CN111118002B - 一种用于锚定小麦4d染色体的特异性探针和锚定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于锚定小麦4D染色体的特异性探针和锚定方法，该特异性探针包括SEQ ID NO：1所示的寡核苷酸，还可以包括荧光基团，荧光基团与寡核苷酸的5'端连接。本发明提供的小麦4D染色体的特异性探针，可有效快速地从普通小麦遗传背景中鉴定/锚定4D染色体，且有利于对4D染色体进行高纯度的流式分选。

Description

一种用于锚定小麦4D染色体的特异性探针和锚定方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于锚定小麦4D染色体的特异性探针和锚定方法。

背景技术

小麦是世界上第一大粮食作物，在我国也是仅次于水稻的第二大粮食作物。小麦为异源六倍体作物(基因组为AABBDD)，基因组巨大(约为17G)且重复序列多，结构复杂。对其进行基因组测序成本非常高，且在重复序列丰富区域常常不能正确组装。单染色相较于整个基因组而言，数据量小(常为数百兆)，因此测序成本低。且对单染色体测序，避免了其他染色体对其的干扰，组装准确度也较高。因此，单染色体测序对于基因组较大的作物，特别是小麦，具有重要意义。而准确分选出需要测序的目标染色体，则是进行单染色体测序的前提。单染色体分选可基于染色体大小和荧光标记强度两种方式进行。对于小麦而言，A、B、D组内染色体大小差异不大，按照染色体大小进行分选难以获得高纯度目标染色体，因而也就无法进行后期单染色体测序。而开发单染色体特异探针，可使目标染色体携带特异的荧光信号，从而达到高纯度分选的目的。但现有技术中未见有小麦4D染色体特异探针的相关报道。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种用于锚定小麦4D染色体的特异性探针和锚定方法，可有效快速地从普通小麦遗传背景中鉴定/锚定4D染色体，且有利于对4D染色体进行高纯度的流式分选。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种寡核苷酸，该寡核苷酸的序列如SEQ ID NO：1所示。

一种核酸探针，该核酸探针包括上述SEQ ID NO：1所示的寡核苷酸，优选地，该核酸探针还包括荧光基团，该荧光基团与寡核苷酸的5'端连接，该荧光基团可为4-甲基-6-羧罗丹明，但并不局限于4-甲基-6-羧罗丹明，只要能起到可直观明了的观察结果的标记基团均可。

上述核酸探针可用于锚定小麦4D染色体，有利于对4D染色体进行高纯度的流式分选。

采用上述核酸探针对小麦4D染色体进行快速锚定的方法，包括以下步骤：

(1)对待测样品进行处理，并制片；

(2)将上述核酸探针与处理后的待测样品进行荧光原位杂交，然后镜检。

进一步地，步骤(1)具体步骤为：取小麦根尖，将其制备成小麦根尖细胞悬浮液，然后利用该小麦根尖细胞悬浮液进行滴片制成常规的待检玻片。

进一步地，步骤(2)具体过程为：将探针用杂交缓冲液稀释，使其浓度为1nmol/100uL，得工作液，然后将工作液和杂交缓冲液按体积比为1:3-5混合，得杂交液，将杂交液滴于待检玻片上，进行荧光原位杂交，然后镜检。优选地，工作液和杂交缓冲液的体积比为1:4。

进一步地，杂交缓冲液为2×SSC和1×TE按体积比为1:1混合的混合液。

进一步地，杂交条件为37℃，黑暗条件下杂交3h。

本发明提供的用于锚定小麦4D染色体的特异性探针和锚定方法，具有以下有益效果：

本发明提供的小麦4D染色体的特异性探针S1000，可有效快速地从普通小麦遗传背景中鉴定/锚定4D染色体，且有利于对4D染色体进行高纯度的流式分选。

附图说明

图1为本发明的流程示意图；

图2为六倍体小麦的FISH图。

具体实施方式

实施例1探针S1000的设计和制备

对已公布的六倍体小麦基因组数据库进行筛选，BLAST比对，获得4D染色体特有的拷贝数较多的串联重复序列，对该串联重复序列之间的各拷贝之间进行比较归类，从中截取60bp以下的保守度高的核酸序列交由合成公司进行合成，并在5'端连接荧光基团，获得用于锚定小麦4D染色体的特异性探针(记为探针S1000)，其核苷酸序列为：

5’-GCATGTCTAACACTAGGCATGCAACTGCAAGTGTCATCTTCGAGT-3’(SEQ ID NO：1)。

上述探针S1000的设计和制备的具体过程如下：

(1)小麦基因组中串联重复序列的获得

使用Tandem Repeats Finder(TRF,version 4.09)搜索普通小麦中国春IWGSCRefSeq v1.0参考基因组中的串联重复序列(Tandem repeats,TR)，参数为：Match＝2，Mismatch＝7，Delta＝7，PM＝80，PI＝10，Minscore＝50，MaxPeriod＝2000，得到参考基因组中各染色体序列上所有满足条件的TR阵列(多个TR重复单元首尾相连形成阵列)记录，以下简称“TR记录”。

(2)小麦4D特异TR的获得

①过滤掉拷贝数小于10、单元长度小于30、匹配度百分数小于80％的TR记录。

②使用NCBI-BLAST+(version 2.2.30+)的blastn，将4D染色体各TR记录重复单元(以下简称“TR单元”)与其他20条染色体的TR单元进行比对(小麦为21对，42条染色体，为了保证我们挑选出的候选探针具有较高的4D染色体特异性，因此需要与其他20条小麦染色体进行比对)，关键参数为“-task blastn-perc_identity 80-qcov_hsp_perc 80-dust no”。过滤掉重复单元和其他染色体上TR单元一致度和覆盖度均在80％以上的4D TR记录，得到了4D特异的TR记录，只有2个，且为同类TR。

(3)小麦4D特异探针的获得

①将上述得到的2个4D特异TR阵列的完整序列从起始位置开始切割出长45bp的一系列片段，每次步移5bp，依次以s1、s2、s3、……、sN(N为正整数)编号，获得FASTA格式的序列。

②利用CD-HIT(version 4.7)的cdhit-est程序对FASTA格式的序列进行聚类，关键参数为“-c 0.85-aL 0.8-aS 0.8”，即序列一致度不低于85％，覆盖度不低于80％。

③将聚类后得到的非冗余45bp序列集提交到MCGB-B2DSC(http://mcgb.uestc.edu.cn/b2dsc)，选择IWGSC RefSeq v1.0参考基因组，比对和过滤均使用默认参数，观察各序列同源拷贝在基因组中的分布图，筛选在4D上1Mb内拷贝数大于90，且这些拷贝在更小的区间内(此处为20Kb)毗邻，又在其他染色体上1Mb内拷贝数小于20的序列，用于设计4D特异探针。

实施例2上述探针在小麦4D染色体上的杂交验证

(1)取根，具体包括以下依次进行的步骤：

①将六倍体小麦种子放于湿润滤纸上，在23℃条件下培养24h；

②将种子转于4℃条件下培养24h；

③将种子转于23℃条件下培养直至其发根；

④当根长至1-2cm时，取根将其置于湿润的0.5ml EP管中(EP管置于冰上)。0.5ml的EP管应预先在其盖上戳一个直径约为3mm左右的小洞，以方便对根尖进行笑气处理；

⑤将装有根的EP管放入笑气罐中，笑气罐通笑气(0.9Mpa)处理2h；

⑥取出EP管置于冰上，往其中加入90％乙酸，固定根尖8-10min。用ddH₂O洗根两次；

⑦往EP管中加70％乙醇，并放于-20℃中，即可对根长期保存。

(2)制片，具体包括以下依次进行的步骤：

①将根用ddH2O清洗2次，以去除根上的乙醇；

②切下根尖部分置于酶液中，37℃条件下酶解1h；

③用70％乙醇冲洗根尖2次，将酶液洗尽；

④留少量乙醇，用针尖将根尖捣碎，离心(4000rmp，2min)后将EP管倒置，以控干乙醇；

⑤往EP管中加入15-50μl乙酸，涡旋获得根尖细胞悬浮液；

⑥在湿润的纸盒中滴片。

(3)杂交

①杂交液的配制：合成的探针粉末用杂交缓冲液稀释成工作液备用，工作液终浓度为1nmol/100uL。使用时，吸取2uL/片的工作液，再加入8uL/片缓冲液，混匀，形成杂交液，在每张片子上滴上10uL杂交液。杂交缓冲液配方：2×SSC：1×TE＝1：1(V:V),pH＝7.0)8μl/片；

②37℃，黑暗条件下杂交3h；

③DAPI染色盖上盖片，在Leica荧光显微镜DM2500下镜检。使用黑白制冷CCD照相，荧光信号附伪色。结果如图2所示，其中图A为以S1000(白色)为探针的FISH图；图B为以oligo-pSc119.2(绿色)和oligo-pTa535(红色)为探针的FISH图。

由图1可知，探针oligo-pSc119.2和oligo-pTa535可识别4D染色体，而S1000探针只在4D染色体短臂端部特异杂交。由此可知，本申请所开发的S1000探针只在4D染色体上产生明显的杂交信号，而在其他20条小麦染色体(1A-7A,1B-7B,1D-3D,5D-7D)上不产生杂交信号。该结果表明，S1000可在普通小麦遗传背景中准确鉴定/锚定出4D染色体。

序列表

<110> 四川省农业科学院生物技术核技术研究所

<120> 一种用于锚定小麦4D染色体的特异性探针和锚定方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcatgtctaa cactaggcat gcaactgcaa gtgtcatctt cgagt 45

Claims (7)

1.一种核酸探针在锚定小麦4D染色体中的应用，所述核酸探针包括如SEQ ID NO：1所示的寡核苷酸序列以及与寡核苷酸的5'端连接的荧光基团；所述核酸探针只在小麦4D染色体短臂端部特异杂交。

2.采用权利要求1所述的核酸探针对小麦4D染色体进行快速锚定的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对待测样品进行处理，并制片；

（2）将上述核酸探针与处理后的待测样品进行荧光原位杂交，然后镜检。

3.根据权利要求2所述的锚定方法，其特征在于，步骤（1）具体步骤为：取小麦根尖，将其制备成小麦根尖细胞悬浮液，然后进行制片。

4.根据权利要求2所述的锚定方法，其特征在于，步骤（2）具体过程为：将权利要求1所述的核酸探针用杂交缓冲液稀释，使其浓度为1nmol/100uL，得工作液，然后将工作液和杂交缓冲液按体积比为1:3-5混合，得杂交液，将杂交液滴于处理后的待测样品上，进行荧光原位杂交，然后镜检。

5.根据权利要求4所述的锚定方法，其特征在于，工作液和杂交缓冲液的体积比为1:4。

6.根据权利要求4或5所述的锚定方法，其特征在于，杂交缓冲液为2×SSC和1×TE按体积比为1:1混合的混合液。

7.根据权利要求2所述的锚定方法，其特征在于，杂交条件为37℃，黑暗条件下杂交3h。

Images