CN109540644B - 核型分析制备高分辨染色体分散液 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核型分析专用制备高分辨染色体分散液及其制备方法。核型分析专用制备高分辨染色体分散液，其特征在于：由以下组分组成：Tris‑HCL 0.05～1mmol/L，pH为7.5～10.0；KCl 2～8g/L，溶剂为三蒸水。本发明核型分析专用制备高分辨染色体分散液对淋巴细胞染色体的铺展分散效果非常好，尤其对高分辨和超高分辨染色体核型分析减少了染色体之间的交叉和重叠个数，极大地提高了分析染色体核型的质量。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及核型分析制备高分辨染色体分散液。
背景技术
染色体是基因的载体，正常人类细胞中共有23对46条染色体，其中22对44条为常染色体，另1对为2条性染色体。染色体可能发生数量和结构性改变，从而引起各种遗传缺陷、先天性遗传病、胚胎停育及自然流产、肿瘤等等。由染色体异常所引起的疾病一般被称为染色体病。
染色体检测目前在临床中多用于生殖、妇产、新生儿、血液病、肿瘤等专业。使用细胞培养后染色体显带技术诊断遗传病，虽然方法相对简单，但仍然是产前诊断的金标准。正常结果是男性46,XY，女性46,XX，除此之外的结果均为异常的。
染色体核型分析主要分为细胞培养、收获、制片、显带和分析几个步骤。其中，在收获细胞的过程中需要进行低渗处理，即利用水分子在半透膜间定向扩散的渗透现象，使细胞外的水分子不断向细胞内扩散，从而达到使有核细胞膨胀的目的。早在1952年，美籍华裔学者徐道觉首次发现低浓度氯化钾KCl溶液有助于染色体铺展和辨别形态特征。而在这之前，由于技术限制，核型分析时染色体难以分散，导致学界长期普遍认为人类有48条染色体。由此可见低渗环节对染色体分散至关重要，关乎染色体核型分析的成败。
现在制备染色体时普遍使用的0.075mol/L KCl(等价质量工作浓度为5.9g/L)低渗溶液已经60多年未变，但是对于高分辨和超高分辨染色体的铺展分散并不理想，分散差会使染色体交叉、叠压或缠绕在一起，难以辨别染色体，降低分析工作效率，甚至导致分析染色体核型失败。尽管Ohnuki在1968采用冈氏分散液处理细胞，对细胞染色体铺展有一定的帮助，其副作用是姐妹染色体长臂及短臂容易分开，且条带模糊不清，染色体的条带辨认困难，核型分析失败的几率非常高。
为了优化染色体的分散度，在CN 103308361 B专利中，细胞低渗30分钟。在CN103710434 B和CN 103710435 B专利里，0.075mol/L KCl溶液低渗细胞20-30分钟。一是低渗时间较长；二是低渗300-400每套单倍体条带数目(Bands Per Haploid Set，BPHS)，低于高分辨的染色体，效果可以，因染色体较短，容易分开。但是对高分辨或超高分辨染色体，较长的染色体分散效果非常差，染色体缠绕叠压在一起，很难分辨染色体，容易导致发染色体报告失败。至于低渗时间，Ikeuchi在文献中报道0.075mol/L KCl低渗细胞，30分钟。张清健等认为0.075mol/L KCl溶液低渗时间定为40分钟为最佳条件。低渗液处理细胞时间的长短对染色体结构及显带效果影响非常大，处理时间超过20分钟或太长，将导致姐妹染色单体分离比例明显增加(Ikeuchi，2004)，且很难观察到染色体的详细带纹。本发明目的在于开发一种专门用于制备高分辨染色体的分散液，既可减少染色体的交叉重叠缠绕，又避免人为造成姐妹染色单体分离影响显带分析。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了核型分析制备高分辨染色体分散液，本发明的分散液无论化学成分、理化特性和使用方法均与传统的低渗液不同。我们在研发过程中反复试验了EGTA、HEPES、Tris-EDTA、氯化铵、六偏磷酸钠和Tris-HCl等溶液。最终选择了Tris-HCl缓冲液做为基础液最佳，外周血淋巴细胞高分辨染色体铺展及分散效果最好，也使得显微镜下高分辨染色体的形态特征清晰可辨。与传统的0.075mol/L KCl低渗液相比，大大减少染色体的交叉重叠率。有效地提高了高分辨染色体质量和工作的效率。
本发明的目的之一是提供一种核型分析制备高分辨染色体分散液。
本发明的目的还在于提供所述的核型分析制备高分辨染色体分散液的制备方法以及应用所述的核型分析制备高分辨染色体分散液制备染色体的方法。
本发明的目的是这样实现的：
核型分析制备高分辨染色体分散液，其特征在于：由以下组分组成：Tris-HCL0.05～1mmol/L，pH为7.5～10.0；KCl 2～8g/L，溶剂为三蒸水。
本发明的目的还可以这样实现：Tris-HCL 0.5mmol/L，pH为8.0；KCl 4g/L，溶剂为三蒸水。
核型分析制备高分辨染色体分散液的制备方法，其特征在于：由下述原料配比制备而成：
A、称量配比的原料：KCl 2-8g；
B、将以上原料溶解至1000ml三蒸水中，充分溶解；
C、加入0.05～1mmol/L Tris-HCL，混匀；
D、4℃保存。
核型分析制备高分辨染色体分散液的制备方法，其中优选方案之一：
A、称量配比的原料：KCl 4g；
B、将以上原料溶解至1000ml三蒸水中，充分溶解；
C、加入0.5mmol/L Tris-HCL，混匀；
D、4℃保存。
核型分析制备高分辨染色体分散液制备染色体的方法，包括如下步骤：
步骤1：淋巴细胞接种培养：将人体外周血0.3ml-0.45ml在接种架上接种到培养管中，置37℃培养66-72小时，收获前分别加入HD550、秋水仙素，混匀；继续培养至收获；
步骤2：淋巴细胞收获：
2.1.收获时，将培养管放入离心机内，离心1100rpm，10min；弃去上清液；
2.2.分散染色体：弹打混匀细胞，加入预热到37℃的分散液5-10ml，弹打混匀细胞，37℃处理10-20分钟，离心1100rpm，10min；
步骤3：制备细胞悬液
3.1.预固定：立即沿管壁迅速加入预热到37℃的1ml固定液，混匀；
3.2.离心1100rpm，10min；去上清液，加入10ml固定液，混匀细胞，于37℃固定15min；
3.3.离心1100rpm，10min；去上清液，加入9ml固定液，混匀细胞；
3.4.离心1100rpm，10min；去上清液，重新加入新鲜固定液，弹打混匀细胞，按细胞计数留适量固定液，即每600μl固定液8万细胞，制成细胞悬液；
步骤4：制片
4.1.滴片时，吸取细胞悬液，滴加在载玻片上，过酒精灯火焰2次后，显微镜下观察滴片效果，制得染色体标本；
4.2.将制好的玻片放入烤箱内烘烤；
步骤5：G带染色：将烘烤后冷却的样本玻片，经胰酶消化，染色，分析染色体核型。
所述的核型分析制备高分辨染色体分散液制备染色体的方法，优选方案之一：所述的分散液成分为：Tris-HCL 0.5mmol/L，pH为8.0；KCl 4g/L，溶剂为三蒸水。
所述的核型分析制备高分辨染色体分散液制备染色体的方法优选方案之二，其特征在于：
步骤2：淋巴细胞收获：
2.1.收获时，将培养管放入离心机内，离心1100rpm，10min；弃去上清液；
2.2.分散染色体：弹打混匀细胞，加入预热到37℃的分散液5-10ml，弹打混匀细胞，37℃处理20分钟，离心1100rpm，10min。
本发明的有益效果是：核型分析制备高分辨染色体分散液对淋巴细胞染色体的铺展分散效果非常好，尤其对高分辨和超高分辨染色体核型分析减少了染色体之间的交叉和重叠个数，极大地提高了分析染色体核型的质量。
附图说明
图1是本发明分散液处理染色体550BPHS细胞的1000倍显微放大图；
图2是0.075mol/L KCl低渗液处理染色体550BPHS细胞的1000倍显微放大图；
图3是本发明分散液处理染色体700BPHS细胞的1000倍显微放大图；
图4是0.075mol/L KCl低渗液处理染色体700BPHS细胞的1000倍显微放大图；
图5是本发明分散液处理普通染色体细胞的1000倍显微放大图；
图6是0.075mol/L KCl低渗液处理普通染色体细胞的1000倍显微放大图；
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。
本发明所涉及到的核型分析制备高分辨染色体分散液：所含各物质的含量分别为:Tris-HCl 0.05mmol/L～1mmol/L(pH值为7.5～10.0)，KCl 2g/L-8g/L。
本发明所涉及到的核型分析制备高分辨染色体分散液；分散细胞染色体时间为10-20分钟。
我们实施实验独创性地使用pH值为7.5～10.0的分散液，碱性pH值对染色体分散至关重要，由于已知每条染色体本身因大量的磷酸基团带有负电荷，所以染色体在碱性pH值OH-的环境里，每条染色体会因为都带有超负荷的相同电荷，而产生排斥作用，导致每条染色体分散。在水溶液中能形成碱性pH值为8.0的物质，包括EGTA、HEPES、Tris-EDTA、氯化铵、六偏磷酸钠和Tris-HCl等等。不限于HEPES、氯化铵、六偏磷酸钠和Tris-HCl作具体实施例中。HEPES粉末由1mol/L氢氧化钠溶液溶解且调节pH值为8.0。选择HEPES一系列的工作浓度梯度为0mmol/L、0.1mmol/L、0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L 5组。0mmol/L组是随机工作浓度为4g/L KCl低渗液。
实施例1
核型分析制备高分辨染色体分散液，其特征在于：由以下组分组成：
HEPES 1mol/L，pH为8.0；KCl 4g/L，溶剂为三蒸水1L。
其中，它是由下述配比的原料制备而成:
A、称量配比的原料：KCl 4g；
B、将以上原料溶解至1000ml三蒸水中，充分溶解；
C、加入0～1mmol/L HEPES，混匀；
D、4℃保存。
实验组1的分散液是HEPES工作浓度为0.1mmol/L，KCl工作浓度为4g/L。
实验组2的分散液是HEPES工作浓度为0.25mmol/L，KCl工作浓度为4g/L。
实验组3的分散液是HEPES工作浓度为0.5mmol/L，KCl工作浓度为4g/L。
实验组4的分散液是HEPES工作浓度为1mmol/L，KCl工作浓度为4g/L。
对比组1的分散液是HEPES工作浓度为0mmol/L，KCl工作浓度为4g/L。
制备高分辨染色体的流程，包括如下步骤：
步骤1：淋巴细胞接种培养：将人体外周血0.3ml-0.45ml在接种架上接种到培养管中，置37℃培养66-72小时，收获前分别加入HD550、秋水仙素，混匀。继续培养至收获。
步骤2：淋巴细胞收获：
2.1.收获时，将培养管放入离心机内，离心1100rpm，10min。弃去上清液；
2.2.分散染色体：弹打混匀细胞，加入预热到37℃的分散液10ml，弹打混匀细胞，37℃处理20分钟，离心1100rpm，10min。
步骤3：制备细胞悬液
3.1.预固定：立即沿管壁迅速加入预热到37℃的1ml固定液，混匀；
3.2.离心1100rpm，10min；去上清液，加入10ml固定液，混匀细胞，于37℃固定15min；
3.3.离心1100rpm，10min；去上清液，加入9ml固定液，混匀细胞；
3.4.离心1100rpm，10min；去上清液，重新加入新鲜固定液，弹打混匀细胞，按细胞计数留适量固定液，即每600μl固定液8万细胞，制成细胞悬液。
步骤4：制片
4.1.滴片时，吸取细胞悬液，滴加在载玻片上，过酒精灯火焰2次后，显微镜下观察滴片效果，制得染色体标本；
4.2.将制好的玻片放入烤箱内烘烤。
步骤5：G带染色：将烘烤后冷却的样本玻片，经胰酶消化，染色，分析染色体核型。
经过连续分别3次实验，分别4个HEPES工作浓度实验组和1个对比组，统计观察对染色体显带染色的影响(见表1)。实验组3分散液对染色体分散效果一般，从对染色体分散和显带染色来统计分析，稍微优于其它组。在染色体分散上，也优于对比组1。但是分散液中的HEPES对高分辨染色体分散并不理想。
表1：显微镜下观察不同工作浓度的HEPES分散液对高分辨染色体的效果。
然后实验设计六偏磷酸钠的工作浓度梯度为0mmol/L、0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L 5组。0mmol/L组为是工作浓度为4g/L KCl低渗液。
实施例2
核型分析制备高分辨染色体分散液，其特征在于：由以下组分组成：
六偏磷酸钠，pH为8.0，KCl 4g/L，溶剂为三蒸水1L。
其中，它是由下述配比的原料制备而成:
A、称量配比的原料：KCl 4g；
B、将以上原料溶解至1000ml三蒸水中，充分溶解；
C、加入0～1mmol/L六偏磷酸钠，混匀；
D、4℃保存。
实验组5的分散液是六偏磷酸钠工作浓度为0.25mmol/L，KCl工作浓度为4g/L。
实验组6的分散液是六偏磷酸钠工作浓度为0.5mmol/L，KCl工作浓度为4g/L。
实验组7的分散液是六偏磷酸钠工作浓度为1mmol/L，KCl工作浓度为4g/L。
实验组8的分散液是六偏磷酸钠工作浓度为2mmol/L，KCl工作浓度为4g/L。
对比组2的分散液是六偏磷酸钠工作浓度为0mmol/L，KCl工作浓度为4g/L。
制备高分辨染色体的流程，包括如下步骤：
步骤1：淋巴细胞接种培养：将人体外周血0.3ml-0.45ml在接种架上接种到培养管中，置37℃培养66-72小时，收获前分别加入HD550、秋水仙素，混匀。继续培养至收获。
步骤2：淋巴细胞收获：
2.1.收获时，将培养管放入离心机内，离心1100rpm，10min。弃去上清液；
2.2.分散染色体：弹打混匀细胞，加入预热到37℃的分散液10ml，弹打混匀细胞，37℃处理20分钟，离心1100rpm，10min。
步骤3：制备细胞悬液
3.1.预固定：立即沿管壁迅速加入预热到37℃的1ml固定液，混匀；
3.2.离心1100rpm，10min；去上清液，加入10ml固定液，混匀细胞，于37℃固定15min；
3.3.离心1100rpm，10min；去上清液，加入9ml固定液，混匀细胞；
3.4.离心1100rpm，10min；去上清液，重新加入新鲜固定液，弹打混匀细胞，按细胞计数留适量固定液，即每600μl固定液8万细胞，制成细胞悬液。
步骤4：制片
4.1.滴片时，吸取细胞悬液，滴加在载玻片上，过酒精灯火焰2次后，显微镜下观察滴片效果，制得染色体标本；
4.2.将制好的玻片放入烤箱内烘烤。
步骤5：G带染色：将烘烤后冷却的样本玻片，经胰酶消化，染色，分析染色体核型。
实验结果是在细胞收获过程中会多次处理细胞沉淀团成单个细胞，但是实验组和对比组3比较，处理起来特别困难，为了分散成单个细胞，会较剧烈处理细胞，直接导致细胞破裂，染色体丢失，中期相细胞数量明显减少，不利于染色体核型分析，容易造成收获失败。经过连续分别3次实验，分别4个六偏磷酸钠工作浓度实验组和1个对比组，统计观察对染色体结果效果(见表2)。与对比组3比较，由于操作细胞沉淀团成单个细胞比较困难，会明显减少中期分裂相细胞数量，造成收获失败。对比组3相对较佳。
表2：显微镜下观察不同工作浓度的六偏磷酸钠分散液对高分辨染色体的效果。
接着实验设计Tris-HCl缓冲液的工作浓度梯度为0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmmol/L 5组。
实施例3
核型分析制备高分辨染色体分散液，其特征在于：由以下组分组成：
Tris-HCL 0.05～1mmol/L，pH为8.0，KCl 4g/L，溶剂为三蒸水1L。
其中，它是由下述配比的原料制备而成:
A、称量配比的原料：KCl 4g；
B、将以上原料溶解至1000ml三蒸水中，充分溶解；
C、加入0.05～1mmol/L Tris-HCL，混匀；
D、4℃保存。
实验组9的分散液是Tris-HCl工作浓度为0.05mmol/L，KCl工作浓度为4g/L。
实验组10的分散液是Tris-HCl工作浓度为0.1mmol/L，KCl工作浓度为4g/L。
实验组11的分散液是Tris-HCl工作浓度为0.25mmol/L，KCl工作浓度为4g/L。
实验组12的分散液是Tris-HCl工作浓度为0.5mmol/L，KCl工作浓度为4g/L。
实验组13的分散液是Tris-HCl工作浓度为1mmol/L，KCl工作浓度为4g/L。
制备高分辨染色体的流程，包括如下步骤：
步骤1：淋巴细胞接种培养：将人体外周血0.3ml-0.45ml在接种架上接种到培养管中，置37℃培养66-72小时，收获前分别加入HD550、秋水仙素，混匀。继续培养至收获。
步骤2：淋巴细胞收获：
2.1.收获时，将培养管放入离心机内，离心1100rpm，10min。弃去上清液；
2.2.分散染色体：弹打混匀细胞，加入预热到37℃的分散液10ml，弹打混匀细胞，37℃处理20分钟，离心1100rpm，10min。
步骤3：制备细胞悬液
3.1.预固定：立即沿管壁迅速加入预热到37℃的1ml固定液，混匀；
3.2.离心1100rpm，10min；去上清液，加入10ml固定液，混匀细胞，于37℃固定15min；
3.3.离心1100rpm，10min；去上清液，加入9ml固定液，混匀细胞；
3.4.离心1100rpm，10min；去上清液，重新加入新鲜固定液，弹打混匀细胞，按细胞计数留适量固定液，即每600μl固定液8万细胞，制成细胞悬液。
步骤4：制片
4.1.滴片时，吸取细胞悬液，滴加在载玻片上，过酒精灯火焰2次后，显微镜下观察滴片效果，制得染色体标本；
4.2.将制好的玻片放入烤箱内烘烤。
步骤5：G带染色：将烘烤后冷却的样本玻片，经胰酶消化，染色，分析染色体核型。
经过连续分别3次实验，对5个Tris-HCl工作浓度实验组，分别进行统计，并计数每样本统计200个中期分裂相细胞中，高分辨染色体细胞个数，以≥550BPHS的细胞个数来衡量，计数≥550BPHS细胞个数及其细胞中染色体的交叉个数。染色体越长，染色体越容易交叉叠加，每个细胞的染色体交叉个数就能反映染色体铺展分散程度，交叉个数越少，染色体铺展分散就越好；反之铺展越差。结果比对见表3，不同Tris-HCl工作浓度对高分辨染色体的分散较佳，而且染色体的显带也较佳，初步判断实验组12中的分散液对细胞染色体分散最好，可以选择Tris-HCl作为分散液的主要成份。
表3：显微镜下观察不同工作浓度的Tris-HCl分散液对高分辨染色体的效果。
考虑到高分辨染色体交叉叠加缠绕太多，影响计数统计交叉个数，为了减少染色体长度可能会直接干扰分散液的分散效果，如图1、图3分别为本发明分散液处理高分辨染色体550BPHS和700BPHS的中期细胞图。如图2、图4分别为0.075mol/L KCl低渗液处理高分辨染色体550BPHS和700BPHS的中期细胞图。对比来看，无论是染色体长度在550BPHS还是在700BPHS以上，0.075mol/L KCl低渗液处理的高分辨染色体交叉叠加缠绕太多，都严重影响染色体分析，难于辨别单条染色体。也难于统计染色体交叉数。只单纯地进行普通染色体制备，收获制备400-500BPHS的染色体。来比较传统低渗液为工作浓度0.075mol/L(质量浓度5.9g/L)的KCl和分散液是上述本发明实验组12中的Tris-HCl工作浓度为0.5mmol/L，KCl工作浓度为4g/L。
实施例4
核型分析制备高分辨染色体分散液，其特征在于：由以下组分组成：
Tris-HCL 0.5mmol/L，pH为8.0，KCl 4g/L，溶剂为三蒸水1L。
其中，它是由下述配比的原料制备而成:
A、称量配比的原料：KCl 4g；
B、将以上原料溶解至1000ml三蒸水中，充分溶解；
C、加入0.5mmol/L Tris-HCL，混匀；
D、4℃保存。
制备染色体的流程，包括如下步骤：
步骤1：淋巴细胞接种培养：将人体外周血0.3ml-0.45ml在接种架上接种到培养管中，置37℃培养66-72小时，收获前加入秋水仙素，混匀。继续培养至收获。
步骤2：淋巴细胞收获：
2.1.收获时，将培养管放入离心机内，离心1100rpm，10min。弃去上清液；
2.2.分散染色体：弹打混匀细胞，加入预热到37℃的分散液10ml，弹打混匀细胞，37℃分散处理20分钟，离心1100rpm，10min。
步骤3：制备细胞悬液
3.1.预固定：立即沿管壁迅速加入预热到37℃的1ml固定液，混匀；
3.2.离心1100rpm，10min；去上清液，加入10ml固定液，混匀细胞，于37℃固定15min；
3.3.离心1100rpm，10min；去上清液，加入9ml固定液，混匀细胞；
3.4.离心1100rpm，10min；去上清液，重新加入新鲜固定液，弹打混匀细胞，按细胞计数留适量固定液，即每600μl固定液8万细胞，制成细胞悬液。
步骤4：制片
4.1.滴片时，吸取细胞悬液，滴加在载玻片上，过酒精灯火焰2次后，显微镜下观察滴片效果，制得染色体标本；
4.2.将制好的玻片放入烤箱内烘烤。
步骤5：G带染色：将烘烤后冷却的样本玻片，经胰酶消化，染色，即可得染色体制备G带结果。分析中期染色体核型。
图5.观察并统计每样本100个中期分裂相细胞中染色体交叉数，所得显微镜照片如图5所示，从图中观察到本发明分散液处理后的中期分裂相细胞染色体交叉数为2个,平均每个细胞染色体交叉个数明显减少。
实施例5对比实验1
传统0.075mol/L KCl低渗液配制，由以下组分组成：
KCl 5.9g/L，溶剂为三蒸水1L，pH值为7.0，中性溶液。
其中，它是由下述配比的原料制备而成:
A、称量配比的原料：KCl 5.9g；
B、将以上原料溶解至1000ml三蒸水中，充分溶解混匀；
C、4℃保存。
制备染色体的流程，包括如下步骤：
步骤1：淋巴细胞接种培养：将人体外周血0.3ml-0.45ml在接种架上接种到培养管中，置37℃培养66-72小时，收获前加入秋水仙素，混匀。继续培养至收获。
步骤2：淋巴细胞收获：
2.1.收获时，将培养管放入离心机内，离心1100rpm，10min。弃去上清液；
2.2.低渗细胞：弹打混匀细胞，加入预热到37℃的0.075mol/L KCl低渗液10ml，弹打混匀细胞，37℃低渗20分钟，离心1100rpm，10min。
步骤3：制备细胞悬液
3.1.预固定：立即沿管壁迅速加入预热到37℃的1ml固定液，混匀；
3.2.离心1100rpm，10min；去上清液，加入10ml固定液，混匀细胞，于37℃固定15min；
3.3.离心1100rpm，10min；去上清液，加入9ml固定液，混匀细胞；
3.4.离心1100rpm，10min；去上清液，重新加入新鲜固定液，弹打混匀细胞，按细胞计数留适量固定液，即每600μl固定液8万细胞，制成细胞悬液。
步骤4：制片
4.1.滴片时，吸取细胞悬液，滴加在载玻片上，过酒精灯火焰2次后，显微镜下观察滴片效果，制得染色体标本；
4.2.将制好的玻片放入烤箱内烘烤。
步骤5：G带染色：将烘烤后冷却的样本玻片，经胰酶消化，染色，即可得染色体制备G带结果。分析中期染色体核型。
图6.观察并统计每个样本100个中期相细胞中，每个细胞染色体交叉数，所得显微镜照片如图6所示，从图中观察到0.075mol/L KCl分散液处理后的中期分裂相细胞染色体交叉个数为7个，较多，影响叠加异常染色体断裂点详细带纹的判断。
对实施例4和实施例5对比实验1分别进行统计，并计数每样本统计200个中期分裂相染色体细胞染色体交叉个数。两者结果比对见表4，与0.075mol/L KCl低渗液比较，本发明分散液处理后，平均每个细胞染色体交叉个数明显少。统计平均每个细胞染色体交叉个数，有显著性统计学差异P＝0.001(P＜0.01)。
表4：对比本发明分散液与0.075mol/L KCl低渗液对细胞染色体分散的差异性优势。
﹡P<0.01
最后是优化本发明分散液的工作浓度，分散染色体用量，分散时间。
实施例6
核型分析制备高分辨染色体分散液，其特征在于：由以下组分组成：
Tris-HCL 0.5mmol/L，pH为9.0，KCl 4g/L，溶剂为三蒸水1L。
其中，它是由下述配比的原料制备而成:
A、称量配比的原料：KCl 4g；
B、将以上原料溶解至1000ml三蒸水中，充分溶解；
C、加入0.5mmol/L Tris-HCL，混匀；
D、4℃保存。
制备高分辨染色体的流程，包括如下步骤：
步骤1：淋巴细胞接种培养：将人体外周血0.3ml-0.45ml在接种架上接种到培养管中，置37℃培养66-72小时，收获前分别加入HD550、秋水仙素，混匀。继续培养至收获。
步骤2：淋巴细胞收获：
2.1.收获时，将培养管放入离心机内，离心1100rpm，10min。弃去上清液；
2.2.分散染色体：加入预热到37℃的分散液5ml，弹打混匀细胞，37℃处理20分钟，离心1100rpm，10min。
步骤3：制备细胞悬液
3.1.预固定：立即沿管壁迅速加入预热到37℃的1ml固定液，混匀；
3.2.离心1100rpm，10min；去上清液，加入10ml固定液，混匀细胞，于37℃固定15min；
3.3.离心1100rpm，10min；去上清液，加入9ml固定液，混匀细胞；
3.4.离心1100rpm，10min；去上清液，重新加入新鲜固定液，弹打混匀细胞，按细胞计数留适量固定液，即每600μl固定液8万细胞，制成细胞悬液。
步骤4：制片
4.1.滴片时，吸取细胞悬液，滴加在载玻片上，过酒精灯火焰2次后，显微镜下观察滴片效果，制得染色体标本；
4.2.将制好的玻片放入烤箱内烘烤。
步骤5：G带染色：将烘烤后冷却的样本玻片，经胰酶消化，染色，即可得染色体制备G带结果。分析中期染色体核型。
实施例7
核型分析制备高分辨染色体分散液，其特征在于：由以下组分组成：
Tris-HCL 0.5mmol/L，pH为10.0，KCl 4g/L，溶剂为三蒸水1L。
其中，它是由下述配比的原料制备而成:
A、称量配比的原料：KCl 4g；
B、将以上原料溶解至1000ml三蒸水中，充分溶解；
C、加入0.5mmol/L Tris-HCL，混匀；
D、4℃保存。
制备高分辨染色体的流程，包括如下步骤：
步骤1：淋巴细胞接种培养：将人体外周血0.3ml-0.45ml在接种架上接种到培养管中，置37℃培养66-72小时，收获前分别加入HD550、秋水仙素，混匀。继续培养至收获。
步骤2：淋巴细胞收获：
2.1.收获时，将培养管放入离心机内，离心1100rpm，10min。弃去上清液；
2.2.分散染色体：加入预热到37℃的分散液10ml，弹打混匀细胞，37℃处理10分钟，离心1100rpm，10min。
步骤3：制备细胞悬液
3.1.预固定：立即沿管壁迅速加入预热到37℃的1ml固定液，混匀；
3.2.离心1100rpm，10min；去上清液，加入10ml固定液，混匀细胞，于37℃固定15min；
3.3.离心1100rpm，10min；去上清液，加入9ml固定液，混匀细胞；
3.4.离心1100rpm，10min；去上清液，重新加入新鲜固定液，弹打混匀细胞，按细胞计数留适量固定液，即每600μl固定液8万细胞，制成细胞悬液。
步骤4：制片
4.1.滴片时，吸取细胞悬液，滴加在载玻片上，过酒精灯火焰2次后，显微镜下观察滴片效果，制得染色体标本；
4.2.将制好的玻片放入烤箱内烘烤。
步骤5：G带染色：将烘烤后冷却的样本玻片，经胰酶消化，染色，即可得染色体制备G带结果。分析中期染色体核型。
本实施例的实验结果：本发明的分散液与传统0.075mol/L KCl低渗液比较，明显地提高了淋巴细胞染色体铺展分散程度，明显提高了染色体的质量。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，并未全部列出，是说明性的而不是限定性的，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的保护范围之内。
Claims (7)
1.核型分析制备高分辨染色体分散液，其特征在于：由以下组分组成：
Tris-HCL 0.05～1mmol/L，pH为7.5～10.0；KCl 2～8g/L，溶剂为三蒸水。
2.根据权利要求1所述的核型分析制备高分辨染色体分散液，其特征在于：Tris-HCL0.5mmol/L，pH为8.0；KCl 4g/L，溶剂为三蒸水。
3.权利要求1所述的核型分析制备高分辨染色体分散液的制备方法，其特征在于：由下述原料配比制备而成：
A、称量配比的原料：KCl 2-8g；
B、将以上原料溶解至1000ml三蒸水中，充分溶解；
C、加入0.05～1mmol/L Tris-HCL，混匀；
D、4℃保存。
4.根据权利要求3所述的核型分析制备高分辨染色体分散液的制备方法，其特征在于：
A、称量配比的原料：KCl 4g；
B、将以上原料溶解至1000ml三蒸水中，充分溶解；
C、加入0.5mmol/L Tris-HCL，混匀；
D、4℃保存。
5.应用权利要求1所述的核型分析制备高分辨染色体分散液制备染色体的方法，包括如下步骤：
步骤1：淋巴细胞接种培养：将人体外周血0.3ml-0.45ml在接种架上接种到培养管中，置37℃培养66-72小时，收获前分别加入HD550、秋水仙素，混匀；继续培养至收获；
步骤2：淋巴细胞收获：
2.1.收获时，将培养管放入离心机内，离心1100rpm，10min；弃去上清液；
2.2.分散染色体：弹打混匀细胞，加入预热到37℃的分散液5-10ml，弹打混匀细胞，37℃处理10-20分钟，离心1100rpm，10min；
步骤3：制备细胞悬液
3.1.预固定：立即沿管壁迅速加入预热到37℃的1ml固定液，混匀；
3.2.离心1100rpm，10min；去上清液，加入10ml固定液，混匀细胞，于37℃固定15min；
3.3.离心1100rpm，10min；去上清液，加入9ml固定液，混匀细胞；
3.4.离心1100rpm，10min；去上清液，重新加入新鲜固定液，弹打混匀细胞，按细胞计数留适量固定液，即每600μl固定液8万细胞，制成细胞悬液；
步骤4：制片
4.1.滴片时，吸取细胞悬液，滴加在载玻片上，过酒精灯火焰2次后，显微镜下观察滴片效果，制得染色体标本；
4.2.将制好的玻片放入烤箱内烘烤；
步骤5：G带染色：将烘烤后冷却的样本玻片，经胰酶消化，染色，分析染色体核型。
6.根据权利要求5所述的核型分析制备高分辨染色体分散液制备染色体的方法，其特征在于：所述的分散液成分为：Tris-HCL 0.5mmol/L，pH为8.0；KCl 4g/L，溶剂为三蒸水。
7.根据权利要求5所述的核型分析制备高分辨染色体分散液制备染色体的方法，其特征在于：
步骤2：淋巴细胞收获：
2.1.收获时，将培养管放入离心机内，离心1100rpm，10min；弃去上清液；
2.2.分散染色体：弹打混匀细胞，加入预热到37℃的分散液5-10ml，弹打混匀细胞，37℃处理20分钟，离心1100rpm，10min。
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