CN113957166B - 一种基于菊花近缘种属植物参考基因组的核糖体dna寡核苷酸混合探针套及开发方法 - Google Patents

一种基于菊花近缘种属植物参考基因组的核糖体dna寡核苷酸混合探针套及开发方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于菊花近缘种属植物参考基因组的核糖体DNA(rDNA)寡核苷酸混合探针套，并公开了一种基于菊花近缘种属植物参考基因组的核糖体DNA(rDNA)寡核苷酸混合探针套的开发方法。具体为：利用已下载的拟南芥rDNA数据，对已有的菊花脑、甘野菊、黄蒿和向日葵进行本地Blast比对,获得5S rDNA和45S rDNA(5.8S、18S和28S)共有序列；再利用该数据在Oligo7软件开发5S rDNA和45S rDNA探针；合成的5S rDNA和45SrDNA寡核苷酸探针套分别包含2条和10条寡核苷酸探针。本发明开发的寡核苷酸探针开发方法和探针套，可有效的用于菊属植物染色体分析核型图谱的构建，通过组配好的寡核苷酸探针套通过FISH分析进行检测，避免克隆重组、标记探针的繁琐程序和异源片段，大大简化了FISH分析的程序，提高了实验效率。

Description

一种基于菊花近缘种属植物参考基因组的核糖体DNA寡核苷 酸混合探针套及开发方法
技术领域
本发明属于分子细胞遗传学研究领域，公开了一种基于菊花近缘种属植物参考基因组的核糖体DNA寡核苷酸混合探针套。
背景技术
菊属植物主要分布自欧洲和亚洲，具有很高的观赏价值，被认为是春黄菊族中重要的观赏园艺作物。作为菊花的核心种质资源，菊属植物的细胞学研究目前还未被完全明晰，这对探索菊花起源问题和菊花遗传育种研究产生了巨大阻碍。
核糖体DNA(rDNA),是一种高度保守的串联重复序列，在属中植物的变异在自然选择的巨大压力下被保存下来。在高等真核生物中，rDNA被分为两类：占主要部分的45S rDNA序列编码28S、5.8S、18S rRNA,而较少的5SrDNA编码5S rRNA。在不同植物的基因组中，5SrDNA和45S rDNA的位点数量存在差异并且这些成百上千的单元在串联重复中出现，反映为染色体位点上单位点和多个位点。45S rDNA单元结构大多以微卫星序列的形式出现在核仁组织区(NORs),其位点不同于5S rDNA位点，位于次缢痕区域。因此，利用55rDNA和45S rDNA作为探针对属内植物进行FISH检测。
常规的5S rDNA和45S rDNA探针通常需要通过BAC克隆，且获得的探针还需经过的缺刻平移法或随机引物法标记，过程繁琐，成本较高。除此以外，以常用的pTa71(45S rDNA)探针为例，该探针来源于小麦的45S rDNA，其中异源的片段可能会对荧光信号产生干扰。其次，小麦作为单子叶植物，与双子叶的菊属植物间的差异也可能对相应结果产生影响。因此，有必要基于菊属植物及其近缘属的参考基因组数据开发更特异便捷的5S rDNA和45SrDNA寡核苷酸探针、在更精细的灵敏度上来明晰菊属不同物种间的差异。新兴的寡核苷酸荧光原位杂交(Oligo-FISH)技术被广泛应用，基于重复序列开发的寡核苷酸探针进行FISH分析，逐渐成为植物基因组分析的重要方法，并且已经在小麦(Triticum aestivum)，玉米(Zea may)，部分观赏园艺作物例如番红花(Crocus sativus)和黄瓜(Cucumis sativus)等植物上成功运用。基于菊属植物中的参考基因组菊花脑(Chrysanthemum nankingense)和甘野菊(C.seticuspe)的基因组数据，加上春黄菊族中的近缘属中的黄蒿(Artemisiaannua)和向日葵(Helianthus annuus)基因组数据，我们拟通过拟南芥(Arabidopsisthaliana)5S rDNA和45S rDNA(5.8S,18S,26S)序列与上述数据库进行比对，利用获得的共有序列开发相应的5S rDNA和45S rDNA寡核苷酸探针，以期获得高分辨率的菊属植物5SrDNA和45S rDNA FISH核型信息，从而明晰菊属内各种核糖体DNA位点的差异。
发明内容
本发明的目的是针对目前在菊属植物分子细胞遗传学研究中，采用传统荧光原位杂交技术中使用的异源5S rDNA和45S rDNA进行分析时，探针制备方法和过程繁琐，成本较高，且信号易受异源片段的干扰，难以识别的问题，提供基于菊属植物及其近缘属参考基因组数据的5S rDNA和45S rDNA寡核苷酸探针开发方法和探针套，从而明晰菊属下各种的差异，实用性和科学性突出。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
本发明的第一个目的是提供一种基于菊花近缘种属植物参考基因组的核糖体DNA的寡核苷酸混合探针套，所述寡核苷酸混合探针套包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的5S rDNA寡核苷酸探针套和SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.12所示的45S rDNA寡核苷酸探针套，所述寡核苷酸混合探针套序列特征如下：
①5S rDNA寡核苷酸探针套
②45S rDNA寡核苷酸探针套
本发明的第二个目的是提供一种包含前述寡核苷酸混合探针套的寡核苷酸探针套杂交液，所述寡核苷酸探针套杂交液每个制片使用量成分包括：dFA 7.5μL，20×SSC 1.5μL，Salmon sperm DNA(鲑鱼精DNA)0.5μL，体积百分比50.0％Dextran Sulfate(硫酸葡聚糖)1.5μL，前述寡核苷酸混合探针套6.0μL；将所述成分于1.5mL或2.0mL或离心管中混匀，振荡离心后置于105℃的加热块中变性10-13min，取出后迅速置于-20℃冰酒精中处理10min以上，制备得到所述寡核苷酸探针套杂交液。
进一步的，所述寡核苷酸混合探针套中，各探针浓度为：JH 5SrDNA-1(0.55ng/μL)；JH 5S rDNA-2(0.55ng/μL)；JH 5.8S rDNA-1(0.55ng/μL)；JH 5.8S rDNA-2(0.55ng/μL)；JH 18S rDNA-1(0.55ng/μL)；JH 18S rDNA-2(0.55ng/μL)；JH 18S rDNA-3(0.55ng/μL)；JH 28S rDNA-1(0.55ng/μL)；JH 28S rDNA-2(0.55ng/μL)；JH 28S rDNA-3(0.55ng/μL)；JH 28S rDNA-4(0.55ng/μL)；JH 28S rDNA-5(0.55ng/μL)。各探针加入量均为0.5μL。
本发明的第三个目的是提供一种利用前述寡核苷酸探针套杂交液的开发方法：
利用已下载的拟南芥rDNA数据，对已有的菊花脑、甘野菊、黄蒿和向日葵进行本地Blast比对。分别通过5S、5.8S、18S和28S rDNA序列比对获得共有序列(共有序列如SEQ IDNO.13至SEQ ID NO.16所示)。5S、5.8S、18S和28S rDNA的共有序列长度分别为123bp、164bp、952bp、3402bp。5S rDNA的编码序列在菊花脑、甘野菊、黄蒿显示出高度的相似性。
为了获得代表性的5S rDNA探针，利用获得的共有序列进行多序列比对来设计5SrDNA探针。比对结果显示，5S rDNA的编码序列菊花脑、甘野菊和黄蒿中较为保守。合成的5SrDNA寡核苷酸探针套，包含两条双端TAMRA修饰的寡核苷酸探针(SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2所示)。
而对于45S rDNA,其主要部分5.8S，18S，28S(26S)序列在所比对物种中存在明显的变异。合成45S rDNA的寡核苷酸探针套，包含根据其不同单元设计的3`端FAM修饰的寡核苷酸探针10条(SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.12所示)。除此之外，多序列比对结果可以看出，45S rDNA的不同单元在属内及其近缘属中存在差异。
具体操作为：
(1)利用已下载的拟南芥rDNA数据，对已有的菊花脑、甘野菊、黄蒿和向日葵进行本地Blast比对。再利用Jalview(v2.10.3)分别对5S、5.8S、18S和28S rDNA序列比对获得共有序列。5S、5.8S、18S和28S rDNA的共有序列长度分别为123bp、164bp、952bp、3402bp。
(2)通过Oligo7开发基于获得的共有序列数据，开发两条双端TAMRA修饰的5SrDNA寡核苷酸探针(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示)和3`端FAM修饰的45S rDNA寡核苷酸探针10条(SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.12所示)，且探针长度控制在30-40nt；
本发明的第四个目的是提供一种利用前述寡核苷酸探针套或前述的寡核苷酸探针套杂交液进行菊属植物高分辨率染色体荧光原位杂交的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将菊属植物有丝分裂间期制片置于44℃水浴的碱变性液中变性4min，接着依次置于体积百分比70％乙醇、70％乙醇、100％乙醇溶液中，室温下依次梯度脱水各5min，晾干备用；配制前所述寡核苷酸探针套杂交液，将所述寡核苷酸探针套杂交液以17μL/片的滴加量，滴加在制片上，盖上盖玻片，置于37℃2×SSC润湿的湿盒中杂交培养6h以上；
(2)揭去盖玻片，先用缓水流冲洗制片；44℃水浴条件下，2×SSC、2×SSC、ddH2O溶液中各浸洗5min，晾干后在制片上滴加8uL DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)封片；镜检。
进一步的，步骤(1)所述碱变性液是将NaOH与体积百分比70％乙醇以6g/L的比例溶解混匀配制而成。
进一步的，步骤(2)镜检具体为将封片后的染色体制片置于Olympus BX60型荧光显微镜下镜检，利用SPOT CCD拍摄菊属植物有丝分裂中期染色体图像，并通过Photoshop(v6.0)对获得的图像进行处理。
本发明的第五个目的是提供包含前述寡核苷酸混合探针套或包含前述的寡核苷酸探针套杂交液的商品化染液或试剂盒及其由试剂盒衍生的其他产品，所述其他产品例如菊属植物5S rDNA和45S rDNA信号快速检测试剂。
本发明的第六个目的是提供前述寡核苷酸混合探针套，或前述的寡核苷酸探针套杂交液，或前述试剂盒或检测试剂在菊属植物高分辨率染色体荧光原位杂交中的应用。
进一步的，为在菊属植物高分辨率有丝分裂中期染色体荧光原位杂交中的应用。
进一步的，所述应用包括以下步骤：
(1)将菊属植物有丝分裂间期制片置于44℃水浴的碱变性液中变性4min，接着依次置于体积百分比70％乙醇、70％乙醇、100％乙醇溶液中，室温下依次梯度脱水各5min，晾干备用；配制前所述寡核苷酸探针套杂交液，将所述寡核苷酸探针套杂交液以17μL/片的滴加量，滴加在制片上，盖上盖玻片，置于37℃2×SSC润湿的湿盒中杂交培养6h以上；
(2)揭去盖玻片，先用缓水流冲洗制片；44℃水浴条件下，2×SSC、2×SSC、ddH2O溶液中各浸洗5min，晾干后在制片上滴加8uL DAPI封片；镜检。
进一步的，步骤(1)所述碱变性液是将NaOH与体积百分比70％乙醇以6g/L的比例溶解混匀配制而成。
进一步的，步骤(2)镜检具体为将封片后的染色体制片置于Olympus BX60型荧光显微镜下镜检，利用SPOT CCD拍摄菊属植物有丝分裂中期染色体图像，并通过Photoshop(v6.0)对获得的图像进行处理。
本发明有益效果如下
本发明基于菊属植物及其近缘属的参考基因组数据开发了菊属植物5S rDNA和45S rDNA寡核苷酸探针套，通过多序列比对获得的共有序列同源性高，方法简单可行。开发的5S rDNA和45S rDNA探针套分别由2个和10个寡核苷酸探针组配而成，探针的荧光信号强，易于检测，且重复性高；并基于该混合探针套进一步开发了寡核苷酸探针套杂交液，用于菊属植物高分辨率染色体荧光原位杂交，能够获得高分辨率的菊属植物5S rDNA和45SrDNA染色体核型，实用性和科学性突出。同时，通过简单的变性即可用于FISH检测，即可达到传统FISH的检测效果，大大提高了实验效率。
本发明提供的基于菊花近缘种属植物参考基因组的核糖体DNA寡核苷酸混合探针套及开发方法，与现有技术相比具有如下优点和积极效果：
(1)本发明的先进性在于利用菊属植物及其近缘属的参考基因组数据进行5SrDNA和45S rDNA开发寡核苷酸探针，获得的共有序列同源性高，方法简单易行，可操作性强，实用性非常突出，可有效的用于菊属植物的5S rDNA和45S rDNA寡核苷酸探针的开发。
(2)通过组配好的寡核苷酸探针套进行荧光原位杂交(FISH)检测，仅需要通过简单变性即可用于FISH检测，相较于传统的FISH程序，大大简化了荧光原位杂交探针的制备和标记、分析方法，提高了实验效率。
(3)本发明的先进性在于所得到的的FISH信号点明亮度适中，杂质信号少，且杂质信号易于被上述洗脱条件洗脱，有利于获得更好的FISH核型。
(4)经典FISH分析中常规使用的核糖体DNA探针例如小麦pTa71(45S rDNA)探针，其中来源于小麦的异源片段的干扰信号也会对实验结果产生影响。本发明中对菊属植物染色体进行FISH分析时，采用单链寡核苷酸探针组配成的寡核苷酸探针套代替传统的质粒探针，显示出与来源于其他植物的质粒探针相同或更多同源的的杂交信号，有助于获得高分辨率的菊属植物有丝分裂中期染色体核型，为明晰菊属下各种的差异提供了新的途径，有助于菊属植物的分子细胞遗传学研究。以菊花脑5S rDNA和45S rDNA FISH结果为例，其5SrDNA寡核苷酸探针信号强度相较于质粒探针增加了16.7％，45S rDNA寡核苷酸信号数相较于质粒探针增加了12.5％。
附图说明
图1、菊属植物及其部分近缘属植物5S rDNA和45S rDNA(18S部分)多序列比对结果
(a)5S rDNA多序列比对结果及寡核苷酸探针所在位置
(b)45S rDNA(18S部分)多序列比对结果及寡核苷酸探针所在位置
图2、菊花脑(C.nankinense)有丝分裂间期5S rDNA、45S rDNA探针套FISH信号检测结果，标尺大小为10μm。(三角形为5S rDNA信号，箭头为45S rDNA信号)
图3、菊花脑(C.nankinense)有丝分裂中期5S rDNA和45S rDNA探针FISH结果，标尺大小为10μm。
(a)DAPI核型(b)45S rDNA信号(5’端-FAM)信号
(c)5S rDNA信号(5’端-TAMRA)信号(d)FISH合成图
图4、菊花脑(C.nankinense)有丝分裂45S rDNA探针FISH结果(45S rDNA信号以箭头表示)
(A)小麦pTa71(45S rDNA)探针FISH结果(b)45S rDNA寡核苷酸探针FISH结果
具体实施方式
以下将结合实例及附图进一步的详细说明本发明。以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
实施例1菊属植物5S rDNA和45S rDNA寡核苷酸探针开发
利用已下载的拟南芥rDNA数据，对已有的菊花脑、甘野菊、黄蒿和向日葵进行本地Blast比对。分别通过5S、5.8S、18S和28S rDNA序列比对获得共有序列，结果如图1所示。5S、5.8S、18S和28S rDNA的共有序列长度分别为123bp、164bp、952bp、3402bp。5S rDNA的编码序列在菊花脑、甘野菊、黄蒿显示出高度的相似性。
为了获得代表性的5S rDNA探针，利用获得的共有序列进行多序列比对来设计5SrDNA探针。比对结果显示，5S rDNA的编码序列菊花脑、甘野菊和黄蒿中较为保守。合成的5SrDNA寡核苷酸探针套，包含两条双端TAMRA修饰的寡核苷酸探针。
而对于45S rDNA,其主要部分5.8S，18S，28S(26S)序列在所比对物种中存在明显的变异。合成45S rDNA的寡核苷酸探针套，包含根据其不同单元设计的3`端FAM修饰的寡核苷酸探针10条。除此之外，多序列比对结果可以看出，45S rDNA的不同单元在属内及其近缘属中存在差异。
利用Jalview(v2.10.3)进行多序列比对获得的5S rDNA和45S rDNA的共有序列，共有序列如SEQ ID NO.13至SEQ ID NO.16所示：
5S rDNA共有序列(SEQ ID NO.13)：
GTCACCCAAGCCAGTACTACTCTCGCCCAAGCACGCTTAACTGCGGAGTTCTGATGGGATCCGGTGCATTAGTGTAGTACTAAGAGCAGTGACCACCCGGGAAGTCCTCGTGTTGCATCCCTC
5.8S rDNA共有序列(SEQ ID NO.14)：
AAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCACGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCTTTTGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACCAA
18S rDNA共有序列(SEQ ID NO.15)：
TACCTGGTTGATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTGTAAGTATGAACAAATTCAGACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTGTTTGATGGTATCTGCTACTCGGATAACCGTAGTAATTCTAGAGCTAATATGTGCAACAAACCCCGACTTATGGAAGGGATGCATTTATTAGATAAAAGGTCGACGCGGGCTCTGCCCGTTGCTCCGATGATTCATGATAACTCGACGGATCGCACGGCCTTTGTGCCGGCGACGCATCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACTATGGTGGTGACGGGTGACGGAGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATACCGGGCTCATATGAGTCTGGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTTAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGACTTTGGGTTGGGTCGGCCGGTCCGCCTTTAGGTGTGCACCGGTTTACTCGTCCCTTCTGTCGGCGATGCGCTCCTGGCCTTAATTGGCCGGGTCGTGCCTCCGGCGCTGTTACTTTGAAGAAATTAGAGTGCTCAAAGCAAGCCTACGCTCTGTATACATTAGCATGGGATAACATCATAGGATTTCGGTCCTATTACGTTGGCCTTCGGGATCGGAGTAATGATTAACAGGGACAGTCGGGGGCATTCGTATTTCATAGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATGAAAGACGAACAACTGCGAAAGCATTT
28S rDNA共有序列(SEQ ID NO.16)：
CGACCCCAGGTCAGGCGGGATTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACAAGGATTCCCTTAGTAACGGCGAGCGAACCGGGAAGAGCCCAGCTTGAAAATCGGACGTCTTCGGCGTTCGAATTGTAGTCTGGAGAAGCGTCCTCAGCGACGGACCGGGCCTAAGTTCCCTGGAAAGGGGCGCCAGAGAGGGTGAGAGCCCGTCGTGCCCGGACCCTGTCGCACCACGAGGCGCTGTCTACGAGTCGGGTTGTTTGGGAATGCAGCCCCAATCGGGCGGTAAATTCCGTCCAAGGCTAAATACGGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACCGCGAGGTAAAGATGAAAAGGACTTTGAAAAGAGAGTCAAAGAGTGCTTGAAATTGTCGGGAGGGAAGCGGATGGGGGCCGGCGATGCGTCCTGGTCGGATGCGGAACGGAGCAATCCGGTCCGCCGATCGATTCGGGGCGTGGACCGACGCGGATTACGGTGGCGGCCTAAGCCCGGGCTTTTGATACGCTTGTGGAGACGTCGCTGCCGTGATCGTGGTCTGCAGCACGCGCCTAACGGCGTGCCTCGGCATCAGCGTGCTCCGGGCGTCGGCCTGTGGGCTCCCCATTCGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCTGACATGTGTGCGAGTCAACGGGTGAGTAAACCCGTAAGGCGCAAGGAAGCTGATTGGCGGGATCCTCGCGGGTGCACCGCCGACCGACCTTGATCTTCTGAGAAGGGTTCGAGTGTGAGCATGCCTGTCGGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCCTGAGCGGGGCAAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCCCGCAGCGATACTGACGTGCAAATCGTTCGTCTGACTTGGGTATAGGGGCGAAAGACTAATCGAACCGTCTAGTAGCTGGTTCCCTCCGAAGTTTCCCTCAGGATAGCTGGAGCCCGGACGCGAGTTCTATCGGGTAAAGCGAATGATTAGAGGCATCGGGGGCGTAACGCCCTCGACCTATTCTCAAACTTTAAATAGGTAGGACGTCGCGGCTGCTTTGTTGAGCCGCCACACGGAATCGAGAGCTCCAAGTGGGCCATTTTTGGTAAGCAGAACTGGCGATGCGGGATGAACCGGAAGCCGGGTTACGGTGCCAAACTGCGCGCTAACCTAGAACCCACAAAGGGTGTTGGTCGATTAAGAGCAACAGCAGGACGGTGGTCATGGAAGTCGAAATCCGCTAAGGAGTGTGTAACAACTCACCTGCCGAATCAACTAGCCCCGAAAATGGATGGCGCTTAAGCGCGCGACCTACACCCGGCCGTCGAGGCAAGAGCCAGGCCCCGATGAGTAGGAGGGCGCGGCGGTCGCTGCAAAACCTAGGGCGTGAGCCCAGGCGGAGCGGCCGTCGGTGCAGATCTTGGTGGTAGTAGCAAATATTCAAATGAGAACTTTGAAGGCCGAAGAGGGGAAAGGTTCCATGTGACACGGCACTTGCACATGGGTTAGTCGATCCTAAGAGACGGGGGAAACCCGTCAGATAGCGCGTTTTGCGCGAGCTTCGAAAGGGAATCGGGTTAAAATTCCTGAACCGGGACGTGGCGGCTGACGGCAACGTTAGGGAGTCCGGAGACGTCGGCTGGGGCCTCGGGAAGAGTTATCTTTTCTGTTTAACAGCCTGCCCACCCTGGAAACGACTCAGTCGGAGGTAGGGTCCAGCGGCTGGAAGAGCACCGCACGTGTCCGCGCGGTGTCCGGTGCGCCCCCGGCGGCCCTTGAAAATCCGGAGGACCGAGTGCCTCCCACGCCCGGTCGTACTCATAACCGCATCAGGTCTCCACAGGTGAACAGCCTCTGGTCGATGGAACAATGTAGGCAAGGGAAGTCGGCAAAATGGATCCGTAACCTCGGGAAAAGGATTGGCTCTGAGGGCTGGGCACGGGGTCGGTCCCAGTTCCGAACCCGTCGGCTGTCGGCGGACTGCTCGAGCTGCTTCCGCGGCGAGAGCGGGTCGCCGCGTGCCGGCCGGGGGACGGACTGGGAACGGCTCCTTCGGGGGCCTTCCCCGGGCGTCGAACAGCCAACTCAGAACTGGTACGGACAAGGGGAATCCGACTGTTTAATTAAAACAAAGCATTGCGATGGTCCCTGCGGATGCTAACGCAATGTGATTTCTGCCCAGTGCTCTGAATGTCAAAGTGAAGAAATTCAACCAAGCGCGGGTAAACGGCGGGAGTAACATATGACTCTCTTAAGGTAGCCAAATGCCTCGTCATCTAATTAGTGACGCGCATGAATGGATTAACGAGATTCCCACTGTCCCTGTCTACTATCCAGCGAAACCACAGCCAAGGGAACGGGCTGTGGCAGAATCAGCGGGGAAAGAAGACCCTGTTGAGCTTGACTCTAGTCCGACTTTGTGAAATGACTTGAGAGGTGTAGTACTAAGTGGGAGCCCTCGGGCGCAAGTGAAATACCACTACTTTTAACGTTATTTTACTTATTCCGTGAATCGGAGGCCGGGGCACCGCCCCTCTTTTTGGACCCAAGGCTCGCTTCGGCGGGTCGATCCAGGCGGAAGACATTGTCAGGTGGGGAGTTTGGCTGGGGCGGCACATCTGTTAAAAGATAACGCAGGTGTCCTAAGATGAGCTCAACGAGAACAGAAATCTCGTGTGGAACAAAAGGGTAAAAGCTCGTTTGATTCTGATTTCCAGTACGAATACGAACCGTGAAAGCGTGGCCTAACGATCCTTTAGACCTTCGGAATTTGAAGCTAGAGGTGTCAGAAAAGTTACCACAGGGATAACTGGCTTGTGGCAGCCAAGCGTTCATAGCGACGTTGCTTTTTGATCCTTCGATGTCGGCTCTTCCTATCATTGTGAAGCAGAATTCACCAAGTGTTGGATTGTTCACCCACCAATAGGGAACGTGAGCTGGGTTTAGACCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTTACCCTACTGATGCCCGCGTCGCGATAGTAATTCAACCTAGTACGAGAGGAACCGTTGATTCGCACAATTGGTCATCGCGCTTGGTTGAAAAGCCAGTGGCGCGAAGCTACCGTGCGCTGGATTATGACTGAACGCCTCTAAGTCAGAATCCGGGCTAGAAGCGACGCATGCGCCCGCCGCCCGATTGCCGACCCTCAGTAGGAGCTTAGGCTCCAAAGGCACGTGTCGTTGGCTAAGTCCGTTCGGCGGAACGGTCGTTCGGACCGCCTTGAATTATAATTACCACCGAGCGGCGGGTAGAATCCTTTGCAGACGACTTAAATACGCGACGGGGTATTGTAAGTGGCAGAGTGGCCTTGCTGCCACGATCCACTGAGATTCAGCCCTTTGTCGCTAAGATTCGA
通过Oligo7开发基于菊属植物重复序列的寡核苷酸探针，确定寡核苷酸混合探针套序列及荧光标记特征如下：
①5S rDNA寡核苷酸探针套
②45S rDNA寡核苷酸探针套
实施例2制备菊属植物5S rDNA和45S rDNA寡核苷酸探针套杂交液
寡核苷酸探针套杂交液配置体系如下：
进一步的，所述寡核苷酸混合探针套中，各探针浓度为JH 5SrDNA-1(0.55ng/μL)；JH 5S rDNA-2(0.55ng/μL)；JH 5.8S rDNA-1(0.55ng/μL)；JH 5.8S rDNA-2(0.55ng/μL)；JH 18S rDNA-1(0.55ng/μL)；JH 18S rDNA-2(0.55ng/μL)；JH 18S rDNA-3(0.55ng/μL)；JH28S rDNA-1(0.55ng/μL)；JH 28S rDNA-2(0.55ng/μL)；JH 28S rDNA-3(0.55ng/μL)；JH28S rDNA-4(0.55ng/μL)；JH 28S rDNA-5(0.55ng/μL)。各探针加入量均为0.5μL。
将上述成分于1.5mL离心管中混匀，振荡离心后置于105℃的加热块中变性13min，取出后迅速置于-20℃冰酒精中处理10min制备得到寡核苷酸探针套杂交液。
实施例3菊属植物5S rDNA和45S rDNA寡核苷酸探针套信号检测及高分辨率染色体荧光原位杂交
实验材料：菊花脑(C.nankinense)染色体。
试验方法：
(1)菊属植物根尖处理：将实验材料分别扩繁于MS培养基，于25℃的恒温培养室，取继代4-5次的菊属植物组培苗，去除体内残余的外源激素，选取继代后的菊属植物组培苗进行生根观察，待组培苗出现4-5条长度为2-3cm的根系时，将组培苗从MS培养基中连根取出洗净，将根系浸入装有0.2μmol/L甲基氨草磷溶液的培养皿中处理4h后用清水冲净，剪下根系置于1.5mL打有小孔离心管中，1.1Mpa下N2O处理40min；加入体积百分比90％冰醋酸冰上处理10min，再换至装有70％乙醇的1.5mL离心管中-20℃下保存；
(2)菊属植物有丝分裂中期染色体制片：取步骤(1)处理得到的菊属植物根尖进行染色体制片，利用相差显微镜观察，挑选染色体分散良好、形态结构清晰且重叠较少，可用于荧光原位杂交的有丝分裂中期染色体制片放在-80℃冰箱保存，过夜揭片，置于100％乙醇溶液中脱水30min，晾干备用；
(3)荧光原位杂交：取步骤(2)挑选的染色体制片，置于44℃水浴的碱变性液(将NaOH与体积百分比70％乙醇以6g/L的比例溶解混匀配制而成)中变性4min，接着依次置于体积百分比70％乙醇、70％乙醇、100％乙醇溶液中，室温下依次梯度脱水各5min，晾干备用；取实施例1制备的寡核苷酸探针套杂交液，以17μL/片的滴加量，缓慢滴加在制片上，盖上盖玻片，置于37℃2×SSC润湿的湿盒(置于37℃恒温箱)中杂交培养6h以上；
(4)洗片及镜检：揭去盖玻片，先用缓水流冲洗制片10s左右；44℃水浴条件下，2×SSC、2×SSC、ddH2O溶液中各浸洗5min，晾干后在制片上滴加8uL DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)封片；
将封片后的染色体制片置于Olympus BX60型荧光显微镜下镜检，利用SPOT CCD(SPOT Cooled Color Digital Camera)拍摄菊属植物有丝分裂中期染色体图像，并通过Photoshop(v6.0)对获得的图像进行处理。
核型分析时，每个材料观察3-12个细胞，从中选取染色体数完整且分散良好的1个细胞利用Photoshop(v6.0)进行核型分析，少数材料由于染色体重叠或不完整等原因需选用2个细胞进行核型分析。
运用本方法对菊花脑有丝分裂间期染色体制片进行寡核苷酸探针套信号检测，其结果如图2所示，由图中可以看出：采用该混合探针套进行FISH分析，通过FAM(箭头)和TAMRA(三角形)信号及其强度，信号清晰且无信号重叠现象，从而可用于菊属植物5S rDNA和45S rDNA FISH核型分析。
对菊花脑有丝分裂中期染色体制片进行FISH分析，其结果如图3(a-d)所示，图3a为DAPI染色(蓝色)的菊花脑染色体；图3b为菊花脑染色体的FAM(绿色)信号；图3c中为菊花脑染色体TAMRA(红色)信号；图3d中为菊花脑染色体三色合成图像。
对比例1利用来自于小麦传统质粒探针进行分辨率染色体荧光原位杂交：
含有5S rDNA和45S rDNA序列的质粒由南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室细胞遗传所惠赠，并通过缺刻平移法用Digoxingen-11-dUTP和Fluorecein-12-dUTP(Roche)标记。结果显示：应用本方法开发的菊属植物5S rDNA和45S rDNA寡核苷酸探针套进行FISH检测，发现采用本方法所观察到的染色体制片中的荧光信号相较于利用来自于小麦传统质粒探针更为稳定，标记的荧光信号更为丰富，有丝分裂相更加清晰(图4)。其中5S rDNA寡核苷酸探针信号强度相较于质粒探针增加了16.7％，45S rDNA寡核苷酸信号数相较于质粒探针增加了12.5％(图4)。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种基于菊花近缘种属植物参考基因组的核糖体DNA寡核苷酸混合探针套及开发方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggagttctga tgggatccgg tgcattagtg 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcacccaag ccagtactac tctcgcccaa 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgatgcgtga gccgagatat ccgttgccga 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgaattgcag aatcccgtga accatcgagt 30
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgccagttgt catatgcttg tctcaaagat t 31
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcaaatttct gccctatcaa ctttcgatgg t 31
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gggttcgatt ccggagaggg agcctgagaa ac 32
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tttctgccca gtgctctgaa tgtcaaagtg aag 33
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
actctcttaa ggtagccaaa tgcctcgtca tctaattagt 40
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acgagattcc cactgtccct gtctactatc cagcgaaacc 40
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gggagtttgg ctggggcggc acatctgtta aaa 33
<210> 12
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgaagctaga ggtgtcagaa aagttaccac agggataa 38
<210> 13
<211> 123
<212> DNA
<213> 菊花‘神马(Chrysanthemum morifolium'Jinba')
<400> 13
gtcacccaag ccagtactac tctcgcccaa gcacgcttaa ctgcggagtt ctgatgggat 60
ccggtgcatt agtgtagtac taagagcagt gaccacccgg gaagtcctcg tgttgcatcc 120
ctc 123
<210> 14
<211> 164
<212> DNA
<213> 菊花‘神马(Chrysanthemum morifolium'Jinba')
<400> 14
aaacgactct cggcaacgga tatctcggct cacgcatcga tgaagaacgt agcaaaatgc 60
gatacttggt gtgaattgca gaatcccgtg aaccatcgag tttttgaacg caagttgcgc 120
ccgaagcctt ttggccgagg gcacgtctgc ctgggcgtca ccaa 164
<210> 15
<211> 952
<212> DNA
<213> 菊花‘神马(Chrysanthemum morifolium'Jinba')
<400> 15
tacctggttg atcctgccag tagtcatatg cttgtctcaa agattaagcc atgcatgtgt 60
aagtatgaac aaattcagac tgtgaaactg cgaatggctc attaaatcag ttatagtttg 120
tttgatggta tctgctactc ggataaccgt agtaattcta gagctaatat gtgcaacaaa 180
ccccgactta tggaagggat gcatttatta gataaaaggt cgacgcgggc tctgcccgtt 240
gctccgatga ttcatgataa ctcgacggat cgcacggcct ttgtgccggc gacgcatcat 300
tcaaatttct gccctatcaa ctttcgatgg taggatagtg gcctactatg gtggtgacgg 360
gtgacggaga attagggttc gattccggag agggagcctg agaaacggct accacatcca 420
aggaaggcag caggcgcgca aattacccaa tcctgacacg gggaggtagt gacaataaat 480
aacaataccg ggctcatatg agtctggtaa ttggaatgag tacaatctaa atcccttaac 540
gaggatccat tggagggcaa gtctggtgcc agcagccgcg gtaattccag ctccaatagc 600
gtatatttaa gttgttgcag ttaaaaagct cgtagttgga ctttgggttg ggtcggccgg 660
tccgccttta ggtgtgcacc ggtttactcg tcccttctgt cggcgatgcg ctcctggcct 720
taattggccg ggtcgtgcct ccggcgctgt tactttgaag aaattagagt gctcaaagca 780
agcctacgct ctgtatacat tagcatggga taacatcata ggatttcggt cctattacgt 840
tggccttcgg gatcggagta atgattaaca gggacagtcg ggggcattcg tatttcatag 900
tcagaggtga aattcttgga tttatgaaag acgaacaact gcgaaagcat tt 952
<210> 16
<211> 3402
<212> DNA
<213> 菊花‘神马(Chrysanthemum morifolium'Jinba')
<400> 16
cgaccccagg tcaggcggga ttacccgctg agtttaagca tatcaataag cggaggaaaa 60
gaaactaaca aggattccct tagtaacggc gagcgaaccg ggaagagccc agcttgaaaa 120
tcggacgtct tcggcgttcg aattgtagtc tggagaagcg tcctcagcga cggaccgggc 180
ctaagttccc tggaaagggg cgccagagag ggtgagagcc cgtcgtgccc ggaccctgtc 240
gcaccacgag gcgctgtcta cgagtcgggt tgtttgggaa tgcagcccca atcgggcggt 300
aaattccgtc caaggctaaa tacgggcgag agaccgatag cgaacaagta ccgcgaggta 360
aagatgaaaa ggactttgaa aagagagtca aagagtgctt gaaattgtcg ggagggaagc 420
ggatgggggc cggcgatgcg tcctggtcgg atgcggaacg gagcaatccg gtccgccgat 480
cgattcgggg cgtggaccga cgcggattac ggtggcggcc taagcccggg cttttgatac 540
gcttgtggag acgtcgctgc cgtgatcgtg gtctgcagca cgcgcctaac ggcgtgcctc 600
ggcatcagcg tgctccgggc gtcggcctgt gggctcccca ttcgacccgt cttgaaacac 660
ggaccaagga gtctgacatg tgtgcgagtc aacgggtgag taaacccgta aggcgcaagg 720
aagctgattg gcgggatcct cgcgggtgca ccgccgaccg accttgatct tctgagaagg 780
gttcgagtgt gagcatgcct gtcgggaccc gaaagatggt gaactatgcc tgagcggggc 840
aaagccagag gaaactctgg tggaggcccg cagcgatact gacgtgcaaa tcgttcgtct 900
gacttgggta taggggcgaa agactaatcg aaccgtctag tagctggttc cctccgaagt 960
ttccctcagg atagctggag cccggacgcg agttctatcg ggtaaagcga atgattagag 1020
gcatcggggg cgtaacgccc tcgacctatt ctcaaacttt aaataggtag gacgtcgcgg 1080
ctgctttgtt gagccgccac acggaatcga gagctccaag tgggccattt ttggtaagca 1140
gaactggcga tgcgggatga accggaagcc gggttacggt gccaaactgc gcgctaacct 1200
agaacccaca aagggtgttg gtcgattaag agcaacagca ggacggtggt catggaagtc 1260
gaaatccgct aaggagtgtg taacaactca cctgccgaat caactagccc cgaaaatgga 1320
tggcgcttaa gcgcgcgacc tacacccggc cgtcgaggca agagccaggc cccgatgagt 1380
aggagggcgc ggcggtcgct gcaaaaccta gggcgtgagc ccaggcggag cggccgtcgg 1440
tgcagatctt ggtggtagta gcaaatattc aaatgagaac tttgaaggcc gaagagggga 1500
aaggttccat gtgacacggc acttgcacat gggttagtcg atcctaagag acgggggaaa 1560
cccgtcagat agcgcgtttt gcgcgagctt cgaaagggaa tcgggttaaa attcctgaac 1620
cgggacgtgg cggctgacgg caacgttagg gagtccggag acgtcggctg gggcctcggg 1680
aagagttatc ttttctgttt aacagcctgc ccaccctgga aacgactcag tcggaggtag 1740
ggtccagcgg ctggaagagc accgcacgtg tccgcgcggt gtccggtgcg cccccggcgg 1800
cccttgaaaa tccggaggac cgagtgcctc ccacgcccgg tcgtactcat aaccgcatca 1860
ggtctccaca ggtgaacagc ctctggtcga tggaacaatg taggcaaggg aagtcggcaa 1920
aatggatccg taacctcggg aaaaggattg gctctgaggg ctgggcacgg ggtcggtccc 1980
agttccgaac ccgtcggctg tcggcggact gctcgagctg cttccgcggc gagagcgggt 2040
cgccgcgtgc cggccggggg acggactggg aacggctcct tcgggggcct tccccgggcg 2100
tcgaacagcc aactcagaac tggtacggac aaggggaatc cgactgttta attaaaacaa 2160
agcattgcga tggtccctgc ggatgctaac gcaatgtgat ttctgcccag tgctctgaat 2220
gtcaaagtga agaaattcaa ccaagcgcgg gtaaacggcg ggagtaacat atgactctct 2280
taaggtagcc aaatgcctcg tcatctaatt agtgacgcgc atgaatggat taacgagatt 2340
cccactgtcc ctgtctacta tccagcgaaa ccacagccaa gggaacgggc tgtggcagaa 2400
tcagcgggga aagaagaccc tgttgagctt gactctagtc cgactttgtg aaatgacttg 2460
agaggtgtag tactaagtgg gagccctcgg gcgcaagtga aataccacta cttttaacgt 2520
tattttactt attccgtgaa tcggaggccg gggcaccgcc cctctttttg gacccaaggc 2580
tcgcttcggc gggtcgatcc aggcggaaga cattgtcagg tggggagttt ggctggggcg 2640
gcacatctgt taaaagataa cgcaggtgtc ctaagatgag ctcaacgaga acagaaatct 2700
cgtgtggaac aaaagggtaa aagctcgttt gattctgatt tccagtacga atacgaaccg 2760
tgaaagcgtg gcctaacgat cctttagacc ttcggaattt gaagctagag gtgtcagaaa 2820
agttaccaca gggataactg gcttgtggca gccaagcgtt catagcgacg ttgctttttg 2880
atccttcgat gtcggctctt cctatcattg tgaagcagaa ttcaccaagt gttggattgt 2940
tcacccacca atagggaacg tgagctgggt ttagaccgtc gtgagacagg ttagttttac 3000
cctactgatg cccgcgtcgc gatagtaatt caacctagta cgagaggaac cgttgattcg 3060
cacaattggt catcgcgctt ggttgaaaag ccagtggcgc gaagctaccg tgcgctggat 3120
tatgactgaa cgcctctaag tcagaatccg ggctagaagc gacgcatgcg cccgccgccc 3180
gattgccgac cctcagtagg agcttaggct ccaaaggcac gtgtcgttgg ctaagtccgt 3240
tcggcggaac ggtcgttcgg accgccttga attataatta ccaccgagcg gcgggtagaa 3300
tcctttgcag acgacttaaa tacgcgacgg ggtattgtaa gtggcagagt ggccttgctg 3360
ccacgatcca ctgagattca gccctttgtc gctaagattc ga 3402

Claims (9)

1.一种基于菊花近缘种属植物参考基因组的核糖体DNA寡核苷酸混合探针套，其特征在于，所述寡核苷酸混合探针套包括5S rDNA寡核苷酸探针套和45S rDNA寡核苷酸探针套，所述5S rDNA寡核苷酸探针套和45S rDNA寡核苷酸探针套序列特征如下：
所述5S rDNA寡核苷酸探针套由JH5S rDNA-1和JH5S rDNA-2构成，所述JH5S rDNA-1和JH5S rDNA-2核苷酸的序列如下：
探针名称 探针序列及标记 序列号 JH5S rDNA-1 TAMRA -5’- GGAGTTCTGATGGGATCCGGTGCATTAGTG -3’-TAMRA SEQ ID NO.1 JH5S rDNA-2 TAMRA -5’- GTCACCCAAGCCAGTACTACTCTCGCCCAA -3’-TAMRA SEQ ID NO.2
所述45S rDNA寡核苷酸探针套由JH5.8S rDNA-1、JH5.8S rDNA-2、JH18S rDNA-1、JH18S rDNA-2、JH18S rDNA-3、JH28S rDNA-1、JH28S rDNA-2、JH28S rDNA-3、JH28S rDNA-4和JH28S rDNA-5构成，所述JH5.8S rDNA-1、JH5.8S rDNA-2、JH18S rDNA-1、JH18S rDNA-2、JH18S rDNA-3、JH28S rDNA-1、JH28S rDNA-2、JH28S rDNA-3、JH28S rDNA-4和JH28S rDNA-5核苷酸的序列如下：
探针名称 探针序列及标记 序列号 JH5.8S rDNA-1 FAM-5’- CGATGCGTGAGCCGAGATATCCGTTGCCGA -3’ SEQ ID NO.3 JH5.8S rDNA-2 FAM-5’- TGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGT -3’ SEQ ID NO.4 JH18S rDNA-1 FAM-5’- TGCCAGTTGTCATATGCTTGTCTCAAAGATT -3’ SEQ ID NO.5 JH18S rDNA-2 FAM-5’-TCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGT-3’ SEQ ID NO.6 JH18S rDNA-3 FAM-5’- GGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAAC -3’ SEQ ID NO.7 JH28S rDNA-1 FAM-5’- TTTCTGCCCAGTGCTCTGAATGTCAAAGTGAAG-3’ SEQ ID NO.8 JH28S rDNA-2 FAM-5’- ACTCTCTTAAGGTAGCCAAATGCCTCGTCATCTAATTAGT-3’ SEQ ID NO.9 JH28S rDNA-3 FAM-5’-ACGAGATTCCCACTGTCCCTGTCTACTATCCAGCGAAACC-3’ SEQ ID NO.10 JH28S rDNA-4 FAM-5’- GGGAGTTTGGCTGGGGCGGCACATCTGTTAAAA -3’ SEQ ID NO.11 JH28S rDNA-5 FAM-5’- TGAAGCTAGAGGTGTCAGAAAAGTTACCACAGGGATAA -3’ SEQ ID NO.12
。
2.包含权利要求1所述寡核苷酸混合探针套的寡核苷酸探针套杂交液，其特征在于，所述寡核苷酸探针套杂交液每个制片成分包括：dFA 7.5μL，20×SSC 1.5μL，Salmon spermDNA 0.5μL，体积百分比50.0% Dextran Sulfate 1.5μL，权利要求1所述寡核苷酸混合探针套6.0μL；将所述成分于1.5mL或2.0mL离心管中混匀，振荡离心后置于105℃加热变性10-13min，取出后迅速置于-20℃冰酒精中处理10min以上，制备得到所述寡核苷酸探针套杂交液。
3.根据权利要求2所述的寡核苷酸探针套杂交液，其特征在于，所述寡核苷酸混合探针套中，各探针浓度为：JH 5SrDNA-1 0.55ng/μL；JH 5S rDNA-2 0.55ng/μL；JH 5.8S rDNA-10.55ng/μL；JH 5.8S rDNA-2 0.55ng/μL；JH 18S rDNA-1 0.55ng/μL；JH 18S rDNA-20.55ng/μL；JH 18S rDNA-3 0.55ng/μL；JH 28S rDNA-1 0.55ng/μL；JH 28S rDNA-20.55ng/μL；JH 28S rDNA-3 0.55ng/μL；JH 28S rDNA-4 0.55ng/μL；JH 28S rDNA-50.55ng/μL；各探针加入量均为0.5μL。
4.一种利用权利要求1所述寡核苷酸混合探针套或权利要求2所述的寡核苷酸探针套杂交液进行菊属植物高分辨率染色体荧光原位杂交的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）将菊属植物有丝分裂中期制片置于44℃水浴的碱变性液中变性4 min，接着依次置于体积百分比70%乙醇、70%乙醇、100%乙醇溶液中，室温下依次梯度脱水各5 min，晾干备用；配制权利要求2所述寡核苷酸探针套杂交液，将所述寡核苷酸探针套杂交液以17μL/片的滴加量，滴加在制片上，盖上盖玻片，置于37℃ 2×SSC润湿的湿盒中杂交培养6 h以上；
（2）揭去盖玻片，先用缓水流冲洗制片；44℃水浴条件下，2×SSC、2×SSC、ddH2O溶液中各浸洗5min，晾干后在制片上滴加8uL DAPI封片；镜检。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述碱变性液是将NaOH与体积百分比70%乙醇以6g/L的比例溶解混匀配制而成。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）镜检具体为将封片后的染色体制片置于Olympus BX60型荧光显微镜下镜检，利用SPOT CCD拍摄菊属植物有丝分裂中期染色体图像，并通过Photoshop v6.0对获得的图像进行处理。
7.包含权利要求1所述寡核苷酸混合探针套或包含权利要求2所述的寡核苷酸探针套杂交液的检测试剂。
8.权利要求1所述寡核苷酸混合探针套，或权利要求2所述的寡核苷酸探针套杂交液，或权利要求7所述检测试剂在菊属植物高分辨率染色体荧光原位杂交中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，为在菊属植物高分辨率有丝分裂中期染色体荧光原位杂交中的应用。
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