CN109540633B - 核型分析专用制备高分辨染色体染液 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核型分析专用制备高分辨染色体染液，它是由下述配比的原料制备而成：吉姆萨染粉1‑3g、甘油66‑69ml、甲醇66ml，分散剂1‑10ml；本发明通过对染料颗粒研磨使染料颗粒更细且标准化，并通过加入分散剂提高染料颗粒的分散特性，从而极大改进了染色的均匀和清晰度。本发明新型染液明显地提高了高分辨染色体显带染色质量。对高分辨染色体显带带纹染色效果更清晰，对人源染色体的染色速度快、可控，条带清晰。可应用于规模化临床遗传实验室。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及核型分析专用制备高分辨染色体染液。
背景技术
染色体是基因的载体，染色体可能发生数量和结构性改变，从而引起各种遗传缺陷、先天性遗传病、胚胎停育及自然流产、肿瘤等等。由染色体异常所引起的疾病一般被称为染色体病。
染色体检测目前在临床中多用于生殖、妇产、新生儿、血液病、肿瘤等专业。使用细胞培养后染色体显带技术进行遗传诊断，方法相对简单、可靠，仍然是金标准检验方法。
染色体核型分析主要分为细胞培养、收获、制片、显带和分析几个步骤。其中，显带即使用特殊染料及其他物质处理后，染色体上呈现出模式固定的明暗条纹(条带)的技术。1971年，Sumner发现G显带，胰蛋白酶和吉姆萨(Giemsa)染液处理中期分裂相细胞，可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹，这就是染色体的G带，G显带是目前最广泛应用的一种带型，是临床细胞遗传实验室常规技术。吉姆萨染液是细胞染色体检查的常规染色液，还有使用瑞特(Wright)染液，以及瑞特和吉姆萨混合染液。另外还有其它带型，比如C显带，R显带，N显带，Q显带等等，能补助G显带技术。
目前各个厂家的吉姆萨试剂在做高分辨和超高分辨核型时，效果不理想，表现为：染色时间长，带纹不均匀，染色质地效果不佳。由于现有G显带染液的制备不够规范，带纹模糊，影响带纹呈现，比如专利CN 103710435 B和CN 103308361 B。这给分析染色体核型结果带来困难，影响染色体制备的质量以及核型分析结果的室间质评。再加上高分辨染色体变细，长度增加，带纹相应增加，对染料颗粒大小、染料的分散性质和着色强度要求更高，需要一种新的染料能够满足高分辨和超高分辨染色体核型要求。为了改进染色体的染色效果，开发出针对提高染色体条带清晰度的染液，并建立制备该染液的标准操作流程，这对临床和科研遗传实验室都具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种核型分析专用制备高分辨染色体染液，本发明的染液在制备染液中每个环节都严格按照标准进行质量控制，能够明显提升染色体染色质量的可控性和稳定性。
本发明的目的是这样实现的：核型分析专用制备高分辨染色体染液，其特征在于：它是由下述配比的原料制备而成：
吉姆萨染粉1-3g、甘油66-69ml、甲醇66ml，分散剂1-10ml；
所述的染液是由下述方法制备而成：
(1)将吉姆萨染粉和少部分甘油混合，避光连续研磨2小时；
(2)研磨中，对吉姆萨染粉颗粒进行检测，直径均值d1≤2.12μm，方为合格；
(3)将研磨检测合格的吉姆萨混合液，移入到100ml棕色瓶中，加入剩余的甘油，然后58℃避光孵育2小时；
(4)然后移入500ml棕色瓶中，加入甲醇和分散剂充分混匀；密封、避光、室温保存2周；
(5)质量检验：使用吸管取染液滴到干净载玻片上，用自来水轻轻冲洗2-5秒；观察染液颜色，颜色为蓝色，不易着色，显带不均匀，为不合格；颜色为紫色，染液为合格。
本发明的目的还可以这样实现：所述的分散剂为有机硅流平剂。
所述的甲醇为分析纯甲醇。
所述对吉姆萨染粉颗粒进行检测方法为：
步骤1、手工质量检测：取研磨混合液10μl涂在手套上捻开，肉眼可见颗粒，且手指捻触到颗粒存在，则研磨不充分，需继续研磨，直至捻摸不到颗粒存在为止；
步骤2、显微镜下质量检测：捻摸不到颗粒存在后，在100倍油镜下，随机选择20个视野，计数并测量视野下每个染粉颗粒的直径，直径均值d1≤2.12μm，方为合格。
所述的核型分析专用制备高分辨染色体染液，它是由下述配比的原料制备而成：
吉姆萨染粉1g、甘油66ml、甲醇66ml、有机硅流平剂1-10ml。
核型分析专用制备高分辨染色体染液性能验证方法，其特征在于：
采用G带染色技术试验染液：
A、1号缸：将烤好的人外周血检测样品载玻片置入胰酶混合液中，37℃消化；
B、2号缸：终止胰酶处理；
C、3号缸：3号缸内盛有50ml染液缓冲液，加入1ml所述的染液，混匀，37℃染色2-10min；
D、吹干玻片，滴加封片剂，盖上盖玻片，观察染色体显带效果，显带染色体结果无毛刺，深浅带清晰，方为染液性能合格；
E、在棕色瓶上标记完整的信息：包括配制日期，总体积量，实验员，并登记入数据库。
所述的核型分析专用制备高分辨染色体染液性能验证方法，其中，所述的染液缓冲液的配比原料：十二水合磷酸氢二钠1-3g/L，磷酸二氢钾0.4-0.6g/L；染液缓冲液pH值为7.0-7.5。
本发明具有以下有益效果：与现有技术相比，本发明通过对染料颗粒研磨使染料颗粒更细且标准化，并通过加入分散剂提高染料颗粒的分散特性，从而极大改进了染色的均匀和清晰度。本发明新型染液明显地提高了高分辨染色体显带染色质量。对高分辨染色体显带带纹染色效果更清晰，对人源染色体的染色速度快、可控，条带清晰。可应用于规模化临床遗传实验室。
附图说明
图1为对照组染液检测样品染色体G显带照片(1000倍视野)。
图2为本发明染液检测样品之一染色体G显带照片(1000倍视野)。
图3为本发明染液检测样品之二染色体G显带照片(1000倍视野)。
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
本发明所用的试剂、仪器如下：
吉姆萨染粉：AppliChem；
甲醇(AR级)、甘油：国药集团化学试剂有限公司出品；
有机硅流平剂：东莞市摩能化工有限公司出品；
显微镜：奥林巴斯显微镜(OLYMPUSBX51)。
由于现有的染液对高分辨染色体染色模糊不清楚，染色偏蓝，上色较慢，甚至染色30分钟，染色体都不会着色，尝试用市场上许多染液，都不是很理想，有的厂家染液染色染色体甚至1小时以上，都没有染上色。于是我们自己开始研磨制备染液。主要从2个方面来提高染液的质量，一是制定出性能优良的染液中Giemsa染粉颗粒标准直径值，二是提高染液中染粉颗粒的分散均匀性。对Giemsa染粉原材料质量要求也较高，买染粉杂质较少的厂家或公司。首先为了保证每次研磨制备Giemsa染粉颗粒大小必须合格。我们创造性地筛选出成功染液染色染色体的合格染粉颗粒直径大小的最小值，作为标准值，用于判断为研磨是否合格。
首先，对染粉颗粒直径最小值的研究。
实施例1
本发明的核型分析专用高分辨染色体染液制备方法：
1、染液配方
吉姆萨染粉1g、甘油66ml、甲醇66ml。
2、制备方法
(1)将1g吉姆萨染粉和6ml甘油混合，避光连续研磨2小时。
(2)将吉姆萨研磨混合液，移入到100ml棕色瓶中，加入60ml甘油。然后58℃避光孵育2小时。
(3)后移入500ml棕色瓶中，加入66ml甲醇充分混匀。密封避光室温保存2周后，可进行吉姆萨染液的性能试染。
(4)染液性能试验：采用G带染色技术试验染液性能：
A、1号缸：将烤好的人外周血检测样品载玻片置入胰酶混合液中，37℃消化；
B、2号缸：后将玻片置入2号缸内盛有终止液中，37℃终止胰酶处理；
C、3号缸：再在3号缸内盛有2％的制备的新型染液中，37℃染色4min；
D、吹干玻片，滴加封片剂，盖上盖玻片，观察染色体显带效果。
(5)性能试验合格后，则在棕色瓶上标记完整的信息：包括配制日期，总体积量，实验员，并登记入数据库。
原始未研磨的吉姆萨染粉溶解1ml甲醇中，混匀后涂液在载玻片上，盖上盖玻片，在100倍油镜下，随机选择20个视野，计数并测量视野下每个吉姆萨染粉颗粒的直径，得出原始吉姆萨染粉颗粒均值。见表1。基准数据为3mm，10倍目镜，得出换算公式为:
吉姆萨颗粒实际大小(μm)＝电脑屏幕测量值(mm)/3×10
表1：测量原始未研磨的吉姆萨染粉颗粒直径均值。
染液性能试验合格后，随机选择多批次研磨成功的吉姆萨染液，分别涂液在载玻片上，在100倍油镜下，随机选择20个视野，计数并测量视野下每个吉姆萨染粉颗粒的直径，成功批次的合格吉姆萨染粉颗粒均值最小值为2.12μm。为了染液的高质量选择吉姆萨染粉颗粒合格均值为≤2.12μm，具体见表2。其它批次研磨成功的染粉颗均值见表3。基准数据为3mm，10倍目镜，得出换算公式为:
吉姆萨颗粒实际大小(μm)＝电脑屏幕测量值(mm)/3×10
表2：定为标准研磨的吉姆萨染粉颗粒直径均值。
表3：测量试验批次成功研磨的吉姆萨染粉颗粒直径均值。
实验确定吉姆萨染粉颗粒直径合格均值为≤2.12μm，为了优化研磨制备染液，我们也摸索增加了染液颗粒检测和检查有效步骤。
实施例2
本发明的核型分析专用高分辨染色体染液制备方法：
1、染液配方
吉姆萨染粉1g、甘油66ml、甲醇66ml。
2、制备方法
(1)将1g吉姆萨染粉和6ml甘油混合，避光连续研磨2小时。
(2)检测指标：研磨后，通过对吉姆萨染粉颗粒大小进行2次检测合格后，方才开始下一步。具体步骤如下：
A、手工检测步骤1：取吉姆萨研磨混合液10μl涂在手套上捻开，肉眼可见颗粒，且手指捻触到颗粒存在，则研磨不充分，继续在步骤(1)中研磨直至捻摸不到颗粒存在为止。
B、显微镜检测步骤2：捻摸不到颗粒存在后，在100倍油镜下，随机选择20个视野，计数并测量视野下每个吉姆萨染粉颗粒的直径，直径均值d1≤2.12μm，方为合格。
(3)将吉姆萨研磨混合液，移入到100ml棕色瓶中，加入60ml甘油。然后58℃避光孵育2小时。
(4)后移入500ml棕色瓶中，加入66ml甲醇充分混匀。密封避光室温保存2周后，可进行吉姆萨染液的质量检验和性能试染。
(5)检验：使用吸管取染液一滴滴到干净载玻片上，用自来水轻轻冲洗2-5秒。观察染液颜色，颜色为蓝色，为不合格。需要重新配制研磨。颜色为紫色，则为正常颜色，染液初检合格。
(6)染液性能试验：采用G带染色技术试验染液性能：
A、1号缸：将烤好的人外周血检测样品载玻片置入胰酶混合液中，37℃消化；
B、2号缸：后将玻片置入2号缸内盛有终止液中，37℃终止胰酶处理；
C、3号缸：再在3号缸内盛有2％的制备的新型染液中，37℃染色4min；
D、吹干玻片，滴加封片剂，盖上盖玻片，观察染色体显带效果。
(7)性能试验合格后，则在棕色瓶上标记完整的信息：包括配制日期，总体积量，实验员，并登记入数据库。
第二，解决染液中染料颗粒的分散较差的问题
在解决了研磨合格颗粒大小标准化后，由于其颗粒较小，能有效地结合在高分辨染色体上的细密带纹内。但是由于染液中染料颗粒的分散较差，染液染色后仍然会在染色体上呈现带纹非常不均匀。导致显带差异性较大，很难发出高质量的染色体报告。如何提高颗粒结合在染色体的均匀性，于是我们又对染粉颗粒的分散均匀性进行实验，我们独创性地采用添加分散剂的方法来提高染液染粉颗粒的均匀性，但是被称为分散剂的种类较多，有水溶性的，有机溶性的，如何筛选找到一种适合的分散剂就是一项难题。因为染液中的溶剂主要是有机溶剂，我们使用环氧乙烷、聚乙二醇、有机硅流平剂来做分散剂进行了反复试验。首先随机选择了环氧乙烷，随机采用5个梯度的工作体积，分别为0ml，1ml，2.5ml，5ml，10ml5组。不加分散剂0ml为对比组。
实施例3
本发明的核型分析专用高分辨染色体染液制备方法：
1、染液配方
吉姆萨染粉1g、甘油66ml、甲醇66ml、分散剂。
其中，所述的分散剂：
实验组1的分散剂是环氧乙烷工作体积为1ml。
实验组2的分散剂是环氧乙烷工作体积为2.5ml。
实验组3的分散剂是环氧乙烷工作体积为5ml。
实验组4的分散剂是环氧乙烷工作体积为10ml。
对比组1的分散剂是环氧乙烷工作体积为0ml。
2、制备方法
(1)将1g吉姆萨染粉和6ml甘油混合，避光连续研磨2小时。
(2)检测指标：研磨后，通过对吉姆萨染粉颗粒大小进行2次检测合格后，方才开始下一步。具体步骤如下：
A、手工检测步骤1：取吉姆萨研磨混合液10μl涂在手套上捻开，肉眼可见颗粒，且手指捻触到颗粒存在，则研磨不充分，继续在步骤(1)中研磨直至捻摸不到颗粒存在为止。
B、显微镜检测步骤2：捻摸不到颗粒存在后，在100倍油镜下，随机选择20个视野，计数并测量视野下每个吉姆萨染粉颗粒的直径，直径均值d1≤2.12μm，方为合格。
(3)将吉姆萨研磨混合液，移入到100ml棕色瓶中，加入60ml甘油。然后58℃避光孵育2小时。
(4)后移入500ml棕色瓶中，加入66ml甲醇和环氧乙烷充分混匀。密封避光室温保存2周后，可进行吉姆萨染液的质量检验和性能试染。
(5)检验：使用吸管取染液一滴滴到干净载玻片上，用自来水轻轻冲洗2-5秒。观察染液颜色，颜色为蓝色，为不合格。需要重新配制研磨。颜色为紫色，则为正常颜色，染液初检合格。
(6)染液性能试验：采用G带染色技术试验染液性能：
A、1号缸：将烤好的人外周血检测样品载玻片置入胰酶混合液中，37℃消化；
B、2号缸：后将玻片置入2号缸内盛有终止液中，37℃终止胰酶处理；
C、3号缸：再在3号缸内盛有2％的制备的新型染液中，37℃染色4min；
D、吹干玻片，滴加封片剂，盖上盖玻片，观察染色体显带效果。
(7)性能试验合格后，则在棕色瓶上标记完整的信息：包括配制日期，总体积量，实验员，并登记入数据库。
经过连续分别3次实验，分别4个环氧乙烷工作体积实验组和1个对比组，分别显微镜下观察，高分辨染色体细胞个数，以≥550每套单倍体条带数目(Bands Per HaploidSet，BPHS)的细胞个数来衡量，观察每条染色体的染色均一性，结果比对见表4，4个不同环氧乙烷工作体积实验组对高分辨染色体的染色比较均匀，带纹较细密。对比组1的染色染色体不均一性比例较高。
表4镜下含分散剂环氧乙烷的染液对染色体染色效果。
然后随机选择了聚乙二醇，随机采用5个梯度的工作体积，分别为0ml，1ml，2.5ml，5ml，10ml 5组。不加分散剂0ml为对比组。
实施例4
本发明的核型分析专用高分辨染色体染液制备方法：
1、染液配方
吉姆萨染粉1g、甘油66ml、甲醇66ml、分散剂。
其中，所述的分散剂：
实验组5的分散剂是聚乙二醇工作体积为1ml。
实验组6的分散剂是聚乙二醇工作体积为2.5ml。
实验组7的分散剂是聚乙二醇工作体积为5ml。
实验组8的分散剂是聚乙二醇工作体积为10ml。
对比组2的分散剂是聚乙二醇工作体积为0ml。
2、制备方法
(1)将1g吉姆萨染粉和6ml甘油混合，避光连续研磨2小时。
(2)检测指标：研磨后，通过对吉姆萨染粉颗粒大小进行2次检测合格后，方才开始下一步。具体步骤如下：
A、手工检测步骤1：取吉姆萨研磨混合液10μl涂在手套上捻开，肉眼可见颗粒，且手指捻触到颗粒存在，则研磨不充分，继续在步骤(1)中研磨直至捻摸不到颗粒存在为止。
B、显微镜检测步骤2：捻摸不到颗粒存在后，在100倍油镜下，随机选择20个视野，计数并测量视野下每个吉姆萨染粉颗粒的直径，直径均值d1≤2.12μm，方为合格。
(3)将吉姆萨研磨混合液，移入到100ml棕色瓶中，加入60ml甘油。然后58℃避光孵育2小时。
(4)后移入500ml棕色瓶中，加入66ml甲醇和环氧乙烷充分混匀。密封避光室温保存2周后，可进行吉姆萨染液的质量检验和性能试染。
(5)检验：使用吸管取染液一滴滴到干净载玻片上，用自来水轻轻冲洗2-5秒。观察染液颜色，颜色为蓝色，为不合格。需要重新配制研磨。颜色为紫色，则为正常颜色，染液初检合格。
(6)染液性能试验：采用G带染色技术试验染液性能：
A、1号缸：将烤好的人外周血检测样品载玻片置入胰酶混合液中，37℃消化；
B、2号缸：后将玻片置入2号缸内盛有终止液中，37℃终止胰酶处理；
C、3号缸：再在3号缸内盛有2％的制备的本发明染液中，37℃染色4min；
D、吹干玻片，滴加封片剂，盖上盖玻片，观察染色体显带效果。
(7)性能试验合格后，则在棕色瓶上标记完整的信息：包括配制日期，总体积量，实验员，并登记入数据库。
经过连续分别3次实验，分别4个聚乙二醇工作体积实验组和1个对比组，分别显微镜下观察，高分辨染色体细胞个数，以≥550每套单倍体条带数目(Bands Per HaploidSet，BPHS)的细胞个数来衡量，观察每条染色体的染色均一性，结果比对见表5，4个不同聚乙二醇工作体积实验组和对比组1对高分辨染色染色体不均一性比例较高。
表5镜下含分散剂聚乙二醇的染液对染色体染色效果。
最后用有机硅流平剂作为分散剂，随机采用5个梯度的工作体积，分别为0ml，1ml，2.5ml，5ml，10ml 5组。不加分散剂0ml为对比组。
实施例5
本发明的核型分析专用高分辨染色体染液制备方法：
1、染液配方
吉姆萨染粉1g、甘油66ml、甲醇66ml、分散剂。
其中，所述的分散剂：
实验组9的分散剂是有机硅流平剂工作体积为1ml。
实验组10的分散剂是有机硅流平剂工作体积为2.5ml。
实验组11的分散剂是有机硅流平剂工作体积为5ml。
实验组12的分散剂是有机硅流平剂工作体积为10ml。
对比组3的分散剂是有机硅流平剂工作体积为0ml。
2、制备方法
(1)将1g吉姆萨染粉和6ml甘油混合，避光连续研磨2小时。
(2)检测指标：研磨后，通过对吉姆萨染粉颗粒大小进行2次检测合格后，方才开始下一步。具体步骤如下：
A、手工检测步骤1：取吉姆萨研磨混合液10μl涂在手套上捻开，肉眼可见颗粒，且手指捻触到颗粒存在，则研磨不充分，继续在步骤(1)中研磨直至捻摸不到颗粒存在为止。
B、显微镜检测步骤2：捻摸不到颗粒存在后，在100倍油镜下，随机选择20个视野，计数并测量视野下每个吉姆萨染粉颗粒的直径，直径均值d1≤2.12μm，方为合格。
(3)将吉姆萨研磨混合液，移入到100ml棕色瓶中，加入60ml甘油。然后58℃避光孵育2小时。
(4)后移入500ml棕色瓶中，加入66ml甲醇和有机硅流平剂充分混匀。密封避光室温保存2周后，可进行吉姆萨染液的质量检验和性能试染。
(5)检验：使用吸管取染液一滴滴到干净载玻片上，用自来水轻轻冲洗2-5秒。观察染液颜色，颜色为蓝色，为不合格。需要重新配制研磨。颜色为紫色，则为正常颜色，染液初检合格。
(6)染液性能试验：采用G带染色技术试验染液性能：
A、1号缸：将烤好的人外周血检测样品载玻片置入胰酶混合液中，37℃消化；
B、2号缸：后将玻片置入2号缸内盛有终止液中，37℃终止胰酶处理；
C、3号缸：再在3号缸内盛有2％的制备的新型染液中，37℃染色4min；
D、吹干玻片，滴加封片剂，盖上盖玻片，观察染色体显带效果。
(7)性能试验合格后，则在棕色瓶上标记完整的信息：包括配制日期，总体积量，实验员，并登记入数据库。
经过连续分别3次实验，分别4个有机硅流平剂工作体积实验组和1个对比组，分别显微镜下观察，高分辨染色体细胞个数，以≥550每套单倍体条带数目(Bands Per HaploidSet，BPHS)的细胞个数来衡量，观察每条染色体的染色均一性，结果比对见表6，4个不同有机硅流平剂工作体积实验组对高分辨染色体的染色比较均匀，带纹较细密。对比组1的染色染色体不均一性比例较高。
表6镜下含分散剂有机硅流平剂的染液对染色体染色效果。
考虑到分散剂环氧乙烷的毒性对人体较大，确定毒性特别小的有机硅流平剂为染液中的分散剂。
实施例6
本发明的核型分析专用高分辨染色体染液制备方法：
1、染液配方
吉姆萨染粉1g、甘油66ml、甲醇66ml、2.5ml机硅流平剂。
2、制备方法
(1)将1g吉姆萨染粉和6ml甘油混合，避光连续研磨2小时。
(2)检测指标：研磨后，通过对吉姆萨染粉颗粒大小进行2次检测合格后，方才开始下一步。具体步骤如下：
A、手工检测步骤1：取吉姆萨研磨混合液10μl涂在手套上捻开，肉眼可见颗粒，且手指捻触到颗粒存在，则研磨不充分，继续在步骤(1)中研磨直至捻摸不到颗粒存在为止。
B、显微镜检测步骤2：捻摸不到颗粒存在后，在100倍油镜下，随机选择20个视野，计数并测量视野下每个吉姆萨染粉颗粒的直径，直径均值d1≤2.12μm，方为合格。
(3)将吉姆萨研磨混合液，移入到100ml棕色瓶中，加入60ml甘油。然后58℃避光孵育2小时。
(4)后移入500ml棕色瓶中，加入66ml甲醇和2.5ml有机硅流平剂充分混匀。密封避光室温保存2周后，可进行吉姆萨染液的质量检验和性能试染。
(5)检验：使用吸管取染液一滴滴到干净载玻片上，用自来水轻轻冲洗2-5秒。观察染液颜色，颜色为蓝色，为不合格。需要重新配制研磨。颜色为紫色，则为正常颜色，染液初检合格。
(6)染液性能试验：采用G带染色技术试验染液性能：
A、1号缸：将烤好的人外周血检测样品载玻片置入胰酶混合液中，37℃消化；
B、2号缸：后将玻片置入2号缸内盛有终止液中，37℃终止胰酶处理；
C、3号缸：再在3号缸内盛有2％的制备的新型染液中，37℃染色4min；
D、吹干玻片，滴加封片剂，盖上盖玻片，观察染色体显带效果。
(7)性能试验合格后，则在棕色瓶上标记完整的信息：包括配制日期，总体积量，实验员，并登记入数据库。
实施例7
本发明的核型分析专用高分辨染色体染液制备方法：
1、染液配方
吉姆萨染粉3g、甘油68ml、甲醇66ml、10ml有机硅流平剂。
3号缸：再在3号缸内盛有2％的新制备的新型染液中，37℃染色10min。
2、制备方法同实施例6中的步骤2制备方法。
实施例8
本发明的核型分析专用制备高分辨染色体染液制备方法：
1、染液配方
吉姆萨染粉2g、甘油67ml、甲醇66ml、1ml有机硅流平剂。
3号缸：再在3号缸内盛有2％的新制备的新型染液中，37℃染色2min。
2、制备方法同实施例6中的步骤2制备方法。
以下用试验例的方式说明本发明的有益效果：
试验例1：
本发明的核型分析专用制备高分辨染色体的染液对人外周血染色体的染色：
一、试验材料
本发明染液：由实施例6中制备的核型分析专用高分辨染色体染液；
对照染液：市售的吉姆萨染色液(厂家：上海朝瑞生物科技有限公司批号：DM0001，有效期:2020-11)；
人外周血染色体制片。
二、染色方法
A、1号缸：将烤好的人外周血染色体载玻片置入胰酶混合液中，37℃消化；
B、2号缸：后将玻片置入盛有终止液的2号缸内，37℃终止胰酶处理；
C、3号缸：再在盛有2％的染液(对照染液)3号缸内，37℃染色30min；
D、吹干玻片，加2滴封片剂，盖上盖玻片，使用Leica的GSL120扫描分析染色体。
三、染色结果
对照染液对人外周血染色体的染色结果失败，染色至1小时，染色体都没有着色。
试验例2
本发明的核型分析专用制备高分辨染色体的染液对人外周血染色体的染色：
一、试验材料
本发明染液：由实施例6中制备的核型分析专用高分辨染色体染液；
对照染液：市售的吉姆萨染色液(厂家：珠海贝索生物技术有限公司批号：BA-4122，有效期:2020-07-09)；
人外周血染色体制片。
二、染色方法
A、1号缸：将烤好的人外周血染色体载玻片置入胰酶混合液中，37℃消化；
B、2号缸：后将玻片置入盛有终止液的2号缸内，37℃终止胰酶处理；
C、3号缸：再在盛有2％的染液(本发明染液或对照染液)3号缸内，37℃染色4min；
D、吹干玻片，加2滴封片剂，盖上盖玻片，使用Leica的GSL120扫描分析染色体。
三、染色结果
对照组染液对人外周血染色体的染色结果见图1，图为1000倍视野下的人外周血染色体G显带染色；对照组染液对G显带高分辨染色效果非常差，着色的中期细胞非常少，可能由于染料颗粒直径很大，很难结合到高分辨染色体细微带纹上，多数为冲洗掉的大染粉颗粒附着在染色体上被拍照成黑点或斑点，形成不了明晰的带纹，很难辩认出染色体条带，染色体分带不清晰，导致分析染色体核型失败。这样的染液满足不了高分辨染色体的更细密带纹要求。
本发明染液对人外周血染色体的染色结果见图2和图3，图均为1000倍视野下的人外周血染色体G显带染色。使用本发明染液染色时，对G显带染色带纹更细致，效果更佳。
可见，本发明染液对人外周血染色体的染色效果更好，可可用来制备高分辨和超高分辨染色体进行核型分析。
综上所述，本发明的新型染液，对人源染色体的染色速度快、可控，条带清晰。可应用于规模化临床遗传实验室。
以上仅陈述本发明的优选实施例，本申请并不局限于上面描述的具体实施方式，对本申请的均等变化和修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。
Claims (7)
1.核型分析专用制备高分辨染色体染液，它是由下述配比的原料制备而成：
吉姆萨染粉1-3g、甘油66-69ml、甲醇66ml，分散剂1-10ml；
所述的染液是由下述方法制备而成：
(1)将吉姆萨染粉和少部分甘油混合，避光连续研磨2小时；
(2)研磨中，对吉姆萨染粉颗粒进行检测合格；
(3)将研磨检测合格的吉姆萨混合液，移入到100ml棕色瓶中，加入剩余的甘油，然后58℃避光孵育2小时；
(4)然后移入500ml棕色瓶中，加入甲醇和分散剂充分混匀；密封、避光、室温保存2周；
(5)质量检验：使用吸管取染液滴到干净载玻片上，用自来水轻轻冲洗2-5秒；观察染液颜色，颜色为蓝色，不易着色，显带不均匀，为不合格；颜色为紫色，染液为合格；
其特征在于：所述的分散剂为有机硅流平剂；
上述第(2)步研磨中吉姆萨染粉颗粒进行检测，直径均值d1≤2.12μm，方为合格。
2.根据权利要求1所述的核型分析专用制备高分辨染色体染液，其特征在于：它是由下述配比的原料制备而成：
吉姆萨染粉1g、甘油66ml、甲醇66ml、分散剂1-10ml。
3.根据权利要求1或2所述的核型分析专用制备高分辨染色体染液，其特征在于：所述的甲醇为分析纯甲醇。
4.根据权利要求1或2所述的核型分析专用制备高分辨染色体染液，其特征在于：所述对吉姆萨染粉颗粒进行检测方法为：
步骤1、手工质量检测：取研磨混合液10μl涂在手套上捻开，肉眼可见颗粒，且手指捻触到颗粒存在，则研磨不充分，需继续研磨，直至捻摸不到颗粒存在为止；
步骤2、显微镜下质量检测：捻摸不到颗粒存在后，在100倍油镜下，随机选择20个视野，计数并测量视野下每个染粉颗粒的直径，直径均值d1≤2.12μm，方为合格。
5.根据权利要求3所述的核型分析专用制备高分辨染色体染液，其特征在于：所述对吉姆萨染粉颗粒进行检测方法为：
步骤1、手工质量检测：取研磨混合液10μl涂在手套上捻开，肉眼可见颗粒，且手指捻触到颗粒存在，则研磨不充分，需继续研磨，直至捻摸不到颗粒存在为止；
步骤2、显微镜下质量检测：捻摸不到颗粒存在后，在100倍油镜下，随机选择20个视野，计数并测量视野下每个染粉颗粒的直径，直径均值d1≤2.12μm，方为合格。
6.权利要求1所述的核型分析专用制备高分辨染色体染液性能验证方法，其特征在于：
采用G带染色技术试验染液：
A、1号缸：将烤好的人外周血检测样品载玻片置入胰酶混合液中，37℃消化；
B、2号缸：终止胰酶处理；
C、3号缸：3号缸内盛有50ml染液缓冲液，加入1ml所述的染液，混匀，37℃染色2-10min；
D、吹干玻片，滴加封片剂，盖上盖玻片，观察染色体显带效果，显带染色体结果无毛刺，深浅带清晰，方为染液性能合格；
E、在棕色瓶上标记完整的信息：包括配制日期，总体积量，实验员，并登记入数据库。
7.根据权利要求6所述的核型分析专用制备高分辨染色体染液性能验证方法，其特征在于：所述的染液缓冲液的配比原料：十二水合磷酸氢二钠1-3g/L，磷酸二氢钾0.4-0.6g/L；染液缓冲液pH值为7.0-7.5。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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