CN107604047B - 一种提高无参转录组微卫星标记多态性的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高无参转录组微卫星标记多态性的筛选方法，属于分子生物学领域，所述方法的筛选原则和步骤依次为，初步选择重复次数为主流文献推荐的重复次数的微卫星；其次选择每个样品的FPKM平均值≥40的微卫星；然后选择FPKM值差的绝对值≥20的微卫星；然后选择微卫星所在基因片段≥400的微卫星；然后去除处在基因片段头或者尾的微卫星；最后利用BSA技术对微卫星进行筛选。本发明方法为第一个系统化的转录组微卫星筛选方法，首次全面确定了多个筛选条件，避免了单个条件降低筛选的效果和准确度；本发明首次根据二代测序的特点，明确了转录组中微卫星筛选的先后条件，避免重复性筛选以及条件错位引起的微卫星标记的遗漏。
Description
技术领域
本发明属于转录组学领域，具体涉及一种提高无参转录组微卫星标记多态性的筛选方法，利用本方法可有效的提高所筛选无参转录组中微卫星标记的多态性。
背景技术
高通量测序因其测序速度快、数据产出量高被广泛应用于转录组学的研究，伴随着转录组学在技术方面的持续进步，尤其是三代测序的出现，生物学领域的研究已经跨入了后基因组时代，转录组学作为率先发展起来的技术已经开始在生物学的前言中获得了广泛的应用。利用高通量技术进行转录组测序来获得缺乏遗传资料的物种的EST数据，从而进行SSR的筛选，得到一批新的分子标记位点，为今后研究群体的遗传特征和群体结构，构建高密度遗传连锁图谱，相关性状的定位和进行分子标记选择育种提供基本资料。通过高通量测序构建的转录组数据，可以得到数千甚至上万的分子标记，因此从上万的分子标记中筛选出研究需要的分子标记，已成亟待解决的问题。
目前，大部分研究都致力于转录组中微卫星多态性的研究，但是关于提高多态性的探索研究很少，尤其是提高微卫星多态性筛选的系统方法更是少之又少。分析发现，转录组微卫星数据数量巨大且交叉范围广，分析较难，工作量大，要从上万微卫星数据中筛选出多态性较好且符合性状相关的微卫星存在较多较难。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高转录组微卫星标记多态性的筛选方法，该方法工作量小、操作简便，效果显著。利用本方法可有效提高筛选微卫星标记的多态性，为性状相关研究提供重要和可靠的分子标记。
本发明实验原理：
在RNA-seq技术中，FPKM(expected number of Fragments Per Kilobase oftranscript sequence per Millions base pairs sequenced)是每百万fragments中来自某一基因每千碱基长度的fragments数目，其同时考虑了测序深度和基因长度对fragments计数的影响，是目前最为常用的基因表达水平估算方法。本发明设计的原理之一是利用二代测序中FPKM值和实验样品与对照组FPKM值差的绝对值，首先确定了微卫星所在基因的高表达以及实验组和对照组较大差异表达；原理之二去除所在基因片段太小的微卫星防止假阳性，结合BSA(分群分离分析法)技术快速筛选。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种提高无参转录组微卫星标记多态性的筛选方法，步骤如下：
(1)测定的生物体无参转录组得到微卫星位点，首先根据重复类型的重复次数，初步选择重复次数为主流文献推荐的重复次数的微卫星；
(2)其次根据每个样品的FPKM平均值，从步骤(1)筛选后的微卫星中选择FPKM平均值≥40的微卫星；
(3)然后根据实验样品与对照组FPKM值差，从步骤(2)的选择结果中选择FPKM值差的绝对值≥20的微卫星，缩小筛选范围；
(4)然后根据微卫星所在基因片段大小，从步骤(3)的选择结果中选择微卫星所在基因片段≥400的微卫星，再次缩小筛选范围；
(5)然后在步骤(4)得到的结果中去除处在基因片段头或者尾的微卫星；
(6)最后利用BSA技术对步骤(5)的微卫星进行筛选。
本发明与现有技术相比的有益效果：
(1)本发明方法为第一个系统化的转录组微卫星筛选方法，思路明确，操作简单，每个筛选步骤都有确切的考核要素；
(2)本发明首次全面确定了多个筛选条件，避免了单个条件降低筛选的效果和准确度；
(3)本发明首次根据二代测序的特点，明确了转录组中微卫星筛选的先后条件，避免重复性筛选以及条件错位引起的微卫星标记的遗漏。
具体实施方式
下面通过实施案例与其他实验对比详细叙述本发明在无参转录组中提高微卫星多态性的应用。
实施例1
一种提高无参转录组微卫星标记多态性的筛选方法，在大菱鲆中的应用，步骤如下：
(1)测定的大菱鲆无参转录组得到76939个微卫星位点，首先根据重复类型的重复次数N(P6)＞4、N(P5)＞4、N(P4)＞6、N(P3)＞7、N(P2)＞10、N(P1)＞21初步确定筛选的微卫星位点582个；
(2)其次根据每个样品的FPKM平均值≥40，再次确定所筛选的微卫星位点125个；
(3)然后根据实验样品与对照组FPKM值差的绝对值≥20，缩小筛选范围至35个；
(4)然后根据微卫星位点所在基因片段大小≥400，再次缩小筛选范围至30个；
(5)然后去除处在基因片段头或者尾的微卫星9个，共得到21个微卫星位点；
(6)最后利用BSA技术进行微卫星标记的筛选。结果显示，有4个微卫星位点为高度多态性，4个微卫星位点为中度多态性，1个微卫星位点为低度多态性，多态性比例高达42.86％(表1)。
表1本案例与其他实验多态性对比
本发明技术方案同样适用于其它水生生物微卫星多态性的筛选。
Claims (1)
1.一种提高大菱鲆无参转录组微卫星标记多态性的筛选方法，其特征在于它的步骤如下：
（1）测定的大菱鲆无参转录组得到76939个微卫星位点，首先根据重复类型的重复次数N（P6）＞4、N（P5）＞4、N（P4）＞6、 N（P3）＞7、N（P2）＞10、N（P1）＞21初步确定筛选的微卫星位点582个；
（2）其次根据每个样品的FPKM平均值≥40，再次确定所筛选的微卫星位点125个；
（3）然后根据实验样品与对照组FPKM值差的绝对值≥20，缩小筛选范围至35个；
（4）然后根据微卫星位点所在基因片段大小≥400，再次缩小筛选范围至30个；
（5）然后去除处在基因片段头或者尾的微卫星9个，共得到21个微卫星位点；
（6）最后利用BSA技术进行微卫星标记的筛选。
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