液中不同电荷的染料结合，从而使分泌物中的脱落细胞染成不同的颜色为原理，用于脱落细胞涂片染色，方便观察诊断。
细胞核染色液主要为苏木素染液，细胞质染色液主要为橘黄G6染液、EA50染液或EA36染液。巴氏染色法将胞核染为深蓝色鳞状上皮底层、中层及表层角化前细胞胞质染绿色，表层不全角化细胞胞质染粉红色，完全角化细胞胞质呈桔黄色细菌灰色；滴虫：淡蓝灰色；黏液：淡蓝色或粉红色；中性粒细胞和淋巴细胞、吞噬细胞胞质均为蓝色；红细胞染粉红色；高分化鳞癌细胞可染成粉红色或桔黄色；腺癌胞质呈灰蓝色。
但传统的巴氏染色方法具有如下缺陷：
1)传统的巴氏染色时，染色细胞核的苏木素染色液中含有剧毒物质氧化汞，本发明采用环保无毒试剂配制。
2)传统的巴氏染色时，染色细胞质的染色液通常采用橘黄G6和EA50或EA36，染色时间长，染色程序繁琐。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种环保无毒快速的高清巴氏染色试剂盒及其制备方法和染色方法。本发明采用EA/OG组合型染色液为细胞质染色，染色液成分环保无毒，染色时间快速，制备成本低廉，染色程序简单，染色效果鲜亮，对比度清晰，适合自动化设备应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种巴氏染色液试剂盒，包括苏木素染色液、EA/OG染色液、缓冲液、清洗液；
苏木精染色液包括苏木精、碘酸钠、硫酸铝、亚硫酸钠、乙醇、乙二醇、丙三醇、乙酸、水；苏木素染色液的pH值为2.0～3.0；
EA/OG染色液包括橘黄G、磷钨酸、亮绿SF淡黄、水溶伊红、亚硫酸钠、乙醇、乙二醇、甲醇、异丙醇、乙酸、水；EA/OG染色液的pH值为5.0～6.0；
缓冲液包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、吐温20、苯氧乙醇、氢氧化钠、水；缓冲液的pH值为6.8～7.2。
本发明巴氏染色试剂盒中，苏木精染色液用于细胞核的染色，EA/OG染色液用于细胞质的染色，所述染色液对细胞核、细胞质的结构染色清晰、对比度明显，颜色鲜亮，便于临床检验医师做出诊断，清洗液、缓冲液作为染色过程必不可少的辅助试剂配合使用，能起到利于着色、缩短染色时间、使染色效果更佳清晰等重要作用。
进一步的，染色液经过严格过滤和保护剂亚硫酸钠的抗氧化作用，使设备在染色过程中不容易形成结晶性物质。
进一步的，乙酸和氢氧化钠调节pH，使苏木素染色液pH值在2.0～3.0之间，使EA/OG染色液pH值在5.0～6.0之间，使缓冲液pH值在6.8～7.2之间。
作为优选，苏木精染色液中各组分浓度为：苏木精2～3g/L，碘酸钠0.2～0.3g/L，硫酸铝15～20g/L，亚硫酸钠0.05～0.1g/L，乙醇100～200mL/L，乙二醇50～150mL/L，丙三醇50～100mL、乙酸10～20mL/L，余量为水。
作为优选，EA/OG染色液中各组分浓度为：橘黄G 0.5～2g/L，磷钨酸1～2g/L，亮绿SF淡黄0.2～0.5g/L，水溶伊红3～5g/L，亚硫酸钠0.05～0.1g/L，乙醇200～300mL/L，乙二醇100～200mL/L，甲醇200～300mL/L，异丙醇0～100mL，乙酸10～20mL/L，余量为水。
作为优选，缓冲液中各组分浓度为：磷酸二氢钾1～2g/L、磷酸氢二钠0.5～1.5g/L、氯化钠6～10g/L、氯化钾0.1～0.5g/L、吐温201～5mL/L，苯氧乙醇0.5～5mL/L，氢氧化钠2～6mM，余量为水。
作为优选，清洗液为甲醇、乙醇、异丙醇、丙三醇中的一种或几种。
在本发明具体实施例中，清洗液为甲醇0～200mL/L、乙醇500～950mL/L、异丙醇0～500mL/L、丙三醇0～50mL/L配制而成。
本发明还提供了该巴氏染色液试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1)苏木精染色液的配制：
①将硫酸铝加入水中，在35～45℃下搅拌溶解，再加入苏木精，搅拌溶解，得到溶液A1；
②将乙醇、乙二醇、丙三醇混合，得到溶液B1；
③将溶液A1与溶液B1混合，将碘酸钠、亚硫酸钠加入所得混合液中，得到溶液C1；
④向溶液C1中加乙酸调节pH；用水定容，过滤；
2)EA/OG染色液的配制：
①将亮绿SF淡黄、水溶伊红、橘黄G、亚硫酸钠加入水中，在35～45℃下搅拌溶解，得到溶液A2；
②将乙醇、乙二醇、甲醇、异丙醇混合，得到溶液B2；
③将溶液A2与溶液B2混合，得到溶液C2；
④向溶液C2中加入乙酸调节pH；用乙醇定容，过滤；
3)缓冲液的配制：
①将磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾加入水中，搅拌溶解，得到溶液A3；
②将苯氧乙醇加入到溶液A3中，然后加入吐温20搅拌溶解，得到溶液B3；
③向溶液B3中加入氢氧化钠调节pH；用水定容。
本发明还提供了一种巴氏染色方法，采用上述巴氏染色液试剂盒对细胞进行染色，具体包括如下步骤：
依次采用清洗液、缓冲液清洗细胞；
采用苏木素染色液对细胞核进行染色；
依次采用缓冲液、清洗液对细胞进行清洗；
采用EA/OG染色液对细胞质进行染色；
采用清洗液对细胞进行清洗；
依次采用无水乙醇、二甲苯对细胞进行冲洗，封片。
作为优选，细胞核染色的时间为2～4分钟。
作为优选，细胞质染色的时间为1～3分钟。
本发明提供了一种环保无毒快速的高清巴氏染色试剂盒及其制备方法和染色方法。该试剂盒包括苏木素染色液、EA/OG染色液、缓冲液、清洗液；苏木精染色液包括苏木精、碘酸钠、硫酸铝、亚硫酸钠、乙醇、乙二醇、丙三醇、乙酸、水；苏木素染色液的pH值为2.0～3.0；EA/OG染色液包括橘黄G、磷钨酸、亮绿SF淡黄、水溶伊红、亚硫酸钠、乙醇、乙二醇、甲醇、异丙醇、乙酸、水；EA/OG染色液的pH值为5.0～6.0；缓冲液包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、吐温20、苯氧乙醇、氢氧化钠、水；缓冲液的pH值为6.8～7.2。本发明的有益效果在于：
本发明的目的在于提供一种高清巴氏染色试剂盒及其制备和染色方法。巴氏染色液试剂盒包括，包括改良苏木素染色液、EA50/OG复合染色液，清洗液、缓冲液。可以对细胞的不同部位进行染色，其染色效果均匀、细胞结构清晰、细胞着色鲜艳，易于临床上观察诊断，其配制方便，染色步骤简洁，效果稳定，细胞对比度清晰，使用寿命长。
传统的巴氏染色液一般使用有毒的氧化汞作为原料进行苏木素的配制，其配制过程复杂，染色时间比较长，不适合在自动化设备中应用，改良后的苏木素染色液对细胞核进行染色，待检细胞的细胞核呈深蓝色或深紫色，核仁呈红色；EA50/OG复合染色液对细胞浆进行染色，待检细胞的细胞浆显示粉红色或蓝绿色，不全角化细胞的细胞浆呈粉红色，完全角化细胞的细胞浆呈橘黄色。两种染色液相互配合，临床上可以多方位观测染色结果。
与现有技术相比，染色液经过严格过滤和保护剂的抗氧化作用，在自动化设备的染色过程不容易形成结晶性物质，其试剂的配置方法简单快捷，操作简便，只需要普通的化学器具即可，无需复杂的仪器本设备，本试剂盒环保无毒、成分简单、成本低廉、易于规模化生产。
本发明的巴氏染色试剂盒染色步骤简单，操作方便、染色时间短，染色全过程只需10min左右即可完成，染色效果清晰，非常适合在全自动设备中大规模推广使用。
附图说明
图1～7分别为实施例1-3、对比例1-4染色效果图片。
具体实施方式
本发明公开了一种巴氏染色试剂盒及其制备方法和染色方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
巴氏染色法是脱落细胞染色中最好的染色方法。苏木素染液，细胞核内的染色质主要是去氧核糖核酸(DNA)，DNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木素精碱性染料以离子或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。分化：苏木素染色之后，用水洗去未结合在细胞上的染液，但是在细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附的染料必须用分化液1％盐酸酒精脱去，才能保证细胞核和细胞浆染色的分明，把这个过程称为染色的分化作用。因酸能破坏苏木素的醌型结构，使色素与组织解离，分化不可过度。蓝化分化之后苏木素在酸性条件下处于红色离子状态，在碱性条件下处于蓝色离子状态，而呈蓝色，所以分化之后用水洗去酸而中止分化，再用弱碱性水使苏木精染上的细胞核变呈蓝色，称蓝化作用，一般多用自来水浸洗即可变蓝，也可用温水(50度温水最佳)变蓝。EA50染液的酸碱度对于巴氏染色的成功起着关键作用，EA50染液由伊红、亮绿、等染料配成。伊红、亮绿、橘黄等属于酸性染料，在溶解媒中其发色团是负离子部分，发色团可与蛋白质中带正电的氨基结合，从而是胞浆显蓝色、绿色、橘黄色或红色，但蛋白质所带正负电荷的多少是随溶液的pH值而改变的，在偏碱环境中，蛋白质的羧基游离增多(带负电)，在偏酸环境中蛋白质氨基游离增多(带正电)，磷钨酸在染色过程中，不但作为媒染剂可增加染料的着色力，同时磷钨酸与碳酸锂还是一对弱酸弱碱，实际上是一对缓冲剂，可中和分化及蓝化时可能留下的少量酸或碱，保证染色达到理想效果，其适用于上皮细胞及间皮组织的标本，是阴道脱落细胞检查中最常用的染色方法，该染色法不但具有显示细胞核结构清晰、分色明显、透明度好、胞浆受色鲜艳等特点。
本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
在巴氏染色过程中，苏木素细胞核的着色试剂，EA/OG是细胞质的着色试剂，清洗液和缓冲液在染色过程起到辅助作用，亚硫酸钠为抗氧化的保护剂，染色剂pH值是影响染色效果不稳定的重要因素，通常的细胞核呈深蓝色或深紫色，细胞浆显示橘黄色、粉红色或蓝绿色，在配方比例和配制方法基本确定的前提下，整个染色过程中对pH值的调节最直接的影响了细胞的着色，颜色的深浅和颜色的变化。
本发明在实施过程中首先考察了pH的变化对整个染色体系的影响，实施例1-3、对比例1-4目的是为确定苏木素染色液和EA/OG染色液的最佳pH值范围，其中缓冲液苏木素染色前后起到辅助作用，对pH有一定的要求，清洗液是在EA/OG染色前后起到辅助作用，清洗液的成分为一种或多种醇类混合，不要求pH值。
实施例1～3
本发明一种高清巴氏染色试剂盒及其配制及染色方法实施例1-3，见表1-表3：
表1
表2
表3
对比例1～4
本发明一种高清巴氏染色试剂盒及其配制及染色方法对比例1-4，见表4-表7：
表4
表5
表6
表7
试验例 染色效果对比
染色效果实验采用多个宫颈脱落细胞样本进行，使用实施例1-3、对比例1-4巴氏染色试剂盒对细胞核、细胞质进行染色，观察细胞核、细胞质的染色情况。
染色方法：
①向载玻片样本区滴入0.5mL清洗液，3秒后吸走，再滴入0.5mL清洗液，2min后吸走清洗液；
②滴入0.5mL缓冲液，3秒后吸走，再滴入0.5mL缓冲液，2min后吸走缓冲液；
③滴入0.5mL苏木素染色液(A液)，3秒后吸走，再滴入0.5mL苏木素染色液进行细胞核染色，染色2～4分钟后吸走染色液；
④滴入1mL缓冲液进行清洗，3秒后吸走，再滴入0.4mL缓冲液清洗，吸走后再次滴入0.4mL缓冲液清洗，吸走后再次滴入0.4mL缓冲液清洗(共四次清洗)，最后一次缓冲液清洗在2min后吸走；
⑤滴入0.5mL清洗液，3秒后吸走，再滴入0.5mL清洗液，2min后吸走清洗液；
⑥滴入0.5mL EA/OG染色液，3秒后吸走，再次滴入0.5mL EA/OG染色液进行细胞质染色，染色1～3分钟后吸走染色液；
⑦滴入1mL清洗液进行清洗，3秒后吸走，再滴入0.4mL清洗液，吸走后再次滴入0.4mL清洗液，吸走后再次滴入0.4mL清洗液(共四次清洗)，3秒后吸走清洗液，2min后进行下一步；
⑧载玻片浸入或吸取适量无水乙醇冲洗5～10秒；
⑨载玻片浸入或吸取适量二甲苯冲洗5～10秒；
⑩从二甲苯中滴入1～2滴封片剂，用盖玻片封片后显微镜观察。
分别通过实施例1-3、对比例1-4的对比，观察细胞核、细胞质的染色情况，实验结果见表8。实施例1-3染色效果图片见图片1-3，对比例1-4染色效果图片见图片4-7。
表8
结果分析：
通过经过实施例1-3和对比例1-4的染色效果实验对比，染色效果如表8所示，苏木精染色液pH值低于2.0或者高于3.0时，细胞核着色很浅，EA/OG染色液pH值低于5.0或者高于6.0时，细胞质着色变差，缓冲液pH在低于6.8或者高于7.2时染色液着色情况一般，染色色彩和对比度也一般。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种巴氏染色液试剂盒，其特征在于，包括苏木素染色液、EA/OG染色液、缓冲液、清洗液；
苏木精染色液包括苏木精、碘酸钠、硫酸铝、亚硫酸钠、乙醇、乙二醇、丙三醇、乙酸、水；苏木素染色液的pH值为2.0～3.0；
EA/OG染色液包括橘黄G、磷钨酸、亮绿SF淡黄、水溶伊红、亚硫酸钠、乙醇、乙二醇、甲醇、异丙醇、乙酸、水；EA/OG染色液的pH值为5.0～6.0；
缓冲液包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、吐温20、苯氧乙醇、氢氧化钠、水；缓冲液的pH值为6.8～7.2。
2.根据权利要求1所述的巴氏染色液试剂盒，其特征在于，所述苏木精染色液中各组分浓度为：苏木精2～3g/L，碘酸钠0.2～0.3g/L，硫酸铝15～20g/L，亚硫酸钠0.05～0.1g/L，乙醇100～200mL/L，乙二醇50～150mL/L，丙三醇50～100mL、乙酸10～20mL/L，余量为水。
3.根据权利要求1所述的巴氏染色液试剂盒，其特征在于，所述EA/OG染色液中各组分浓度为：橘黄G 0.5～2g/L，磷钨酸1～2g/L，亮绿SF淡黄0.2～0.5g/L，水溶伊红3～5g/L，亚硫酸钠0.05～0.1g/L，乙醇200～300mL/L，乙二醇100～200mL/L，甲醇200～300mL/L，异丙醇0～100mL，乙酸10～20mL/L，余量为水。
4.根据权利要求1所述的巴氏染色液试剂盒，其特征在于，所述缓冲液中各组分浓度为：磷酸二氢钾1～2g/L、磷酸氢二钠0.5～1.5g/L、氯化钠6～10g/L、氯化钾0.1～0.5g/L、吐温201～5mL/L，苯氧乙醇0.5～5mL/L，氢氧化钠2～6mM，余量为水。
5.根据权利要求1所述的巴氏染色液试剂盒，其特征在于，所述清洗液为甲醇、乙醇、异丙醇、丙三醇中的一种或几种。
6.权利要求1至5中任一项所述巴氏染色液试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)苏木精染色液的配制：
①将硫酸铝加入水中，在35～45℃下搅拌溶解，再加入苏木精，搅拌溶解，得到溶液A1；
②将乙醇、乙二醇、丙三醇混合，得到溶液B1；
③将溶液A1与溶液B1混合，将碘酸钠、亚硫酸钠加入所得混合液中，得到溶液C1；
④向溶液C1中加乙酸调节pH；用水定容，过滤；
2)EA/OG染色液的配制：
①将亮绿SF淡黄、水溶伊红、橘黄G、亚硫酸钠加入水中，在35～45℃下搅拌溶解，得到溶液A2；
②将乙醇、乙二醇、甲醇、异丙醇混合，得到溶液B2；
③将溶液A2与溶液B2混合，得到溶液C2；
④向溶液C2中加入乙酸调节pH；用乙醇定容，过滤；
3)缓冲液的配制：
①将磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾加入水中，搅拌溶解，得到溶液A3；
②将苯氧乙醇加入到溶液A3中，然后加入吐温20搅拌溶解，得到溶液B3；
③向溶液B3中加入氢氧化钠调节pH；用水定容。
7.一种巴氏染色方法，其特征在于，采用权利要求1至5中任一项所述巴氏染色液试剂盒对细胞进行染色，具体包括如下步骤：
依次采用清洗液、缓冲液清洗细胞；
采用苏木素染色液对细胞核进行染色；
依次采用缓冲液、清洗液对细胞进行清洗；
采用EA/OG染色液对细胞质进行染色；
采用清洗液对细胞进行清洗；
依次采用无水乙醇、二甲苯对细胞进行冲洗，封片。
8.根据权利要求7所述的巴氏染色方法，其特征在于，所述细胞核染色的时间为2～4分钟。
9.根据权利要求7或8所述的巴氏染色方法，其特征在于，所述细胞质染色的时间为1～3分钟。
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