CN110592262B - 蒙古栎ssr分子标记及其对应引物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及一种蒙古栎SSR分子标记及其对应引物和应用。10个SSR位点的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10序列，其对应的引物核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：30序列。通过本发明，能够为蒙古栎的鉴定、种质资源保护及良种选育提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及一种蒙古栎SSR分子标记及其对应引物和应用。
背景技术
蒙古栎(Quercus mongolica Fisch.ex Ledeb)属壳斗科、栎属，落叶乔木，高达30米，树皮灰褐色，深纵裂。树冠卵圆形。单叶互生、叶片倒卵形，叶波状齿缘，叶表面深绿色，背面淡绿色，花单性，雌雄同株，坚果卵形或椭圆形，种子具肉质子叶，是中国国家二级珍贵树种，也是中国东北林区中主要的次生林树种。主要分布在中国东北、华北、西北各地，华中地区亦少量分布。在俄罗斯、日本、蒙古及朝鲜半岛也有分布。蒙古栎是营造防护林、水源含量林以及防火林的优良树种，其在用材、工业原料、环境美化和生态恢复等方面具有十分重要的价值。其木材产品也被广泛地用于家具、建筑材料、铁路枕木、各类桶器以及矿柱等；蒙古栎结实丰富，是制作饲料、淀粉、酒精的原料；树皮、叶片、壳斗、提取物为制革、印染和渔业所必须的材料。长期以来，关于蒙古栎的研究主要集中在生态学和森林经营方面，对蒙古栎的遗传改良研究相对较少。目前，蒙古栎良种选育研究以树体生长指标、种子生长指标和生理指标为主，且大多是种源选择，利用这些方法选择出来的良种遗传增益较低，良种产量低，供应能力不足，无法满足生产对良种的需求。随着生物技术的飞速发展，植物组织培养、分子标记辅助育种、基因工程育种等已在林业上大量应用。因此，利用分子标记技术对栎类树种进行遗传改良研究，不仅可以加快育种进程，更能提高育种质量。
SSR(Simple Sequence Repeats)分子标记是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星DNA(Microsatellite DNA),是一类由几个核苷酸(一般为1～6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。每个SSR两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列。SSR分布于整个基因组中，而且其两端的序列一般为相对保守的单拷贝序列，据此可以设计特异引物进行SSR-PCR,以扩增串联重复序列,根据串联重复数的不同，就可以揭示微卫星DN A的多态性。因此，它是一种基于DN A长度多态性的分子标记。SSR与其他分子标记相比具有以下特点：①丰富性；②多态性高；③通用性与保守性；④共显性遗传；⑤以PCR为基础，反应速度快，易于检测；⑥结果稳定可靠，重复性好，便于实现自动化。利用SSR分子标记对栎类林木蒙古栎进行遗传多样性分析及品种鉴定研究，不仅可以从分子水平上分析其种源间的亲缘关系或家系间的遗传分化程度，进而能够大大提高良育种选择效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蒙古栎SSR分子标记及其对应引物和应用，为蒙古栎种源或家系的鉴定、种质资源保护及良种选育提供技术支撑。
本发明是这样实现的，蒙古栎SSR分子标记，其所对应的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10中的10个SSR位点。
蒙古栎SSR分子标记引物，其具有序列表中SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：30中的核苷酸序列。
所述的蒙古栎SSR分子标记及对应的SSR引物的核苷酸序列见表1：
表1
所述10个SSR位点的类型和重复单元见表2：
表2
筛选引物多态性过程中的PCR反应体系见表3，PCR反应程序见表4，引物的特性见表5：
表3
表4
表5
所述10个SSR位点的遗传多样性信息见表6：
表6
本发明提供的蒙古栎SSR分子标记引物用于鉴别不同蒙古栎种源或家系。
与现有技术相比，本发明的优点在于：开发的蒙古栎SSR分子标记特异引物，其在蒙古栎基因组中多态性高；以PCR为基础，反应速度快，易于检测；结果稳定可靠，重复性好，便于实现自动化。利用荧光标记物结合毛细管测序仪进行自动化检测，结果更加准确、高效。目前未查到有关蒙古栎SSR引物开发的报道。
附图说明
图1(a)为利用辽宁大孤家(DA)地区蒙古栎开发的引物N1010265特异吸收峰峰图；
图1(b)为利用辽宁哈达(HA)地区蒙古栎开发的引物N1010265特异吸收峰峰图；
图1(c)为利用辽宁宽甸(Kuan)地区蒙古栎开发的引物N1010265特异吸收峰峰图；
图1(d)为利用辽宁凌源(Ling)地区蒙古栎开发的引物N1010265特异吸收峰峰图；
图1(e)为利用辽宁清河城(Qing)地区蒙古栎开发的引物N1010265特异吸收峰峰图；
图1(f)为利用辽宁土城子(Tu)地区蒙古栎开发的引物N1010265特异吸收峰峰图；
图1(g)为利用辽宁湾甸子(Wan)地区蒙古栎开发的引物N1010265特异吸收峰峰图；
图1(h)为利用辽宁西丰(Xi-F)地区蒙古栎开发的引物N1010265特异吸收峰峰图；
图2(a)为利用辽宁大孤家(DA)地区蒙古栎开发的引物N1014482特异吸收峰峰图；
图2(b)为利用辽宁哈达(HA)地区蒙古栎开发的引物N1014482特异吸收峰峰图；
图2(c)为利用辽宁宽甸(Kuan)地区蒙古栎开发的引物N1014482特异吸收峰峰图；
图2(d)为利用辽宁凌源(Ling)地区蒙古栎开发的引物N1014482特异吸收峰峰图；
图2(e)为利用辽宁清河城(Qing)地区蒙古栎开发的引物N1014482特异吸收峰峰图；
图2(f)为利用辽宁土城子(Tu)地区蒙古栎开发的引物N1014482特异吸收峰峰图；
图2(g)为利用辽宁湾甸子(Wan)地区蒙古栎开发的引物N1014482特异吸收峰峰图；
图2(h)为利用辽宁西丰(Xi-F)地区蒙古栎开发的引物N1014482特异吸收峰峰图；
图3(a)为利用辽宁大孤家(DA)地区蒙古栎开发的引物N1105306特异吸收峰峰图；
图3(b)为利用辽宁哈达(HA)地区蒙古栎开发的引物N1105306特异吸收峰峰图；
图3(c)为利用辽宁宽甸(Kuan)地区蒙古栎开发的引物N1105306特异吸收峰峰图；
图3(d)为利用辽宁凌源(Ling)地区蒙古栎开发的引物N1105306特异吸收峰峰图；
图3(e)为利用辽宁清河城(Qing)地区蒙古栎开发的引物N1105306特异吸收峰峰图；
图3(f)为利用辽宁土城子(Tu)地区蒙古栎开发的引物N1105306特异吸收峰峰图；
图3(g)为利用辽宁湾甸子(Wan)地区蒙古栎开发的引物N1105306特异吸收峰峰图；
图3(h)为利用辽宁西丰(Xi-F)地区蒙古栎开发的引物N1105306特异吸收峰峰图；
图4(a)为利用辽宁大孤家(DA)地区蒙古栎开发的引物N1110207特异吸收峰峰图；
图4(b)为利用辽宁哈达(HA)地区蒙古栎开发的引物N1110207特异吸收峰峰图；
图4(c)为利用辽宁宽甸(Kuan)地区蒙古栎开发的引物N1110207特异吸收峰峰图；
图4(d)为利用辽宁凌源(Ling)地区蒙古栎开发的引物N1110207特异吸收峰峰图；
图4(e)为利用辽宁清河城(Qing)地区蒙古栎开发的引物N1110207特异吸收峰峰图；
图4(f)为利用辽宁土城子(Tu)地区蒙古栎开发的引物N1110207特异吸收峰峰图；
图4(g)为利用辽宁湾甸子(Wan)地区蒙古栎开发的引物N1110207特异吸收峰峰图；
图4(h)为利用辽宁西丰(Xi-F)地区蒙古栎开发的引物N1110207特异吸收峰峰图；
图5(a)为利用辽宁大孤家(DA)地区蒙古栎开发的引物N1345390特异吸收峰峰图；
图5(b)为利用辽宁哈达(HA)地区蒙古栎开发的引物N1345390特异吸收峰峰图；
图5(c)为利用辽宁宽甸(Kuan)地区蒙古栎开发的引物N1345390特异吸收峰峰图；
图5(d)为利用辽宁凌源(Ling)地区蒙古栎开发的引物N1345390特异吸收峰峰图；
图5(e)为利用辽宁清河城(Qing)地区蒙古栎开发的引物N1345390特异吸收峰峰图；
图5(f)为利用辽宁土城子(Tu)地区蒙古栎开发的引物N1345390特异吸收峰峰图；
图5(g)为利用辽宁湾甸子(Wan)地区蒙古栎开发的引物N1345390特异吸收峰峰图；
图5(h)为利用辽宁西丰(Xi-F)地区蒙古栎开发的引物N1345390特异吸收峰峰图；
图6(a)为利用辽宁大孤家(DA)地区蒙古栎开发的引物N12361特异吸收峰峰图；
图6(b)为利用辽宁哈达(HA)地区蒙古栎开发的引物N12361特异吸收峰峰图；
图6(c)为利用辽宁宽甸(Kuan)地区蒙古栎开发的引物N12361特异吸收峰峰图；
图6(d)为利用辽宁凌源(Ling)地区蒙古栎开发的引物N12361特异吸收峰峰图；
图6(e)为利用辽宁清河城(Qing)地区蒙古栎开发的引物N12361特异吸收峰峰图；
图6(f)为利用辽宁土城子(Tu)地区蒙古栎开发的引物N12361特异吸收峰峰图；
图6(g)为利用辽宁湾甸子(Wan)地区蒙古栎开发的引物N12361特异吸收峰峰图；
图6(h)为利用辽宁西丰(Xi-F)地区蒙古栎开发的引物N12361特异吸收峰峰图；
图7(a)为利用辽宁大孤家(DA)地区蒙古栎开发的引物N1247890特异吸收峰峰图；
图7(b)为利用辽宁哈达(HA)地区蒙古栎开发的引物N1247890特异吸收峰峰图；
图7(c)为利用辽宁宽甸(Kuan)地区蒙古栎开发的引物N1247890特异吸收峰峰图；
图7(d)为利用辽宁凌源(Ling)地区蒙古栎开发的引物N1247890特异吸收峰峰图；
图7(e)为利用辽宁清河城(Qing)地区蒙古栎开发的引物N1247890特异吸收峰峰图；
图7(f)为利用辽宁土城子(Tu)地区蒙古栎开发的引物N1247890特异吸收峰峰图；
图7(g)为利用辽宁湾甸子(Wan)地区蒙古栎开发的引物N1247890特异吸收峰峰图；
图7(h)为利用辽宁西丰(Xi-F)地区蒙古栎开发的引物N1247890特异吸收峰峰图；
图8(a)为利用辽宁大孤家(DA)地区蒙古栎开发的引物N1457047特异吸收峰峰图；
图8(b)为利用辽宁哈达(HA)地区蒙古栎开发的引物N1457047特异吸收峰峰图；
图8(c)为利用辽宁宽甸(Kuan)地区蒙古栎开发的引物N1457047特异吸收峰峰图；
图8(d)为利用辽宁凌源(Ling)地区蒙古栎开发的引物N1457047特异吸收峰峰图；
图8(e)为利用辽宁清河城(Qing)地区蒙古栎开发的引物N1457047特异吸收峰峰图；
图8(f)为利用辽宁土城子(Tu)地区蒙古栎开发的引物N1457047特异吸收峰峰图；
图8(g)为利用辽宁湾甸子(Wan)地区蒙古栎开发的引物N1457047特异吸收峰峰图；
图8(h)为利用辽宁西丰(Xi-F)地区蒙古栎开发的引物N1457047特异吸收峰峰图；
图9(a)为利用辽宁大孤家(DA)地区蒙古栎开发的引物N4544558特异吸收峰峰图；
图9(b)为利用辽宁哈达(HA)地区蒙古栎开发的引物N4544558特异吸收峰峰图；
图9(c)为利用辽宁宽甸(Kuan)地区蒙古栎开发的引物N4544558特异吸收峰峰图；
图9(d)为利用辽宁凌源(Ling)地区蒙古栎开发的引物N4544558特异吸收峰峰图；
图9(e)为利用辽宁清河城(Qing)地区蒙古栎开发的引物N4544558特异吸收峰峰图；
图9(f)为利用辽宁土城子(Tu)地区蒙古栎开发的引物N4544558特异吸收峰峰图；
图9(g)为利用辽宁湾甸子(Wan)地区蒙古栎开发的引物N4544558特异吸收峰峰图；
图9(h)为利用辽宁西丰(Xi-F)地区蒙古栎开发的引物N4544558特异吸收峰峰图；
图10(a)为利用辽宁大孤家(DA)地区蒙古栎开发的引物N4529840特异吸收峰峰图；
图10(b)为利用辽宁哈达(HA)地区蒙古栎开发的引物N4529840特异吸收峰峰图；
图10(c)为利用辽宁宽甸(Kuan)地区蒙古栎开发的引物N4529840特异吸收峰峰图；
图10(d)为利用辽宁凌源(Ling)地区蒙古栎开发的引物N4529840特异吸收峰峰图；
图10(e)为利用辽宁清河城(Qing)地区蒙古栎开发的引物N4529840特异吸收峰峰图；
图10(f)为利用辽宁土城子(Tu)地区蒙古栎开发的引物N4529840特异吸收峰峰图；
图10(g)为利用辽宁湾甸子(Wan)地区蒙古栎开发的引物N4529840特异吸收峰峰图；
图10(h)为利用辽宁西丰(Xi-F)地区蒙古栎开发的引物N4529840特异吸收峰峰图；
图11为1.2％琼脂糖凝胶电泳检测蒙古栎基因组DNA；
图12为抚顺清原地区栽植蒙古栎家系SSR聚类分析结果；
图13为辽宁省不同地区蒙古栎SSR聚类分析结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1、
本发明的序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10为蒙古栎基因组SSR位点N1010265、N1014482、N1105306、N1110207、N1345390、N12361、N1247890、N1457047、N4544558、N4529840的核苷酸序列。
本发明的序列表中SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：30为蒙古栎基因组SSR位点对应的引物(N1010265-F、N1010265-R、N1014482-F、N1014482-R、N1105306-F、N1105306-R、N1110207-F、N1110207-R、N1345390-F、N1345390-R、N12361-F、N12361-R、N1247890-F、N1247890-R、N1457047-F、N1457047-R、N4544558-F、N4544558-R、N4529840-F、N4529840-R)的核苷酸序列。
1、蒙古栎基因组SSR位点及引物开发
微卫星DNA是指基因组中由短的重复单元(一般为1～6个碱基)组成的DNA串联重复序列，又被称作短串连重复(Short Tandem Repeats,STRs)或简单重复序列(SimpleSequence Repeat,SSRs)。
广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，而且分布比较均匀，平均每10kb的DNA序列中就会出现一个微卫星序列，再加上SSR的重复次数不同和重复程度不同，使其呈现高度的多态性。
SSR的两端有一段保守的DNA序列，根据这段序列可以设计一段互补序列的寡聚核苷酸引物，对SSR进行PCR扩增。
在SSR引物的来源问题上，概括起来有以下四种途径：
相关文献；近缘种的引物；数据库搜寻法：利用专门的SSR分析软件(SSRHunter1.3)，搜索GenBank、UCSC、EMBL和DDBJ等公共数据库中的DNA序列和EST序列获得SSR序列，然后设计引物；引物开发。
2、蒙古栎DNA提取及质检
提取：采用CTAB法提取蒙古栎基因组DNA，步骤如下：
1)准备干净研钵、研杵、小匙、无水乙醇预先放入冰箱中预冷以减少液氮的用量，采新鲜幼嫩的蒙古栎叶片，用自来水、蒸馏水先后冲洗叶面，用滤纸吸干水分(叶片放入4℃冰箱里备用)。
2)取50～200g新鲜叶片剪成1cm长(每次用后剪刀用酒精擦干)，在液氮中研磨，待液氮蒸发后，将冻粉迅速转入灭过菌的1.5ml离心管中，加入500ul预热过(60℃)的CTAB提取液(100mM Tris-HCL PH8.0、20mM EDTA、1.4M NaCl、2％CTAB)和0.2％β-巯基乙醇，放入65℃水浴30min。每隔10min轻轻摇动混匀。
3)加等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻颠倒混匀10min，于台式冷冻离心机上12000rpm离心10min。
4)将上清液转入另一离心管中，重复步骤3，直至中间的蛋白质层看不见为止。
5)将上清液转入另一离心管中，加入2倍体积的预冷无水乙醇(或2/3体积的异丙醇)，轻轻颠倒混匀，使DNA沉淀成絮状，-20℃放置30min以上。
6)用移液器轻轻吸出废液保留絮状沉淀，如果样品出现云雾状沉淀或看不见沉淀，10 000rpm低速离心10min，收集沉淀。
7)加入1～1.5ml 70％无水乙醇冲洗液，轻摇几分钟，10 000rpm离心10min，收集沉淀，重复2次。然后将离心管倒置放在清洁场所晾干或在超净工作台上吹干。
8)用少量无菌的去离子水或TE溶液在4℃溶解DNA，不要摇动，静置1-2h左右。
质检：取2μl蒙古栎基因组DNA溶液，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。电泳缓冲液为1×TBE，电压150V电泳15min，标准对照(Marker)为D2000，从电泳结果图中可以看出电泳条带清晰完整，所得的DNA质量也较高，能够完全满足后续的实验要求。经过稀释使其浓度在20ng/μL左右。
3、二代测序
采用的引物开发方法为二代测序方法：使用第二代测序技术，对蒙古栎进行简单从头测序，得到基因组序列，筛选多态性序列。该方法较磁珠富集法快速、高效、数据量大；随着二代测序技术的发展，该方法可广泛应用。本方法基于hiseq 2500平台，使用Illumina配套试剂进行实验，得到二代测序数据。
4、根据测序结果的reads片段进行拼接，得到10个SSR位点的核苷酸序列，结果如下：
N1010265：
GTCATCCATCTCCGTCGCCGCAAGACTCTCCGGATGCTCCTTAACCGCACGGACCGACGATTCTCTCGCCGAAACGACTCCCCGTCGGAGATGGACTCCGATCCCAATCCCACATCGAGAAACAACAACAACAACAACAACAACAACAATAACAAGAACAACAATAAGAACGGTAGCAAAGAGGTTAGGGTTCGGCATAAGTTAAAGGACTTGTTCGTGTCCTCTCCGCCAATTGAAGATAGGGTTTCCGATTCTAGATTTAACC
N1014482：
AAATCTTAATGATATACTTTTAGCCAATGTTGCTGAATTTCCTTAATAAAGTTTACAGCCTTCTTCTCAAATAATAATAATAATAATGTGGGAGTGTAGGATCCGAACGCAACATAGAACCCATGGGCCCAGTCTGGGGATGGAAAAAGGCCCATTCGCACGTCAGTCCATGCTAGACACGTGGATAAGAATCCGAGGAGG
N1105306：
ATCTCCCTCCTCCTCTTCTTCTTCCAAACCTCGTCGCCACAGTTTCAAGCGCCTCCTCGATAGAACCATTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTGTTAGAGACAGAGACAGAAACAGAGACAGAGATCCTGTTGTTGTTGATGCGGATCCTAACGATGATGCCGTTCTAACCGACGCTGGTGCACCTC
N1110207：
ATTCATTAGAGAGAGAGAGAGAAACGTACGGGCAGTAGGATTTGGAGAAAAAGGCAATCTTGTTGGAGTAGATGGCGTTCTGTACGAAGGCCGAAGCCGAGGTGGAGGCTTTGACTTCCTTTGGTATGTGACCCAACAACAACAACAACAACAACAACCCGACCACTGCAACAACCCCCCTCAACTGAAAACTGCGCATCTTCGTTACGTTACCTTACGTGTC TCCAACACCGCTGTCGTTTTTCCTAG
N1345390：
TGACGAAGAAGAAGAAGAGGAGAGTTGATGAGTTAGGAGGCGTGATCGTACCTGCCGGTTTTCTCCAACAGCTTCCTCCTCCGGTAACTACGTCGGCGGTGACGACGACGACGACGACGACGGCGGCGGCGGCGGAGGTTCCGGTTGCGCAGTCGATTGTGAAATGCTCGTCTAAGCAGTTTTGGAA
N12361：
CTCTAATAAAAATCATGCACGTGGCATTTCCTCTATTTCTATAGACCACAATTCAGAGGTGAGAGACCTGACCTTATCACGACACGTCACGACCACTCACTACTAATTAAGACTAAATTCAGCCAATCCAAACAAACAAACAAACAAACAGACACTCTTTTGTCTTTTTTTGGACTACTCACACTCTACTCGACAGTGGCATTCTGCGTAAATAACTCCATTAAACAGTGGCCATTATTTCTTCCTCTTCTTCAACGTTCTCTCCCTCTCCCTC
N1247890：
ATGCTATAGGAGGAGGGTAAGCAAAGGTAAAAGCCACGTGAGGGACACGTGCTCATTAGGAAGGGTTTCTACTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTAGTTAAGTCGATTTTATAAACCCAAAACCTCACCATTTAAAATCCTAAATATATTGAGAGTCTCAGGTGAGGTCCCAGACCCAGAGTGGAGAAGTAGAAAGAAACGGTGGCGGAGTGATCGGAGTA GAGATGTGGTTCGTCGGCGGACTGTTTAGTAGGAGTAGGACT
N1457047：
GAGTTAGCACAAGCCAATGTAGAAGCCTTTCTCGTTATTCCTTAAAAAATAAATAAATAAATAAATATGTGATTTATTCACTCTTTTGCCTAAATTGTTACTCTTGAAACCACAGAATTAGTTTTTCGATAGTGGGTTGTTGTTGC TGTCCAAATTAGTTCTAGTGTTGCAGACGAGGTTTGTTAGTGAGGAAAGTTCATGTAGAAGAATTTTACAGTTCTGAGG
N4544558：
CAGGGATGAGCGTTCTCTATAGTCCATTTTTCTACTCTTGCCCTGGACGTCCACCCTGGACAACCGTCATGAACCAGCTTGGAGTTGGGTCCATTTTATAATACACCATCAATAATAATAATAATAATTACTTTTGATGTACCGGCATGCAGCTTGAATATGAATTTATTTGGTCCAACTCTGCAGGCCTTAATCAAGTCTTGAGTAATGTGTAGGCAGTTACG
N4529840：
CCATTTTCTCACTAATCAAACATGTTTTCGGTTCGCTCAATCCTCGCTCTCCAGCTAAGACGCTCAATC CTCCTACTGCATTCTTCTTCTTCTTCGTATTCTACTTCTTCCGCTGCTGCGGTGCAAGCCGAGCGAGCGATAAGCGAAGGTCCGAGAAACGATTGGACACGAGACGAGATCAAATCCGTCTACGACTCGCCGGTTCTCGATCTCCTTTTCCACG GAGTGAGTTTCGATTCTCTATTC
各个SSR位点的类型和重复单元见表2：
表2
5、引物设计合成
使用Primer Premier 5.0设计引物，得到的10个引物对的核苷酸序列如下表：
引物特性见下表：
6、筛选引物多态性1)PCR体系
2)PCR程序
3)琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，挑选有目的条带的产物，使用3730xl基因分析仪检测：
96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液(0.5：8.5)9μl，PCR产物1.0μl；95℃变性3min，上机检测。
对辽宁不同地区(DA：大孤家；LING：凌源；WAN：湾甸子；QING：清河城；XIFENG：西丰；TU：土城子；KUAN：宽甸；HA：哈达)的蒙古栎的开发引物的检测结果(即10对引物的吸收峰结果)见图1(a)、图1(b)、图1(c)、图1(d)、图1(e)、图1(f)、图1(g)、图1(h)；图2(a)、图2(b)、图2(c)、图2(d)、图2(e)、图2(f)、图2(g)、图2(h)；图3(a)、图3(b)、图3(c)、图3(d)、图3(e)、图3(f)、图3(g)、图3(h)；图4(a)、图4(b)、图4(c)、图4(d)、图4(e)、图4(f)、图4(g)、图4(h)；图5(a)、图5(b)、图5(c)、图5(d)、图5(e)、图5(f)、图5(g)、图5(h)；图6(a)、图6(b)、图6(c)、图6(d)、图6(e)、图6(f)、图6(g)、图6(h)；图7(a)、图7(b)、图7(c)、图7(d)、图7(e)、图7(f)、图7(g)、图7(h)；图8(a)、图8(b)、图8(c)、图8(d)、图8(e)、图8(f)、图8(g)、图8(h)；图9(a)、图9(b)、图9(c)、图9(d)、图9(e)、图9(f)、图9(g)、图9(h)；图10(a)、图10(b)、图10(c)、图10(d)、图10(e)、图10(f)、图10(g)、图10(h)。
7、数据分析
将整理好的SSR数据，运用PopGene32、NTSYS软件进行遗传多样性指标分析、聚类分析，遗传多样性指标结果见表6：
表6
聚类分析结果见图12和图13，其中图12为辽宁湾甸子地区栽植蒙古栎家系SSR聚类分析结果，图13为辽宁省8个不同地区蒙古栎SSR聚类分析结果(DA：大孤家；LING：凌源；WAN：湾甸子；QING：清河城；XIFENG：西丰；TU：土城子；KUAN：宽甸；HA：哈达)。
SEQUENCE LISTING
<110> 辽宁省林业科学研究院
<120> 蒙古栎SSR分子标记及其对应引物和应用
<130> 2019
<160> 30
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 265
<212> DNA
<213> 蒙古栎（Quercus mongolica Fisch. ex Ledeb）
<400> 1
gtcatccatc tccgtcgccg caagactctc cggatgctcc ttaaccgcac ggaccgacga 60
ttctctcgcc gaaacgactc cccgtcggag atggactccg atcccaatcc cacatcgaga 120
aacaacaaca acaacaacaa caacaacaat aacaagaaca acaataagaa cggtagcaaa 180
gaggttaggg ttcggcataa gttaaaggac ttgttcgtgt cctctccgcc aattgaagat 240
agggtttccg attctagatt taacc 265
<210> 2
<211> 201
<212> DNA
<213> 蒙古栎（Quercus mongolica Fisch. ex Ledeb）
<400> 2
aaatcttaat gatatacttt tagccaatgt tgctgaattt ccttaataaa gtttacagcc 60
ttcttctcaa ataataataa taataatgtg ggagtgtagg atccgaacgc aacatagaac 120
ccatgggccc agtctgggga tggaaaaagg cccattcgca cgtcagtcca tgctagacac 180
gtggataaga atccgaggag g 201
<210> 3
<211> 185
<212> DNA
<213> 蒙古栎（Quercus mongolica Fisch. ex Ledeb）
<400> 3
atctccctcc tcctcttctt cttccaaacc tcgtcgccac agtttcaagc gcctcctcga 60
tagaaccatt tcttcttctt cttcttcttc tgttagagac agagacagaa acagagacag 120
agatcctgtt gttgttgatg cggatcctaa cgatgatgcc gttctaaccg acgctggtgc 180
acctc 185
<210> 4
<211> 249
<212> DNA
<213> 蒙古栎（Quercus mongolica Fisch. ex Ledeb）
<400> 4
attcattaga gagagagaga gaaacgtacg ggcagtagga tttggagaaa aaggcaatct 60
tgttggagta gatggcgttc tgtacgaagg ccgaagccga ggtggaggct ttgacttcct 120
ttggtatgtg acccaacaac aacaacaaca acaacaaccc gaccactgca acaacccccc 180
tcaactgaaa actgcgcatc ttcgttacgt taccttacgt gtctccaaca ccgctgtcgt 240
ttttcctag 249
<210> 5
<211> 187
<212> DNA
<213> 蒙古栎（Quercus mongolica Fisch. ex Ledeb）
<400> 5
tgacgaagaa gaagaagagg agagttgatg agttaggagg cgtgatcgta cctgccggtt 60
ttctccaaca gcttcctcct ccggtaacta cgtcggcggt gacgacgacg acgacgacga 120
cggcggcggc ggcggaggtt ccggttgcgc agtcgattgt gaaatgctcg tctaagcagt 180
tttggaa 187
<210> 6
<211> 274
<212> DNA
<213> 蒙古栎（Quercus mongolica Fisch. ex Ledeb）
<400> 6
ctctaataaa aatcatgcac gtggcatttc ctctatttct atagaccaca attcagaggt 60
gagagacctg accttatcac gacacgtcac gaccactcac tactaattaa gactaaattc 120
agccaatcca aacaaacaaa caaacaaaca gacactcttt tgtctttttt tggactactc 180
acactctact cgacagtggc attctgcgta aataactcca ttaaacagtg gccattattt 240
cttcctcttc ttcaacgttc tctccctctc cctc 274
<210> 7
<211> 265
<212> DNA
<213> 蒙古栎（Quercus mongolica Fisch. ex Ledeb）
<400> 7
atgctatagg aggagggtaa gcaaaggtaa aagccacgtg agggacacgt gctcattagg 60
aagggtttct actttctttc tttctttctt tctttctagt taagtcgatt ttataaaccc 120
aaaacctcac catttaaaat cctaaatata ttgagagtct caggtgaggt cccagaccca 180
gagtggagaa gtagaaagaa acggtggcgg agtgatcgga gtagagatgt ggttcgtcgg 240
cggactgttt agtaggagta ggact 265
<210> 8
<211> 225
<212> DNA
<213> 蒙古栎（Quercus mongolica Fisch. ex Ledeb）
<400> 8
gagttagcac aagccaatgt agaagccttt ctcgttattc cttaaaaaat aaataaataa 60
ataaatatgt gatttattca ctcttttgcc taaattgtta ctcttgaaac cacagaatta 120
gtttttcgat agtgggttgt tgttgctgtc caaattagtt ctagtgttgc agacgaggtt 180
tgttagtgag gaaagttcat gtagaagaat tttacagttc tgagg 225
<210> 9
<211> 224
<212> DNA
<213> 蒙古栎（Quercus mongolica Fisch. ex Ledeb）
<400> 9
cagggatgag cgttctctat agtccatttt tctactcttg ccctggacgt ccaccctgga 60
caaccgtcat gaaccagctt ggagttgggt ccattttata atacaccatc aataataata 120
ataataatta cttttgatgt accggcatgc agcttgaata tgaatttatt tggtccaact 180
ctgcaggcct taatcaagtc ttgagtaatg tgtaggcagt tacg 224
<210> 10
<211> 246
<212> DNA
<213> 蒙古栎（Quercus mongolica Fisch. ex Ledeb）
<400> 10
ccattttctc actaatcaaa catgttttcg gttcgctcaa tcctcgctct ccagctaaga 60
cgctcaatcc tcctactgca ttcttcttct tcttcgtatt ctacttcttc cgctgctgcg 120
gtgcaagccg agcgagcgat aagcgaaggt ccgagaaacg attggacacg agacgagatc 180
aaatccgtct acgactcgcc ggttctcgat ctccttttcc acggagtgag tttcgattct 240
ctattc 246
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
agactctccg gatgctcctt 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
atgccgaacc ctaacctctt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gccaatgttg ctgaatttcc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tctagcatgg actgacgtgc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tcttcttcca aacctcgtcg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ggttagaacg gcatcatcgt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gttctgtacg aaggccgaag 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cggtgttgga gacacgtaag 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ttaggaggcg tgatcgtacc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
agacgagcat ttcacaatcg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gacacgtcac gaccactcac 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ttacgcagaa tgccactgtc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
agggacacgt gctcattagg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ctctactccg atcactccgc 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
agcacaagcc aatgtagaag c 21
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
tttggacagc aacaacaacc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ttctactctt gccctggacg 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
taaggcctgc agagttggac 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
ccagctaaga cgctcaatcc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
aatcgaaact cactccgtgg 20
Claims (6)
1.蒙古栎SSR分子标记，其特征在于，其所对应的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10中的10个SSR位点；
10个SSR位点的类型和重复单元见表2：
表2
2.如权利要求1所述的蒙古栎SSR分子标记引物，其特征在于，所述SSR分子标记引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：30所示。
3.如权利要求1所述的蒙古栎SSR分子标记或如权利要求2所述的蒙古栎SSR分子标记引物，其特征在于，所述的蒙古栎SSR分子标记及对应的SSR引物的核苷酸序列见表1：
表1
4.如权利要求2所述的蒙古栎SSR分子标记引物，其特征在于，筛选引物多态性过程中的PCR反应体系见表3，PCR反应程序见表4，引物的特性见表5：
表3
表4
表5
5.如权利要求1所述的蒙古栎SSR分子标记，其特征在于，所述10个SSR位点的遗传多样性信息见表6：
表6
6.如权利要求2所述的蒙古栎SSR分子标记引物的应用，其特征在于，用于鉴别不同种源或家系的蒙古栎。
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|---|---|---|---|
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| KR20180118485A (ko) * | 2017-04-21 | 2018-10-31 | 연세대학교 산학협력단 | 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기 진단용 조성물, 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기 진단 방법, 및 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기를 예방 또는 치료하기 위한 조성물 |
-
2019
- 2019-10-12 CN CN201910966646.8A patent/CN110592262B/zh active Active
Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| KR20180118485A (ko) * | 2017-04-21 | 2018-10-31 | 연세대학교 산학협력단 | 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기 진단용 조성물, 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기 진단 방법, 및 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기를 예방 또는 치료하기 위한 조성물 |
| CN107419003A (zh) * | 2017-04-25 | 2017-12-01 | 山西省林业科学研究院 | 辽东栎的ssr分子标记引物和鉴定辽东栎品种的方法及其应用 |
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| "基于 SSR 标记的辽宁蒙古栎天然群体遗传多样性研究";陈罡等;《沈阳农业大学学报》;20201231;第51卷(第6期);第727-733页 * |
| "基于高通量测序方法的蒙古栎SSR标记开发";陈罡等;《中国农学通报》;20211231;第37卷(第16期);第13-17页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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