CN107058308A - 一种荒漠植物霸王的微卫星分子标记及其应用 - Google Patents
一种荒漠植物霸王的微卫星分子标记及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了霸王(Sarcozygium xanthoxylon Bunge)属植株的微卫星位点SEQ ID NO1～SEQ ID NO9的序列及其引物对SEQ ID NO10～SEQ ID NO27，以及上述微卫星位点与引物对的筛选方法，包括提取DNA、构建DNA‑seq文库并高通量测序；筛选并检测微卫星位点及其特异性引物对等步骤。本发明筛选方法获得霸王的微卫星位点以及特异性引物可以提供在霸王属蒺藜科植株中基因的标记、定位与QTL分析，品种鉴定，种群及进化研究，分子标记辅助育种方面的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种荒漠植物霸王的微卫星分子标记及其应用。
背景技术
霸王(Sarcozygium xanthoxylon Bunge)隶属于蒺藜科，霸王属。是分布于我国西北部干旱荒漠区的小灌木，在蒙古地区也有分布。该植物多生长于干旱的砂地、多石砾地以及覆沙地上，是荒漠灌丛植被的主要优势种和建群种之一。其抗逆性强，生态可塑性大，具有较好的饲用价值和适口性。霸王草地也成为我国西北地区的主要放牧地。然而在我国的分布地区多为生态脆弱地带，尤其因为长期过度放牧退化迅速荒漠化日趋严重，现有霸王群落多分布相对稀疏，且破坏严重，生物量低。
由于自然、历史以及现实的种种原因，目前我国仍然承受着不同程度的荒漠化的严重困扰。根据第三次全国荒漠化监测的数据来看，我国荒漠化面积达到了263.62万Km2，占我国国土面积的27.46％。干旱是世界农牧业面临的最严重问题之一，特别是我国北方地区干旱现象尤为严重。即使在我国湿润和半湿润地区,也常常受到旱灾的侵袭。干旱对世界作物产量的影响,在自然环境胁迫中居首位,其危害相当于其他自然灾害之合。因此,植物抗旱性研究一直是各国科学家关注的重要问题,是当前研究的热点。对植物霸王多态性的研究可为研究植物抗旱机制的研究提供基础材料。
微卫星标记(microsatellite)，又称为短串联重复序列(short tandem repeats,STRs)或简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)，是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由2～6个核苷酸的串联重复片段构成。由于其有数量多、特异的PCR扩增、稳定性好、在基因组内分布均匀、多态性信息丰富、易于检测等特性等诸多优点成为近年来应用广泛的分子标记之一。然而，关于霸王属植株的基因组微卫星多态性在分子标记开发方面的报道还未见到。
发明内容
有鉴于此，本发明首先提供一种蒺藜科植物霸王的微卫星位点，包括SEQ ID NO 1～SEQ ID NO9的序列的任意一种，即包括以下序列的任意一种：
SxB-1(SEQ ID NO 1)
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SxB-2(SEQ ID NO 2)
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SxB-7(SEQ ID NO 3)
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SxB-10(SEQ ID NO 4)
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SxB-12(SEQ ID NO 5)
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SxB-15(SEQ ID NO 6)
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SxB-16(SEQ ID NO7)
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SxB-18(SEQ ID NO8)
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SxB-20(SEQ ID NO 9)
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本发明还提供了上述霸王属蒺藜科植株的微卫星位点的引物对，所述引物对的序列依次为序列表SEQ ID NO 10～NO 27的序列，即为以下序列对：
本发明的另一目的在于提供上述霸王的微卫星位点及其特异性引物对的筛选方法，包括以下步骤：
1)收集样品并提取DNA；
2)对步骤1)获得的DNA片段化处理，构建DNA-seq文库，并对所述DNA-seq进行高通量测序；
3)检测微卫星位点并设计微卫星位点的引物对；
4)筛选并检测微卫星位点及其特异性引物对。
优选地，本发明所述霸王的微卫星位点及其特异性引物对的筛选方法中，所述步骤1)中提取DNA步骤为CTAB法。
优选地，本发明所述霸王的微卫星位点及其特异性引物对的筛选方法中，所述步骤2)中DNA-seq高通量测序使用illumina Hiseq测序平台进行高通量测序；优选地，所述DNA-seq高通量测序采用illumina Hiseq测序平台的双端测序模式。
优选地，本发明所述霸王的微卫星位点及其特异性引物对的筛选方法中，所述所述步骤3)检测微卫星序列并设计微卫星引物包括以下步骤：
采用batchprimer3在线分析工具对所述步骤2)组装完成的序列检测微卫星位点序列并在微卫星位点的侧翼序列上进行引物设计；
所述微卫星位点检测的条件为重复单元为2个碱基时，重复次数需大于等于6；重复单元为3个碱基时，重复次数需大于等于5；重复单元为4、5和6个碱基时，重复次数需大于等于4；
所述微卫星位点的引物设计的原则为PCR扩增目的片段为100～200bp，引物GC含量为40～60％，上下游引物退火温度(Tm)在50～60℃之间且差异小于5℃。
优选地，本发明所述霸王的微卫星位点及其特异性引物对的筛选方法中，所述步骤4)中筛选微卫星特异性引物的方法为：使用霸王基因组DNA对步骤3)获得的特异性引物对进行PCR扩增并检测，筛选能够稳定扩增出目标条带并具有多态性的引物对。
更优选地，所述扩增微卫星位点的PCR反应体系如下：2×Taq PCR SuperMix(北京全式金生物技术有限公司)15μL，10μM上下游引物各1μL(上游引物使用荧光标记)，DNA模板1μL，用超纯水补齐至30μL；
所述扩增微卫星位点的PCR条件为95℃预变性5min；95℃变性30sec，适宜退火温度下退火30sec，72℃延伸30sec，反应34个循环；72℃延伸10min。
优选地，本发明所述霸王的微卫星位点及其特异性引物对的筛选方法中，所述微卫星特异性引物检测方法为：使用1％琼脂糖-EB凝胶电泳检测步骤4)所述的PCR产物，挑选在霸王个体中均扩增得到单一目标条带的微卫星PCR产物进行基因分型分析；基因分型的结果使用GENMARKER软件进行读取，并输入Excel文件；使用Excel Mircosatellite Toolkit程序统计各微卫星位点的期望杂合度(Expected Heterozygosity,HE)、观测杂合度(Observed Heterozygosity，HO)和多态性信息含量(Polymorphic information content,PIC)，以检测所述微卫星位点的多态性状况，筛选出上述三个多态性数值均大于0.5的微卫星特异引物。
因此，本发明还提供了霸王的微卫星特异性引物在霸王属蒺藜科植株基因的标记、定位与QTL分析，品种鉴定，种群及进化研究，分子标记辅助育种中的应用。
附图说明
图1为本发明的一个实施例中的霸王基因组DNA抽提结果电泳图；
图2为本发明的一个实施例中的微卫星位点的PCR产物电泳图。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步对本发明的技术方案进行说明，应理解以下仅为本发明的示例性说明，并不用于限制本发明权利要求的保护范围。
实施例1霸王的微卫星特异引物的筛选
1、收集样本并提取DNA
在内蒙古阿拉善右旗地区采集霸王样品，采摘叶片后使用硅胶保存，共采集样品16份。
DNA抽提使用CTAB法：
1)称取样品0.02g，充分研磨，放入标记好的EP试管内。
2)加入1.5mL CTAB free液，加入5ul的DTT溶液，摇匀；冰浴10min。
3)离心，10000rpm，15min，去上清；如果上清十分粘稠，使用CTAB free液再清洗一次；
4)加入800μL 3*CTAB液(65℃预热)和5ul DTT溶液，混匀，65°C水浴1h，期间多次摇匀；
5)冷却至室温，离心，10000rpm，15min，取上清。
6)加入等体积氯仿：异戊醇(V:V2＝24:1)，混匀，放入恒温摇床中10min，离心，12000rpm，15min，取上清；
7)重复上一步1-2次，直至中间蛋白层不出现；
9)加入1/2体积5mol/L NaCl及等1-2倍体积-20℃预冷的异丙醇，室温，放置1h；
10)12000rpm，15min，弃上清；
11)75％乙醇洗两次，每次加1000μL，放置5min后，12000rpm，离心6min，慢慢倒掉乙醇，注意不要倒掉瓶底的DNA。
12)用1000μL无水乙醇洗涤一次，风干；
13)加入100μL TE，-20℃保存备用，琼脂糖电泳检测结果(见图1)。
2、DNA-seq高通量序列
得到霸王基因组DNA后，本发明实施例对霸王基因组DNA进行DNA-seq高通量测序。在本发明的实施例中，所述DNA-seq高通量测序优选的委托晶能生物技术(上海)有限公司进行；具体使用illumina Hiseq测序平台进行高通量测序，进一步优选的采用illuminaHiseq测序平台的双端测序模式。
根据测序数据的低质量分数集中于末端的分布特点，利用Trim Galore软件对测序数据从3’端动态去除接头序列片段和低质量片段,利用FastQC软件对预处理数据进行质量控制分析。共得到72467354条原始序列，去除低质量片段后得到70537866原始序列。
采用Velvetopt(Velvet优化程序)进行组装，得到最后的组装序列，并对100bp以下的contig进行过滤，最终成功组装的序列为632978条序列。
3、检测微卫星序列和引物设计
针对每条组装的contig序列，采用batchprimer3在线分析工具检测SSR序列并进行引物设计。微卫星检测的条件为重复单元为2个碱基时，重复次数需大于等于6；重复单元为3个碱基时，重复次数需大于等于5；重复单元为4、5和6个碱基时，重复次数需大于等于4。所述引物设计的原则为扩增目的片段为100～200bp，引物GC含量为40～60％，上下游引物退火温度(Tm)在50～60℃之间且差异小于5℃。
在此条件下，共筛选得到49679条微卫星序列并设计10831对引物。
4、高多态性微卫星引物的检测和筛选
在10831个引物对中随机选择40个，对上游引物进行荧光标记后，使用这40对引物对上述16份样品的DNA进行扩增。PCR反应体系如下：2×Taq PCR SuperMix(北京全式金生物技术有限公司)15μL，10μM上下游引物各1μL(上游引物使用荧光标记)，DNA模板1μL，用超纯水补齐至30μL。PCR反应条件为95℃预变性5min；95℃变性30sec，适宜退火温度下退火30sec，72℃延伸30sec，反应34个循环；72℃延伸10min。
挑选在16个霸王个体中均扩增得到单一目标条带的微卫星PCR产物进行基因分型分析。其中，对SxB-1位点使用16个霸王个体的PCR扩增产物电泳结果见图2。使用Tamara350荧光分子量标准在ABI 377DNA测序仪中使用聚丙烯酰胺凝胶进行基因分型。
基因分型的结果使用GENMARKER软件进行读取，并输入Excel文件；使用ExcelMircosatellite Tool kit程序统计各微卫星位点的期望杂合度(ExpectedHeterozygosity,HE)、观测杂合度(Observed Heterozygosity，HO)和多态性信息含量(Polymorphic information content,PIC)，以检测所述微卫星位点的多态性状况，筛选出上述三个多态性数值均大于0.5的微卫星特异引物。筛选得到9个霸王高多态性的微卫星特异性引物对，见表1。
表1霸王微卫星特异性引物的遗传多态性数据
| Locus | He | Ho | PIC |
| SxB-1 | 0.6959 | 0.6667 | 0.6541 |
| SxB-2 | 0.7855 | 0.9167 | 0.7329 |
| SxB-7 | 0.7066 | 0.7083 | 0.6536 |
| SxB-10 | 0.6206 | 0.6667 | 0.531 |
| SxB-12 | 0.6596 | 0.6667 | 0.5975 |
| SxB-15 | 0.6826 | 0.9167 | 0.6109 |
| SxB-16 | 0.8316 | 0.75 | 0.7914 |
| SxB-18 | 0.6223 | 0.625 | 0.5609 |
| SxB-20 | 0.8351 | 0.5 | 0.7933 |
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 内蒙古自治区农牧业科学院
<120> 一种荒漠植物霸王的微卫星分子标记及其应用
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 499
<212> DNA
<213> Sarcozygium xanthoxylon Bunge
<400> 1
ggccttttcg gactttttat cggctaacca ctcacagaaa gcggcaaatt gttgtttctt 60
gtttttgtca ctaaagggta gttgtttttc ttgttcttgt ttggtatgag agttttggct 120
atgggagtgc aggagttgtt tggcggagtt gttgttgtta ggatcaggga attgacgagg 180
gaacaaatat gttgttttgt gtggcatctt tctttctttc tttcttgatt ctaatcagac 240
acacaaacac ggtcttgttc tttctttttt gttttgttcg agctcgatta gccgtcgtct 300
cttgtctttt gcatgtccat agccaagctc gatctctctc tctctctctc tctagtctag 360
tgtctataaa accttgaatg aatgaatgaa tgaacgaaca gagagggttg tttattgatt 420
tgatcaaacc aacaaaagct aattacagta ctagctactt ctcttgcgat caactttctt 480
tcacacaata acactttct 499
<210> 2
<211> 449
<212> DNA
<213> Sarcozygium xanthoxylon Bunge
<400> 2
tgtgcttact gtgcatcagt tagcaaagtt ccttcgattg gttcttcaaa gccacgctcc 60
accagactcc agagaccctt tgccttcaag agattctcca ttatttcgct ccagtgatca 120
tagtgaccat caaaatgagg aattttggta agtgttttat cctcactcat tctctcggtt 180
ttgaattctc acaggctgct gcctctcact gactcccagt gttgattctc tgataccaaa 240
tgtaagatat aagagcttta gatagagaaa acttgtttat ttatttattt atttattcaa 300
tggaagacta ggctcttata tagctaatag tctgttacac acgatcttat cagaaagtaa 360
aataagtcta agaaatagcc actaccaaca taaacaaaag acttaatcaa ataggctaac 420
taacctacta attgggagct tattccaat 449
<210> 3
<211> 399
<212> DNA
<213> Sarcozygium xanthoxylon Bunge
<400> 3
tgaaaagatg caataaaatt gatatttatg ggttatgtga agaccagaga atacaaaagc 60
tctacacaag acctgggttt gtttatactt gtaaaaagtt ggaaatactt aacttctata 120
ctccagcttc aggaggagtg agtgagtgag tgagtgttac agaatgggaa taaatgtata 180
taaggaataa ttaggagaca ggatttattt tactttcctt aattagagga tttaacattg 240
tatattttta tgtgcgtgtg tagttttctc tattcaatga attaataaca gtcttttctt 300
taatagaaag cagaaactat ggtatcttca aacttctgta ctatctgttt gatacatttt 360
tccattacta cagaggtaat aagaggtcta acctgcatg 399
<210> 4
<211> 480
<212> DNA
<213> Sarcozygium xanthoxylon Bunge
<400> 4
gaacatgcct tcccggtatc acagtactct attgtagtga tacaaatata agttacaaaa 60
tactaatata tgtgtataag ctaaaatatc aaaaatcata tacatgtgta tgtctgtgcc 120
tgtacatatc tcatggaata acacaaccaa ccaaccaacc aacctgcttg ctagctattg 180
ccccaatctg acttccccga ggacgactat ggaagtattt ttcagattct tcttcagaaa 240
ctttctgcac agatccttcc actcttacct aatacacggt aactaatgtc agttttagtc 300
ctcctatagc ttataaatac tatatatgct gtctaataga agaaagcagc ctaacagaaa 360
gcagaccctt tgcgcaaggt ccaacaactt gctttatcca cacaagatta tgagccaatt 420
tggcttggct tattggctta tcagctggtc agaccagttt atcggcagta agctgcttat 480
<210> 5
<211> 411
<212> DNA
<213> Sarcozygium xanthoxylon Bunge
<400> 5
cacattggat ggtgtaactc ccacactgca gcggcgaaga ttcgaacttg cactattgga 60
cacaatttac tatccgtttt accgttaagc tgcttctgcg agggaaaaaa atatgagtta 120
actcggaggt ttggattaga cagaataata ggggggaaaa aaaataatat cataagttat 180
gatttattta tttatttatt ttgtggttat agaccatctg tttgagttcg gatggagcca 240
ggtaagaaac atggggctaa gtcttttacg ataagttttt accacattta catttgcatg 300
cctaaagatt tgaatttgag atccctaatt aaattagaat aatcgggtac caacttattg 360
acagagaagc ttggaaacaa atgtgcattg atgattgata taaatatgtg t 411
<210> 6
<211> 399
<212> DNA
<213> Sarcozygium xanthoxylon Bunge
<400> 6
aaatgcgtac tttttatcag tttattcaaa gaatgcccgc atcctgatga gaaacaaagg 60
ctggagctca gtagaagact cagcttagat gcaaggcaag tcaagttttg gtttcaaaac 120
cgtaggacac aaatgaaggt aatacagtaa accattgata tatgagtgtt ttttcttctt 180
cttttgtttt attgtttgtg agaattttgt ttgtttgttt gtttgtttgt gagacagact 240
caaatggaac gtcatgagaa tacactgcta aggcatgaaa acgaaaagtt aagggcagag 300
aacatgtcta taagggatgc aatgaggaat ccgatttgta gcaactgtgg tggtccagct 360
gttatagggg aaatctcttt tgaagagcag caacttagg 399
<210> 7
<211> 413
<212> DNA
<213> Sarcozygium xanthoxylon Bunge
<400> 7
ttgaagctga tttctcatta aaaaattaat gtatggaaag ataaaaaaaa agaattaggt 60
gtgttaaaca ggccaagccg cggcctgcta gagctagccc gtttgacccg ccaagtaaac 120
gggctaaaaa aatcaactcg atcccgccta attggcgggt ttccaacccg tttgacagct 180
ctagttttga aattctatta tagtgcaaag agtttttttt taaaatttta tttatttatt 240
tatttaccat gagtgttcaa gtgcttaggt tgttggttag ggaattcttg aatccactaa 300
agtctcaggt ttcactccac cgtcagaggt ggagctagaa aattggtgtt acaggggtca 360
tatatggtct agcggccaag cctacacaat attaatgtag tttataaaat tta 413
<210> 8
<211> 450
<212> DNA
<213> Sarcozygium xanthoxylon Bunge
<400> 8
aacgttatta gaatccacta tgaaattaat cattttaata ttgaataatg accaatactt 60
caagtttaat gtatgttaca aatcacgaag cccttgaacc taattatcaa attagtagca 120
aattggcata taaccgttgc acttaaaaat attatacttt acccgatatt aatgcaatca 180
agatagactc attatttata tattaatgtc aggtaataga tatatattga aaaaatacgt 240
tatctattat gctatgcaat aattcaattc caccatttca ataggtcact catttaacct 300
agttgggctc tcctcattct aacattttaa aacaaaactt accaaaccat agcttcattt 360
atttatttat ttatttattt ttaatcttct aaaggaaaat ctggtggtat agccaaacaa 420
cacccttccc ccctgcatga acgtcttttc 450
<210> 9
<211> 399
<212> DNA
<213> Sarcozygium xanthoxylon Bunge 4
<400> 9
ggcgatatcc taccctaccc atgtttaccc ggtgacccct atccgcttcc aaatagatca 60
tttattttag tagaatagaa cataggtata taagttttaa gtaaataaaa tataacatca 120
agcgagccaa agctaaagga catgtacgca attgactata ttgacactga gctcagttgt 180
attaccattt ttcttttatt tatttattta tttattatta tttttttttt tgcgcaaagc 240
aaatttacca gacagtactt tgagcaaccc tagcaatgcg tatgacatgc tttcttcata 300
aattgccaaa atattcctgt tgttaactat gtggacaaaa gtataatagc catgatggtt 360
ggccaacgtg acaatgcaaa tattcaattc cctattcct 399
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gttgttgttg ttaggatcag g 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gacatgcaaa agacaagaga c 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttatcctcac tcattctctc g 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
taagagccta gtcttccatt g 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cttctatact ccagcttcag g 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gagaaaacta cacacgcaca t 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gcctgtacat atctcatgga a 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
aggtaagagt ggaaggatct g 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
taactcggag gtttggatta g 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gtaaaagact tagccccatg t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cgtaggacac aaatgaaggt a 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gcagtgtatt ctcatgacgt t 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cgtttgacag ctctagtttt g 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tgaaacctga gactttagtg g 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
caccatttca ataggtcact c 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gctataccac cagattttcc t 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
aaagctaaag gacatgtacg c 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gttgctcaaa gtactgtctg g 21
Claims (10)
1.一种蒺藜科植物霸王的微卫星位点，包括SEQ ID NO1～SEQ ID NO9的序列的任意一种。
2.一种蒺藜科植物霸王的微卫星位点的特异性引物对，其特征在于，所述引物对的序列依次为序列表SEQ ID NO 10～NO 27的序列。
3.一种如权利要求1或2所述霸王的微卫星位点及其特异性引物对的筛选方法，包括以下步骤：
1)收集样品并提取DNA；
2)对步骤1)获得的DNA片段化处理，构建DNA-seq文库，并对所述DNA-seq进行高通量测序；
3)检测微卫星位点并设计微卫星位点的引物对；
4)筛选并检测微卫星位点及其特异性引物对。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中提取DNA步骤为CTAB法。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述DNA-seq高通量测序使用illuminaHiseq测序平台进行高通量测序；优选地，所述DNA-seq高通量测序采用illumina Hiseq测序平台的双端测序模式。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤3)检测微卫星序列并设计微卫星引物包括以下步骤：
采用batchprimer3在线分析工具对所述步骤2)组装完成的序列检测微卫星位点序列并在微卫星位点的侧翼序列上进行引物设计；
所述微卫星位点检测的条件为重复单元为2个碱基时，重复次数需大于等于6；重复单元为3个碱基时，重复次数需大于等于5；重复单元为4、5和6个碱基时，重复次数需大于等于4；
所述微卫星位点的引物设计的原则为PCR扩增目的片段为100～200bp，引物GC含量为40～60％，上下游引物退火温度(Tm)在50～60℃之间且差异小于5℃。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中筛选微卫星特异性引物的方法为：使用霸王DNA对步骤3)获得的特异性引物对进行PCR扩增并检测，筛选能够稳定扩增出目标条带并具有多态性的引物对。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增微卫星位点的PCR反应体系如下：2×Taq PCR SuperMix(北京全式金生物技术有限公司)15μL，10μM上下游引物各1μL(上游引物使用荧光标记)，DNA模板1μL，用超纯水补齐至30μL；
所述扩增微卫星位点的PCR条件为95℃预变性5min；95℃变性30sec，适宜退火温度下退火30sec，72℃延伸30sec，反应34个循环；72℃延伸10min。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述微卫星特异性引物检测方法为：使用1％琼脂糖-EB凝胶电泳检测步骤4)所述的PCR产物，挑选在霸王个体中均扩增得到单一目标条带的微卫星PCR产物进行基因分型分析；基因分型的结果使用GENMARKER软件进行读取，并输入Excel文件；使用Excel Mircosatellite Tool kit程序统计各微卫星位点的期望杂合度(Expected Heterozygosity,HE)、观测杂合度(Observed Heterozygosity，HO)和多态性信息含量(Polymorphic information content,PIC)，以检测所述微卫星位点的多态性状况，筛选出上述三个多态性数值均大于0.5的微卫星特异引物。
10.如权利要求1或2所述的霸王的微卫星特异性引物在霸王属蒺藜科植株基因的标记、定位与QTL分析，品种鉴定，种群及进化研究，分子标记辅助育种中的应用。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20200331 |