CN113984482B - 一种用于制备超高分辨染色体的复合试剂及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于制备超高分辨染色体的复合试剂及其应用方法,复合试剂由以下组分组成:RO‑3306:0.1μmol/L~0.1mmol/L,TSA:2nmol/L~2μmol/L,溶剂为DMSO,命名为HD850试剂。本发明的复合试剂用于制备外周血细胞和干细胞等其他培养细胞的超高分辨染色体,超高分辨染色体显著占比高,≥30%中期相细胞可以获得550条带,≥10%中期相细胞可以获得700条带,≥20%中期相细胞为850以上条带染色体。且具有无致畸致癌试剂对实验室人员伤害和环境污染,操作简便,速度快,效率高。解决了本领域急需制备超高分辨染色体的复合试剂的市场缺口,可直接应用于临床染色体检测项目,满足医疗机构的需求。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及细胞遗传学领域的染色体制备和核型分析。
背景技术
染色体显带分辨率达到550条带水平,仍然不能发现低于5Mbp的微小染色体变异。而分辨率达到850条带水平,可以发现低于3Mbp的微小染色体变异,提高染色体畸变的检出率。从而降低临床诊断的漏诊,错诊和误诊率。
国内外传统的高分辨染色体核型制备方法富集染色体£550每套单倍体条带(BPHS)的水平,极个别细胞可以达到550 BPHS以上,当然超高分辨率的850BPHS细胞极少见。制备高分辨染色体试剂常使用5-氟尿嘧啶核苷(5-fluorouridine,Frdu)、尿嘧啶核苷(uridnie)、胸腺嘧啶核苷(thymidine、TDR)、溴化乙锭(ethidium bromide,EB)、放线菌素D(AMD),比如文献张清健等人外周血淋巴细胞高分辨染色体制备技术的研究,见《癌变畸变突变》,2013, 第 25 卷 ( 第 1 期 ), 第 53-56 页,1992, 第27 卷 ( 第 1 期 ), 第17-20 页。Sawyer, J. (1995). High resolution mid-prophase human chromosomesinduced by echinomycin and ethidium bromide. Human Genetics, 95(1). Yunis, J.J., Sawyer, J. R., & Ball, D. W. (1978). The characterization of high-resolution G-banded chromosomes of man. Chromosoma, 67(4), 293–307,以及中国专利CN201811536526,CN201610926163等。这些试剂不仅制备方法复杂、难于质控、制备效率低,特别是850BPHS细胞占比太低,此外,制备的染色体严重扭曲折叠不易识别,且上述试剂均属于致畸致癌物,毒性大,有污染环境的风险。
其中作为传统药物的溴化乙锭为致畸致癌物,见文献杨如镜等,溴化乙锭及放线菌素 D 对高分辨染色体的作用,《河南医科大学学报》。其制备高分辨染色体核型细胞比例比较低,可见550 BPHS细胞,不易观察到850BPHS细胞,见文献Benn P, Delach J. Humanlymphocyte culture and chromosome analysis. CSH Protoc. 2008 Sep 1;2008:pdb.prot5035,这由其药物效率低导致的,无法高效地提高高分辨染色体比例,且结果不稳定。而使用高浓度溴化乙锭即使制备出个别的850BPHS细胞,也会致使大量的中期染色体细胞凋亡,明显减少,统计其数量比较困难;而且最关键的是细胞高分辨染色体严重扭曲折叠,识别起来困难。见文献Xiao, S., Liu, Q.-Z., Wang, R.-B., Zhang, M.-Y., & Li,P. (1989). An improved method of direct chromosome preparation from chorionicvillus and high resolution banding technique. Prenatal Diagnosis, 9(8), 589–593。我们前期的摸索溴化乙锭试验结果也证明以上问题的客观存在。
发明内容
本发明的目的是提供了一种用于制备超高分辨染色体的复合试剂及其应用方法。它可用于外周血细胞和干细胞等其他培养细胞制备超高分辨染色体。该制备超高分辨染色体的复合试剂不仅能快速、高效地制备舒展的550、700、850 BPHS染色体,而且避免了上述致畸致癌物使用,方法操作简单。
本发明的目的是这样实现的:一种用于制备超高分辨染色体的复合试剂,其特征在于,由以下组分组成:RO-3306:0.1μmol/L~0.1mmol/L,TSA:2nmol/L~2μmol/L,溶剂为DMSO,命名为HD850试剂。
本发明的目的还可以这样实现:所述的RO-3306:0.1μmol/L,TSA:2nmol/L。
所述的RO-3306: 1μmol/L,TSA:20nmol/L。
所述的RO-3306: 10μmol/L,TSA:0.2μmol/L。
所述的RO-3306: 0.1mmol/L,TSA:2μmol/L。
本发明用于制备超高分辨染色体的复合试剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
a)配制RO-3306储藏液:在1.5ml棕色管中加入10mgRO-3306,用948.5μlDMSO溶解后,-20℃保存;
b)配制TSA储藏液:在1.5ml棕色管中加入10mgTSA,用826.8μlDMSO溶解后,-20℃保存;
c)配制试剂成品:在1.5ml棕色管中加入397μl RO-3306储藏液和3μlTSA储藏液,再加入800μl DMSO混匀,-20℃保存,即为试剂成品,命名为HD850试剂。
本发明用于制备超高分辨染色体的复合试剂在制备外周血细胞超高分辨染色体的应用方法,其特征在于,步骤如下:
步骤1:将人外周血细胞置37 ℃培养46-52小时;加入一定量HD850试剂到培养管中,继续培养16-24小时;加入9-氨基吖啶,继续培养0.5-6小时;加入秋水仙素,继续培养至收获;
步骤2:细胞收获:离心弃去上清液;加入分散液8ml,离心;
步骤3:制备细胞悬液:预固定:沿管壁加入1ml固定液;固定:离心,去上清液,加入10ml固定液,固定15分钟;离心,去上清液,用固定液制备细胞悬液;
步骤4:制片:将细胞悬液滴加在载玻片上;烤片2小时;
步骤5:G带染色:经胰酶解析染色体带纹,使用制备高分辨染色体染液染色,完成超高分辨染色体的制备。
本发明用于制备超高分辨染色体的复合试剂在制备干细胞超高分辨染色体的应用方法,其特征在于,步骤如下:
步骤1:培养:加入HD850试剂到培养瓶中,继续培养;加入9-氨基吖啶继续培养;加入秋水仙素,继续培养至收获;
步骤2:干细胞收获:转移瓶内培养液至新15ml离心管内后,瓶内加入胰蛋白酶消化处理;消化细胞后,加入原培养液终止,并倒回原离心管内;离心弃去上清液;加入分散液8ml,离心;
步骤3:制备细胞悬液:预固定:沿管壁加入1ml固定液,混匀;离心,去上清液,加入10ml固定液,固定15分钟;离心,去上清液,用固定液制备细胞悬液;
步骤4:制片:将细胞悬液滴加在载玻片上;烤片2小时;
步骤5:G带染色:经胰酶解析染色体带纹,高分辨染色体染液染色,完成超高分辨染色体的制备。
本发明用于制备超高分辨染色体的复合试剂在制备羊水细胞超高分辨染色体的应用方法,其特征在于,步骤如下:
步骤1:培养:加入HD850试剂到培养瓶中,继续培养;加入9-氨基吖啶继续培养;加入秋水仙素,继续培养至收获;
步骤2:羊水细胞收获:转移瓶内培养液至新15ml离心管内后,瓶内加入胰蛋白酶消化处理;消化细胞后,加入原培养液终止,并倒回原离心管内;离心弃去上清液;加入分散液8ml,离心;
步骤3:制备细胞悬液:预固定:沿管壁加入1ml固定液,混匀;离心,去上清液,加入10ml固定液,固定15分钟;离心,去上清液,用固定液制备细胞悬液;
步骤4:制片:将细胞悬液滴加在载玻片上;烤片2小时;
步骤5:G带染色:经胰酶解析染色体带纹,使用制备高分辨染色体染液染色,即可完成超高分辨染色体制备。
本发明具有如下有益效果: 1)超高分辨染色体显著占比高,≥30%中期相细胞可以获得550条带,≥10%中期相细胞可以获得700条带,≥20% 中期相细胞为850以上条带染色体。2)不使用5-氟尿嘧啶核苷(5-fluorouridine,Frdu)、尿嘧啶核苷(uridnie)、胸腺嘧啶核苷(thymidine、TDR)、溴化乙锭(ethidium bromide,EB)和放线菌素D(AMD)。避免这些致畸致癌试剂对实验室人员伤害和环境污染。3)本发明的制备方法只在正常工作时间加一次药,操作简便。三天内完成实验,速度快,效率高。4)本发明的复合试剂,解决了本领域急需解决的一个难题,填补了制备超高分辨染色体的复合试剂的市场缺口,可直接应用于临床染色体检测项目,满足医疗机构的需求。
附图说明
图1为实施例1中不同浓度RO-3306作用于细胞后,制备出的各区间染色体比较统计结果。
图2为实施例6中不同浓度HD850试剂作用于细胞,制备出的各区间染色体比较统计结果。
图3为实施例7中HD850试剂制备染色体G显带照片,分辨率≥850 BPHS(1000倍视野)。
图4为实施例8中HD850试剂和对照组(溴化乙锭)作用于细胞,制备出的各区间染色体比较统计结果。
图5为实施例10中HD850试剂和对照组(溴化乙锭)作用于细胞,分辨率≥850 BPHS细胞对比图。
图6为本发明与其它医学检测机构的染色体G显带核型漏诊报告结果对比图。
图7为本发明与其它医学检测机构的染色体G显带核型错诊报告结果对比图。
具体实施方式
为了解决传统方法存在的染色体严重扭曲折叠问题,基于细胞染色体主要由组蛋白和DNA组成,而组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)可以使染色质处于一种紧密的超螺旋结构,所以我们遴选出特异的组蛋白去乙酰化酶类型I 和 II的抑制剂,曲古抑菌素A(分子式C17H22N2O3;CAS:58880-19-6;Trichostatin A,TSA)(文献Vigushin DM etal. Trichostatin A is a histone deacetylase inhibitor with potent antitumoractivity against breast cancer in vivo. Clin Cancer Res. 2001 Apr;7(4):971-6.Hu X, et al. Histone deacetylase inhibitor trichostatin A promotes theosteogenic differentiation of rat adipose-derived stem cells by altering theepigenetic modifications on Runx2 promoter in a BMP signaling-dependentmanner.,Stem Cells Dev. 2012 Aug 8. Azechi T, et al. Trichostatin A, an HDACclass I/II inhibitor, promotes Pi-induced vascular calcification via up-regulation of the expression of alkaline phosphatase. J Atheroscler Thromb.2013;20(6):538-47.),通过它来抑制组蛋白去乙酰化酶,进而可能使细胞染色体舒展,增加染色体的长度,降低超长染色体扭曲现象,提高了超长染色体的识别度,并反复实验验证获得显著效果。
我们选择的技术路线,先是解决传统提高超长染色体比例低的问题,然后进一步地去解决传统染色体严重扭曲不易识别问题。
我们首先根据搜索到的大量文献中这篇文献(L.T. Vassilev,et al.Selectivesmall-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of humanCDK1.PNAS (2006)103(28),10660–10665.),得到启发,推测到CDK1磷酸激酶抑制剂RO-3306可能会提高超长染色体细胞的比例,根据药物半抑制浓度(或称半抑制率),即IC50,范围为20nmol/L~110nmol/L。进而确定范围浓度内的100nmol/L,即0.1μmol/L, 选择RO-3306一系列的工作浓度梯度为0pmol/L、10pmol/L、0.1nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L 7组。作用时间随机设为20h。0pmol/L组是工作浓度为溶剂DMSO。反复试验验证确有能提高超长染色体细胞比例的效果。
但同时发现,单独使用CDK1磷酸激酶抑制剂RO-3306提高超长染色体细胞的比例有限,且仍存在染色体分散差的问题;鉴于此,如何在增加染色体的分散性和舒展性,即降低染色体严重扭曲的同时,兼顾舒展伸长提升超长染色体比例仍是一个难题。为此,我们从两个方面进行了研究:一方面是脱氧核糖核酸(DNA);另一方面是组蛋白。曾试用染色体DNA磷酸化调节试剂,比如S-腺甘基蛋氨酸(S-Adenosylmethionine ,AdoMet)(文献Detich N,Hamm S, Just G, Knox JD, Szyf M. The methyl donor S-Adenosylmethionineinhibits active demethylation of DNA: a candidate novel mechanism for thepharmacological effects of S-Adenosylmethionine. J Biol Chem. 2003 Jun 6;278(23):20812-20.)等;DNA甲基化调节试剂,比如吴茱萸碱(Evodiamine)(文献Takada Y,Kobayashi Y, Aggarwal BB. Evodiamine abolishes constitutive and inducible NF-kappaB activation by inhibiting IkappaBalpha kinase activation, therebysuppressing NF-kappaB-regulated antiapoptotic and metastatic gene expression,up-regulating apoptosis, and inhibiting invasion. J Biol Chem. 2005 Apr 29;280(17):17203-12.),5-azacytidine (5-AZA)(文献Christman, J. 5-Azacytidine and5-aza-2′-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studiesand their implications for cancer therapy. Oncogene 21, 5483–5495 (2002).)等,但经反复实验验证,其结果并不理想。要么没有舒展染色体的作用,要么反而有凝缩染色体的作用。然后我们针对染色体组蛋白再次进行了研究,以期找到舒展染色体的药物。首先考虑到组蛋白H1至H4磷酸化作用药物,但未观察到预期效果。然后延伸到了组蛋白乙酰化研究,筛选出ITSA-1,Vorinostat (SAHA)和Trichostatin A(TSA)等,并进行了反复实验。结果发现TSA不仅能舒展染色体的作用,也兼具明显增加染色体长度。最后,组合形成本发明的HD850试剂,能够非常简便制备出高质量超高分辨染色体,用于临床和科研核型分析。
实施例1
本发明使用RO-3306制备外周血细胞染色体的实验:
其中,所述的RO-3306:
实验组1 RO-3306浓度为10pmol/L。
实验组2 RO-3306浓度为0.1nmol/L。
实验组3 RO-3306浓度为1nmol/L。
实验组4 RO-3306浓度为10nmol/L。
实验组5 RO-3306浓度为0.1μmol/L。
实验组6 RO-3306浓度为1μmol/L。
对比组1 RO-3306浓度为0pmol/L。
使用RO-3306制备外周血细胞染色体的方法步骤如下:
步骤1:外周血接种培养:将人外周血细胞置37 ℃培养46-52小时;分别加入各实验组使用RO-3306到培养管中,对照组不加RO-3306。混匀继续培养20h;加入9-氨基吖啶继续培养;加入秋水仙素,继续培养至收获。
步骤2:淋巴细胞收获:离心弃去上清液;加入分散液(中国专利CN201910061346)8ml,离心。
步骤3:制备细胞悬液:预固定:沿管壁加入1ml固定液;固定:离心,去上清液,加入10ml固定液,固定15分钟;离心,去上清液,用固定液制备细胞悬液。
步骤4:制片:将细胞悬液滴加在载玻片上;烤片2小时。
步骤5:G带染色:经胰酶解析(中国专利CN201910061438)染色体带纹,使用制备高分辨染色体染液(中国专利CN201910061347)染色,即可完成染色体制备。
对实施例1各组分别进行统计,基于镜下中期分裂相核型分辨率进行分组,染色体分辨率4个区间参考标准分别为:400BPHS以2条9号染色体q31-33均出现3条带; 550BPHS以7号和10号染色体q21均出现3条带;700BPHS以2条10号染色体q11.2均出现3条带;850BPHS以2条21号染色体q22.1均出现3条带为准(参考书Lisa G.Shaffer et al.AnInternatioanal System for Human Cytogentic Nomenclature,2016;21-35.)。七组统计结果见图1。
由图1可知,随着RO-3306药物浓度梯度递增,超长染色体细胞850BPHS的占比存在增加趋势,700BPHS和550BPHS细胞占比存在递增趋势。各实验组与对照组比较,均可提高超长染色体比例。得以证实低浓度的RO-3306具有能提高超长染色体细胞比例的效果。
初步确定了RO-3306可以提高超长染色体细胞的比例。而后需要进一步解决染色体舒展性,进而降低染色体严重扭曲现象,提高染色体的识别度。考虑到染色体主要由脱氧核糖核酸(DNA)和组蛋白组成,首先我们选择了染色体DNA两种不同修饰。磷酸化调节试剂,比如S-腺甘基蛋氨酸(S-Adenosylmethionine ,AdoMet)等;DNA甲基化调节试剂,比如吴茱萸碱(Evodiamine),5-azacytidine (5-AZA)等。其次对染色体组蛋白修饰-乙酰化,进行试验,筛选到的ITSA-1,Vorinostat (SAHA)和Trichostatin A (TSA)等,不限于AdoMet、5-AZA、ITSA-1和TSA做的具体实施例中。首先开始AdoMet实验,见实施例2。
实施例2
我们实验设计选择AdoMet一系列的工作浓度梯度为0mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、8mmol/L。作用时间随机设为20h。0mmol/L组是工作浓度为溶剂DMSO。试验阶段,为了便于制备及快速统计数据,提高效率,均未加入9-氨基吖啶。
本发明使用AdoMet制备外周血细胞染色体的方法:
其中,所述的AdoMet:
实验组7 AdoMet浓度为1mmol/L。
实验组8 AdoMet浓度为2mmol/L。
实验组9 AdoMet浓度为4mmol/L。
实验组10 AdoMet浓度为8mmol/L。
对照组2 AdoMet浓度为0mmol/L。
使用AdoMet制备外周血细胞染色体的方法步骤如下:
步骤1:外周血接种培养:将人外周血细胞置37 ℃培养46-52小时;分别加入各实验组使用AdoMet到培养管中,对照组不加AdoMet。混匀继续培养20h;加入秋水仙素,继续培养至收获。
步骤2:淋巴细胞收获:离心弃去上清液;加入分散液(中国专利CN201910061346)8ml,离心。
步骤3:制备细胞悬液:预固定:沿管壁加入1ml固定液;固定:离心,去上清液,加入10ml固定液,固定15分钟;离心,去上清液,用固定液制备细胞悬液。
步骤4:制片:将细胞悬液滴加在载玻片上;烤片2小时。
步骤5:G带染色:经胰酶解析(中国专利CN201910061438)染色体带纹,使用制备高分辨染色体染液(中国专利CN201910061347)染色,即可完成染色体制备。
经过连续分别3次实验,分别4个AdoMet工作浓度实验组和1个对比组,统计结果的效果见表1。我们从伸长细胞染色体,提高染色体分辨率来作为判断舒展染色体效果之一。实验组与对比组比较,在≤400BPHS和550BPHS区间,均不存在统计学差异。说明AdoMet不能提高染色体分辨率,舒展染色体。
表1:统计不同工作浓度的AdoMet对染色体扭曲及每套单倍体条带数(BPHS)细胞占比的效果。
接着进行了5-AZA药物实验,如下实施例3。
实施例3
实验设计5-AZA的工作浓度梯度为0μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L。0μmol/L组是工作浓度为溶剂DMSO。
本发明使用5-AZA制备外周血细胞染色体的方法:
其中,所述的5-AZA:
实验组11 5-AZA浓度为0.1μmol/L。
实验组12 5-AZA浓度为0.2μmol/L。
实验组13 5-AZA浓度为0.4μmol/L。
实验组14 5-AZA浓度为0.8μmol/L。
对照组3 5-AZA浓度为0μmol/L。
使用5-AZA制备外周血细胞染色体的步骤如下:
步骤1:外周血接种培养:将人外周血细胞置37 ℃培养46-52小时;分别加入各实验组使用5-AZA到培养管中,对照组不加5-AZA。混匀继续培养20h;加入秋水仙素,继续培养至收获。
步骤2:淋巴细胞收获:离心弃去上清液;加入分散液(中国专利CN201910061346)8ml,离心。
步骤3:制备细胞悬液:预固定:沿管壁加入1ml固定液;固定:离心,去上清液,加入10ml固定液,固定15分钟;离心,去上清液,用固定液制备细胞悬液。
步骤4:制片:将细胞悬液滴加在载玻片上;烤片2小时。
步骤5:G带染色:经胰酶解析(中国专利CN201910061438)染色体带纹,使用制备高分辨染色体染液(中国专利CN201910061347)染色,即可完成高质量染色体制备。
经过连续分别3次实验,分别4个5-AZA工作浓度实验组和1个对比组,统计结果的效果见表2。实验组与对比组比较,在≤400BPHS和550BPHS区间,均不存在统计学差异。说明5-AZA也不能提高染色体分辨率,舒展染色体。
表2:统计不同工作浓度的5-AZA对染色体扭曲及每套单倍体条带数(BPHS)细胞占比的效果。
然后进一步实验ITSA-1,结果见实施例4。
实施例4
实验设计ITSA-1的工作浓度为0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L。0μmol/L组是工作浓度为溶剂DMSO。
本发明使用ITSA-1制备外周血细胞染色体的方法:
其中,所述的ITSA-1:
实验组15 ITSA-1浓度为400μmol/L。
实验组16 ITSA-1浓度为200μmol/L。
实验组17 ITSA-1浓度为100μmol/L。
实验组18 ITSA-1浓度为50μmol/L。
对照组4 ITSA-1浓度为0μmol/L。
使用ITSA-1制备外周血细胞染色体的步骤如下:
步骤1:外周血接种培养:将人外周血细胞置37 ℃培养46-52小时;分别加入各实验组使用ITSA-1到培养管中,对照组不加ITSA-1。混匀继续培养20h;加入秋水仙素,继续培养至收获。
步骤2:淋巴细胞收获:离心弃去上清液;加入分散液(中国专利CN201910061346)8ml,离心。
步骤3:制备细胞悬液:预固定:沿管壁加入1ml固定液;固定:离心,去上清液,加入10ml固定液,固定15分钟;离心,去上清液,用固定液制备细胞悬液。
步骤4:制片:将细胞悬液滴加在载玻片上;烤片2小时。
步骤5:G带染色:经胰酶解析(中国专利CN201910061438)染色体带纹,使用制备高分辨染色体染液(中国专利CN201910061347)染色,即可完成染色体制备。
经过连续分别3次实验,分别4个ITSA-1工作浓度实验组和1个对比组,统计结果的效果见表3。随着ITSA-1浓度增加,550BPHS细胞呈递减趋势。而实验组与对比组比较,染色体扭曲均在增加。说明ITSA-1也不能舒展染色体,反而却增加染色体扭曲,抑制染色体舒展。同时也具有缩短染色体作用。
表3:统计不同工作浓度的ITSA-1对染色体扭曲及每套单倍体条带数(BPHS)细胞占比的效果。
于是我们根据药物ITSA-1为HDAC激活剂的这个原理,找到其相反作用的药物,即HDAC抑制剂TSA,进行试验,结果见实施例5。
实施例5
实验设计TSA,一系列的工作浓度梯度为0nmol/L、25nmol/L、50nmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L 6组。0nmol/L组是工作浓度为溶剂DMSO。
本发明使用TSA制备外周血细胞染色体的方法:
其中,所述的TSA:
实验组19 TSA浓度为25nmol/L。
实验组20 TSA浓度为50nmol/L。
实验组21 TSA浓度为0.1μmol/L。
实验组22 TSA浓度为0.2μmol/L。
实验组23 TSA浓度为0.4μmol/L。
对照组5 TSA浓度为0nmol/L。
使用TSA制备外周血细胞染色体的步骤如下:
步骤1:外周血接种培养:将人外周血细胞置37 ℃培养46-52小时;分别加入各实验组使用TSA到培养管中,对照组不加TSA。混匀继续培养;加入9-氨基吖啶继续培养;加入秋水仙素,继续培养至收获。
步骤2:淋巴细胞收获:离心弃去上清液;加入分散液8ml,离心。
步骤3:制备细胞悬液:预固定:沿管壁加入1ml固定液;固定:离心,去上清液,加入10ml固定液,固定15分钟;离心,去上清液,用固定液制备细胞悬液。
步骤4:制片:将细胞悬液滴加在载玻片上;烤片2小时。
步骤5:G带染色:经胰酶解析(中国专利CN201910061438)染色体带纹,使用制备高分辨染色体染液(中国专利CN201910061347)染色,即可完成高质量染色体制备。
经过连续分别3次实验,分别5个TSA工作浓度实验组和1个对比组,统计结果的效果见表4。实验组与对比组比较,细胞染色体扭曲均降低。说明TSA能明显舒展染色体。随着TSA药物浓度梯度递增,700BPHS和550BPHS细胞占比均存在递增趋势。实验组与对照组比较,均可提高超长染色体比例。初步得以证实TSA具有能提高超长染色体细胞比例的效果。
表4:统计不同工作浓度的TSA对染色体扭曲及每套单倍体条带数(BPHS)细胞占比的效果。
首先考虑初步筛选到的RO-3306可以提高超长染色体细胞比例,而文献L.T.Vassilev,et al.Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitoticfunctions of human CDK1.PNAS (2006)103(28),10660–10665.则理论支持RO-3306抑制CDK1磷酸激酶的最佳浓度10μmol/L,于是选择梯度浓度0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L和0.1mmol/L。其次也初步实验验证了TSA既可以舒展染色体,降低超长染色体扭曲现象,同时又可以伸长提升超长染色体细胞比例。根据其药物半抑制浓度(或称半抑制率),即IC50,范围为1.8nmol/L。进而我们确定范围浓度附近浓度为2nmol/L为起始,纳入以上实验TSA有效浓度0.2μmol/L,故选择梯度浓度2nmol/L、20nmol/L、0.2μmol/L和2μmol/L。综合以上所以我们选择这两个药物的有效浓度为HD850试剂,进行试验,作一系列浓度配比梯度,不限于这些浓度梯度配比作具体实施例中。实验结果能明显提高超长染色体细胞比例,效率比较各药物单独使用效率高出许多。
实施例6
本发明使用HD850试剂制备外周血细胞染色体的方法:
其中,所述的HD850试剂:
实验组24 HD850试剂是RO-3306浓度为0.1μmol/L,TSA浓度为2nmol/L。
实验组25 HD850试剂是RO-3306浓度为1μmol/L,TSA浓度为20nmol/L。
实验组26 HD850试剂是RO-3306浓度为10μmol/L,TSA浓度为0.2μmol/L。
实验组27 HD850试剂是RO-3306浓度为0.1mmol/L,TSA浓度为2μmol/L。
使用HD850试剂制备外周血细胞染色体的步骤如下:
步骤1:外周血接种培养:将人外周血细胞置37 ℃培养46-52小时;分别加入各实验组HD850试剂到培养管中,混匀继续培养24h;加入9-氨基吖啶继续培养;加入秋水仙素,继续培养至收获。
步骤2:淋巴细胞收获:离心弃去上清液;加入分散液(中国专利CN201910061346)8ml,离心。
步骤3:制备细胞悬液:预固定:沿管壁加入1ml固定液;固定:离心,去上清液,加入10ml固定液,固定15分钟;离心,去上清液,用固定液制备细胞悬液。
步骤4:制片:将细胞悬液滴加在载玻片上;烤片2小时。
步骤5:G带染色:经胰酶解析(中国专利CN201910061438)染色体带纹,使用制备高分辨染色体染液(中国专利CN201910061347)染色,即可完成高质量染色体制备。
对实施例6各组分别进行统计,基于镜下中期分裂相核型分辨率进行分组。4组统计结果见图2:
本发明不同浓度HD850试剂实验组,超长染色体细胞850BPHS的占比均在20%以上,700BPHS细胞占比也均在10%以上,550BPHS细胞占比也均在30%以上。
确定了两个药物浓度比组合更具优势,不光能提高550、700和850 BPHS染色体细胞比例,而且也能舒展超长染色体,降低超长染色体扭曲现象。为了探索两种药物浓度的有效配比范围,我们的后续实验随机组合两药物浓度比和作用时间。参见以下的实施例,并且我们的实验也不仅仅限于这些浓度比和下面的具体实施例。
实施例7
使用HD850试剂制备外周血细胞染色体的方法步骤如下:
步骤1:外周血接种培养:将人外周血细胞置37 ℃培养46-52小时;加入HD850试剂到培养管中,其中RO-3306浓度为0.1μmol/L,TSA浓度为2nmol/L,混匀继续培养;加入9-氨基吖啶继续培养;加入秋水仙素,继续培养至收获。
步骤2:淋巴细胞收获:离心弃去上清液;加入分散液(中国专利CN201910061346)8ml,离心。
步骤3:制备细胞悬液:预固定:沿管壁加入1ml固定液;固定:离心,去上清液,加入10ml固定液,固定15分钟;离心,去上清液,用固定液制备细胞悬液。
步骤4:制片:将细胞悬液滴加在载玻片上;烤片2小时。
步骤5:G带染色:经胰酶解析(中国专利CN201910061438)染色体带纹,使用制备高分辨染色体染液(中国专利CN201910061347)染色,即可完成高质量染色体制备。
对于实施例7的实验结果由图 3可见,采用本发明HD850试剂及方法制备的外周血细胞染色体,分辨率高比例≥850 BPHS ,染色体分散、显带和染色效果均好。
实施例8
使用HD850试剂制备外周血细胞染色体的方法,具体步骤如下:
步骤1:外周血接种培养:将人外周血细胞置37 ℃培养46-52小时;加入HD850试剂到培养管中,该试剂的RO-3306浓度为1μmol/L,TSA浓度为20nmol/L,混匀继续培养;加入9-氨基吖啶继续培养;加入秋水仙素,混匀细胞。继续培养至收获。
步骤2:淋巴细胞收获:离心弃去上清液;加入分散液(中国专利CN201910061346)8ml,离心。
步骤3:制备细胞悬液:预固定:沿管壁加入1ml固定液;固定:离心,去上清液,加入10ml固定液,固定15分钟;离心,去上清液,用固定液制备细胞悬液。
步骤4:制片:将细胞悬液滴加在载玻片上;烤片2小时。
步骤5:G带染色:经胰酶解析(中国专利CN201910061438)染色体带纹,使用制备高分辨染色体染液(中国专利CN201910061347)染色,即可完成高质量染色体制备。
实施例8对比试验
对照组溴化乙锭的核型制备方法,具体步骤如下:
步骤1:外周血接种培养:将人外周血细胞置37 ℃培养46-52小时;加入终浓度为溴化乙锭1μg/ml(文献Benn P, Delach J. Human lymphocyte culture and chromosomeanalysis. CSH Protoc. 2008 Sep 1;2008:pdb.prot5035.,继续培养2小时;加入秋水仙素,继续培养至收获。
步骤2:淋巴细胞收获:离心弃去上清液;加入分散液(中国专利CN201910061346)8ml,离心。
步骤3:制备细胞悬液:预固定:沿管壁加入1ml固定液;固定:离心,去上清液,加入10ml固定液,固定15分钟;离心,去上清液,用固定液制备细胞悬液。
步骤4:制片:将细胞悬液滴加在载玻片上;烤片2小时。
步骤5:G带染色:经胰酶解析(中国专利CN201910061438)染色体带纹,使用制备高分辨染色体染液(中国专利CN201910061347)染色,即可完成高质量染色体制备。
对实施例8(HD850试剂组)与对照实验(溴化乙锭)分别进行统计,基于镜下中期分裂相核型分辨率进行分组。两组统计结果见图4。
结果显示,HD850试剂与溴化乙锭组比较,本发明实验组,超长染色体细胞850BPHS的占比显著性升高,700BPHS细胞占比有差异性。常规溴化乙锭组染色体核型富集在400BPHS。
实施例9
使用HD850试剂制备外周血细胞染色体的方法,具体步骤如下:
步骤1:外周血接种培养:将人外周血细胞置37 ℃培养46-52小时;加入HD850试剂到培养管中,该试剂的RO-3306浓度为10μmol/L,TSA浓度为0.2μmol/L,混匀继续培养;加入9-氨基吖啶继续培养;加入秋水仙素,混匀细胞。继续培养至收获。
步骤2:淋巴细胞收获:离心弃去上清液;加入分散液(中国专利CN201910061346)8ml,离心。
步骤3:制备细胞悬液:预固定:沿管壁加入1ml固定液;固定:离心,去上清液,加入10ml固定液,固定15分钟;离心,去上清液,用固定液制备细胞悬液。
步骤4:制片:将细胞悬液滴加在载玻片上;烤片2小时。
步骤5:G带染色:经胰酶解析(中国专利CN201910061438)染色体带纹,使用制备高分辨染色体染液(中国专利CN201910061347)染色,即可完成高质量染色体制备。
实施例10
使用HD850试剂制备外周血细胞染色体的方法,具体步骤如下:
步骤1:外周血接种培养:将人外周血细胞置37 ℃培养46-52小时;加入HD850试剂到培养管中,该试剂的RO-3306浓度为0.1mmol/L,TSA浓度为2μmol/L,混匀继续培养;加入9-氨基吖啶继续培养;加入秋水仙素,继续培养至收获。
步骤2:淋巴细胞收获:离心弃去上清液;加入分散液(中国专利CN201910061346)8ml,离心。
步骤3:制备细胞悬液:预固定:沿管壁加入1ml固定液;固定:离心,去上清液,加入10ml固定液,固定15分钟;离心,去上清液,用固定液制备细胞悬液。
步骤4:制片:将细胞悬液滴加在载玻片上;烤片2小时。
步骤5:G带染色:经胰酶解析(中国专利CN201910061438)染色体带纹,使用制备高分辨染色体染液(中国专利CN201910061347)染色,即可完成高质量染色体制备。
实施例10对比试验
尽管高浓度溴化乙锭使大量中期分裂相细胞凋亡,无法进一步统计各分辨率细胞,但偶见850 BPHS细胞。
对照组溴化乙锭的核型制备方法,具体步骤如下:
步骤1:外周血接种培养:将人外周血细胞置37 ℃培养46-52小时;加入高浓度为溴化乙锭10μg/ml[文献Sawyer, J. (1995). High resolution mid-prophase humanchromosomes induced by echinomycin and ethidium bromide. Human Genetics, 95(1).],继续培养2小时;加入秋水仙素,继续培养至收获。
步骤2:淋巴细胞收获:离心弃去上清液;加入分散液(中国专利CN201910061346)8ml,离心。
步骤3:制备细胞悬液:预固定:沿管壁加入1ml固定液;固定:离心,去上清液,加入10ml固定液,固定15分钟;离心,去上清液,用固定液制备细胞悬液。
步骤4:制片:将细胞悬液滴加在载玻片上;烤片2小时。
步骤5:G带染色:经胰酶解析(中国专利CN201910061438)染色体带纹,使用制备高分辨染色体染液(中国专利CN201910061347)染色,即可完成高质量染色体制备。
由图 5可见,实施例10的实验结果,采用本发明的超高染色体核型制备试剂和方法,实验结果和报告质量显著优于传统试剂和方法。图5(A)为采用本发明HD850试剂及方法制备的外周血细胞染色体,分辨率高比例≥850 BPHS ,染色体舒展好,扭曲明显减少、显带和染色效果均好。而图5(B)为传统试剂溴化乙锭及方法制备的外周血细胞染色体,分辨率高比例≥850 BPHS 的染色体严重扭曲,很难辨别染色体,显带和染色效果均差。
在使用HD850试剂制备外周血细胞染色体的同时,我们还做了一些列其他类型细胞试验,比如贴壁细胞的干细胞,羊水细胞和成纤维细胞等,技术效果也同外周血细胞。
实施例11
使用HD850试剂制备干细胞(贴壁细胞)染色体的方法,具体步骤如下:
步骤1:培养:加入HD850试剂到培养瓶中,继续培养;加入9-氨基吖啶继续培养;加入秋水仙素,继续培养至收获。
步骤2:干细胞收获:转移瓶内培养液至新15ml离心管内后,瓶内加入胰蛋白酶消化处理;消化细胞后,加入原培养液终止,并倒回原离心管内;离心弃去上清液;加入分散液(中国专利CN201910061346)8ml,离心。
步骤3:制备细胞悬液:预固定:沿管壁加入1ml固定液,混匀;离心,去上清液,加入10ml固定液,固定15分钟;离心,去上清液,用固定液制备细胞悬液。
步骤4:制片:将细胞悬液滴加在载玻片上;烤片2小时。
步骤5:G带染色:经胰酶解析(中国专利CN201910061438)染色体带纹,使用制备高分辨染色体染液(中国专利CN201910061347)染色,即可完成高质量染色体制备。
实施例12
使用HD850试剂制备羊水细胞染色体的方法,具体步骤如下:
步骤1:培养:加入HD850试剂到培养瓶中,继续培养;加入9-氨基吖啶继续培养;加入秋水仙素,继续培养至收获。
步骤2:羊水细胞收获:转移瓶内培养液至新15ml离心管内后,瓶内加入胰蛋白酶消化处理;消化细胞后,加入原培养液终止,并倒回原离心管内;离心弃去上清液;加入分散液(中国专利CN201910061346)8ml,离心。
步骤3:制备细胞悬液:预固定:沿管壁加入1ml固定液,混匀;离心,去上清液,加入10ml固定液,固定15分钟;离心,去上清液,用固定液制备细胞悬液。
步骤4:制片:将细胞悬液滴加在载玻片上;烤片2小时。
步骤5:G带染色:经胰酶解析(中国专利CN201910061438)染色体带纹,使用制备高分辨染色体染液(中国专利CN201910061347)染色,即可完成超高分辨染色体制备。
参见图 6,采用本发明的超高染色体核型制备试剂和方法,实验结果和报告质量显著优于传统试剂和方法。图6(A)为其它医学检测机构原诊断,诊断结果是9号染色体倒位以及9号和11号染色体间平衡易位。图6(B)为使用本发明试剂和方法,诊断结果显示为9号和Y染色体间平衡易位,不存在9号染色体倒位情形。应用本发明试剂和方法纠正了一例错诊和误诊。可见由于检测方法分辨率的差别,得到的诊断结果不同,临床生殖医生可能给病人的治疗意见完全不同。
参见图 7,图7(A)为其它医学检测机构原诊断为正常男性核型。图7(B)为使用本发明检测后,显示患者携带4号和17号染色体间平衡易位,后又经过流产物CNV检测结果也已间接证实。由于检测方法分辨率的差别,可能获得错误的诊断结果,进一步使得生殖医生对患者给出错误的治疗意见。
上述的实施例对本发明一种用于制备超高分辨染色体的复合试剂及其应用方法进行的详细描述,是说明性的而不是限定性的,因此,在不脱离本发明总体构思下的变化和修饰,皆属本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种用于制备超高分辨染色体的复合试剂,其特征在于,由以下组分组成:RO-3306:0.1μmol/L~0.1mmol/L,TSA:2nmol/L~2μmol/L,溶剂为DMSO,命名为HD850试剂。
2.根据权利要求1所述的用于制备超高分辨染色体的复合试剂,其特征在于,所述的RO-3306:0.1μmol/L,TSA:2nmol/L。
3.根据权利要求1所述的用于制备超高分辨染色体的复合试剂,其特征在于,所述的RO-3306: 1μmol/L,TSA:20nmol/L。
4.根据权利要求1所述的用于制备超高分辨染色体的复合试剂,其特征在于,所述的RO-3306: 10μmol/L,TSA:0.2μmol/L。
5.根据权利要求1所述的用于制备超高分辨染色体的复合试剂,其特征在于,所述的RO-3306:0.1mmol/L,TSA:2μmol/L。
6.权利要求1所述的用于制备超高分辨染色体的复合试剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
a)配制RO-3306储藏液:在1.5ml棕色管中加入10mgRO-3306,用948.5μlDMSO溶解后,-20℃保存;
b)配制TSA储藏液:在1.5ml棕色管中加入10mgTSA,用826.8μlDMSO溶解后,-20℃保存;
c)配制试剂成品:在1.5ml棕色管中加入397μl RO-3306储藏液和3μlTSA储藏液,再加入800μl DMSO混匀,-20℃保存,即为试剂成品,命名为HD850试剂。
7.权利要求1所述的用于制备超高分辨染色体的复合试剂在制备外周血细胞超高分辨染色体的应用方法,其特征在于,步骤如下:
步骤1:将人外周血细胞置37 ℃培养46-52小时;加入一定量HD850试剂到培养管中,继续培养16-24小时;加入9-氨基吖啶,继续培养0.5-6小时;加入秋水仙素,继续培养至收获;
步骤2:细胞收获:离心弃去上清液;加入分散液8ml,离心;
步骤3:制备细胞悬液:预固定:沿管壁加入1ml固定液;固定:离心,去上清液,加入10ml固定液,固定15分钟;离心,去上清液,用固定液制备细胞悬液;
步骤4:制片:将细胞悬液滴加在载玻片上;烤片2小时;
步骤5:G带染色:经胰酶解析染色体带纹,使用制备高分辨染色体染液染色,完成超高分辨染色体的制备。
8.权利要求1所述的用于制备超高分辨染色体的复合试剂在制备干细胞超高分辨染色体的应用方法,其特征在于,步骤如下:
步骤1:培养:加入HD850试剂到培养瓶中,继续培养;加入9-氨基吖啶继续培养;加入秋水仙素,继续培养至收获;
步骤2:干细胞收获:转移瓶内培养液至新15ml离心管内后,瓶内加入胰蛋白酶消化处理;消化细胞后,加入原培养液终止,并倒回原离心管内;离心弃去上清液;加入分散液8ml,离心;
步骤3:制备细胞悬液:预固定:沿管壁加入1ml固定液,混匀;离心,去上清液,加入10ml固定液,固定15分钟;离心,去上清液,用固定液制备细胞悬液;
步骤4:制片:将细胞悬液滴加在载玻片上;烤片2小时;
步骤5:G带染色:经胰酶解析染色体带纹,高分辨染色体染液染色,完成超高分辨染色体的制备。
9.权利要求1所述的用于制备超高分辨染色体的复合试剂在制备羊水细胞超高分辨染色体的应用方法,其特征在于,步骤如下:
步骤1:培养:加入HD850试剂到培养瓶中,继续培养;加入9-氨基吖啶继续培养;加入秋水仙素,继续培养至收获;
步骤2:羊水细胞收获:转移瓶内培养液至新15ml离心管内后,瓶内加入胰蛋白酶消化处理;消化细胞后,加入原培养液终止,并倒回原离心管内;离心弃去上清液;加入分散液8ml,离心;
步骤3:制备细胞悬液:预固定:沿管壁加入1ml固定液,混匀;离心,去上清液,加入10ml固定液,固定15分钟;离心,去上清液,用固定液制备细胞悬液;
步骤4:制片:将细胞悬液滴加在载玻片上;烤片2小时;
步骤5:G带染色:经胰酶解析染色体带纹,使用制备高分辨染色体染液染色,即可完成超高分辨染色体制备。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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