CN113151569B - 鉴别bt-cms型水稻的引物、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本公开涉及用于鉴别包台型核质互作雄性不育系水稻的引物、试剂盒及其应用。该引物包括如SEQ ID NO.1所示的BT79‑F及如SEQ ID NO.2所示的BT79‑R；BT79‑F和BT79‑R用于扩增包台型核质互作雄性不育系水稻的线粒体嵌合基因Atp6‑orf79的特异性序列，所述扩增产物片段长度为521bp。利用该引物可快速鉴别包台型核质互作雄性不育系，有利于提高其种子纯度鉴定效率，以保障该品系繁种的安全性。

Description

鉴别BT-CMS型水稻的引物、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及水稻品系鉴别技术领域，尤其涉及鉴别BT-CMS型水稻的引物、试剂盒及应用。

背景技术

植物细胞质雄性不育(CMS)是广泛存在于自然界中的现象，主要表现为不能产生有功能的花粉从而导致不能正常受精结实的自然现象。水稻中细胞质雄性不育的品种来源很多，其中以野败型(简称WA-CMS)、红莲型(简称HL-CMS)和包台型(简称BT-CMS)为3种代表类型。在生产应用中，WA-CMS型不育系主要用于杂交籼稻中，BT-CMS型不育系主要用于杂交粳稻中，HL-CMS型不育系相对应用较少。

BT-CMS型不育系一般是通过常规粳稻转育而来，花时短，开花不集中，柱头外露率不高，导致了不育系的制繁种产量不高。而在水稻杂交种子生产过程中，高纯度的不育系是保障种子纯度最重要的因素。另外，由于BT-CMS型不育系与水稻保持系在株型、熟期等普通农艺性状基本一致，使用常规的田间表型鉴定的准确性低；而使用诸如SSR、Indel、STS等常规分子标记技术来鉴定品系纯度，无法有效区分BT-CMS型与保持系。

现有技术“段世华，郑卓，颜红宇等.HL-CMS基因orfH79在稻种资源中的遗传多态性研究[J]，江西农业大学学报，2015，37(1):27-33.”探讨了orf79在水稻资源中的遗传及变异，对来自不同稻作国家的124份水稻材料进行orfH79特异性PCR检测。有18份水稻材料检测出含有HL-CMS基因orfH79及其同源序列，结果表明HL-CMS基因orfH79及其同源序列在稻种资源中具较高频率的分布(14.5％)。DNA序列分析显示HL-CMS基因orfH79及其同源序列和BT-CMS基因orf79具有非常保守的遗传特性(97％)，共检测出6个多态性碱基位点，6个位点碱基的变异导致多肽ORFH79产生了5个位点氨基酸的变化。该文还根据水稻HL-CMS基因orf79编码区保守序列设计特异性PCR扩增引物对。

而且由于orf79为线粒体基因，在线粒体DNA由于裸露分散在线粒体基质中，不与组蛋白结合，更易于收到氧化物氧化而损伤或突变；通过一般手段提取的线粒体DNA，其中不免存在细胞核中存在的线粒体假基因的影响。而一般的组织DNA提取方法得到的DNA是细胞的总DNA混合物，其包括线粒体DNA、核DNA，也保护核中线粒体假基因。尽管常用的线粒体DNA提取方法能够得到大量的线粒体DNA，但是对于核中线粒体假基因的干扰，往往不能克服其带来的影响。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于至少提供一种能够鉴定BT-CMS型不育系或有效区分BT-CMS型不育系和保持系的分子生物学方法，以在无需单独提取水稻线粒体DNA时，有效地提高鉴定BT-CMS水稻的特异性和灵敏度。

第一方面，本发明公开了用于鉴别包台型核质互作雄性不育系水稻的引物，包括如SEQ ID NO.1所示的BT79-F及如SEQ ID NO.2所示的BT79-R；BT79-F和BT79-R用于扩增BT型核质互作雄性不育系水稻的线粒体嵌合基因Atp6-orf79的特异性序列，所述扩增产物片段长度为521bp。

在本发明的具体实施例中，所述线粒体嵌合基因Atp6-orf79全长1547bp，如SEQID NO.3所示，所述BT79-F针对的扩增起始位置为990bp，所述BT79-R针对的扩增起始位置为1469bp。

第二方面，本发明公开了鉴别包台型核质互作雄性不育系水稻的方法，包括以下步骤：

获取水稻幼苗的DNA样品；

使用权利要求1中所述的BT79-F/BT79-R引物对其进行扩增；

对扩增产物进行电泳分析，若出现521bp大小的单一条带，表明该水稻为BT型核质互作雄性不育系。

在本发明的实施例中，所述扩增反应为20μL反应体系，其成分为：2μl 10×缓冲液(含25mM MgCl₂)，0.4μl 10mM dNTP，0.8μl BT79-F(10pmol/μl)，0.8μl BT79-R(10pmol/μl)，0.8μl待测样品，0.4μl Taq DNA聚合酶(2U/μl)，加水补足至20μl；反应程序为：95℃预变性5min；32个循环：95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s；最后72℃延伸8min。

第三方面，本发明公开了包括第一方面涉及的引物的试剂或试剂盒。

第四方面，本发明公开了第三方面涉及的试剂或试剂盒的用途，所述用途为下述任一种：

1)在鉴定或者辅助鉴定水稻包台型核质互作雄性不育系中的应用；

2)在区分水稻包台型核质互作雄性不育系与保持系中的应用；

3)在选育水稻包台型核质互作雄性保持系中的应用；

4)预测水稻包台型核质互作雄性表型中的应用；

5)在制备鉴定或辅助鉴定水稻包台型核质互作雄性表型产品中的应用；

6)在制备预测水稻包台型核质互作雄性表型产品中的应用；

7)在选育杂交粳稻中的应用。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明中涉及的BT79-F/BT79-R引物对，能够准确扩增出BT-CMS水稻线粒体Atp6-orf79基因的特异性区间。利用该引物可快速鉴别BT型核质互作雄性不育系，有利于提高其种子纯度鉴定效率，以保障该品系繁种的安全性。

附图说明

图1为本发明实施例提供的BT-CMS水稻线粒体Atp6-orf79基因及其扩增引物示意图。

图2为本发明实施例1提供的两种提取水稻幼苗DNA样品的琼脂糖凝胶电泳结果图；其中，1、2泳道分别为针对嘉66A和嘉66B使用第二种方法获取的DNA样品；3、4泳道分别为针对嘉66A和嘉66B使用第一种方法获取的DNA样品。

图3为本发明实施例1提供的琼脂糖凝胶电泳图；1-10泳道依次为台A、台B、嘉66A、嘉66B、嘉81A、嘉81B、浙粳7A、浙粳7B、134A、秀水134。

图4为本发明实施例1提供的琼脂糖凝胶电泳图；图4A中1-24泳道为24个台A单株；图4B中1-24泳道为24个台B单株。

图5为本发明实施例2提供的琼脂糖凝胶电泳图；1-3泳道分别为春江16A、春江23A、嘉212A；4-9泳道分别为6种常规粳稻品种：秀水134、嘉禾218、嘉花1号、南粳46、南粳9108、嘉58。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

水稻BT-CMS系的不育基因orf79能够与线粒体功能基因ATPase subunit 6(atp6)嵌合成一条共转录本Atp6-orf79，然后不育基因编码的蛋白质就能在线粒体内表达，从而引起线粒体功能的紊乱，导致花粉发育过程受阻，由此导致其不育。

由此，本发明实施例公开了用于鉴别包台型核质互作雄性不育系水稻的引物，包括如SEQ ID NO.1所示的BT79-F及如SEQ ID NO.2所示的BT79-R；BT79-F和BT79-R用于扩增BT型核质互作雄性不育系水稻的线粒体嵌合基因Atp6-orf79的特异性序列，所述扩增产物片段长度为521bp。

其中，线粒体嵌合基因Atp6-orf79全长1547bp，如SEQ ID NO.3所示，所述BT79-F针对的扩增起始位置为990bp，所述BT79-R针对的扩增起始位置为1469bp，如图1所示。

由于该序列具有高度特异性，仅能够存在于BT-CMS型水稻线粒体DNA中而保持系及常规粳稻品种中均没有。由此，根据该序列的特异性设计引物，上游引物位于Atp6的3’端，下游引物位于orf79的3’端，如此将包含少量Atp6基因序列、orf79的全部序列以及2个基因之间的DNA序列作为一种功能标记，能够特异性地鉴定这个嵌合基因。通过发夹结构、错配、引物间二聚体、退火温度范围、引物GC含量等参数分析，最终确定上游引物起始位置990bp，引物长度22bp；下游引物起始位置1469bp，引物长度21bp，标记全长521bp(如图2)，适宜退火温度54℃。

由此设计BT79-F/BT79-R引物对，能够准确扩增出如图1中长度为521bp的目标序列，可快速鉴别BT型核质互作雄性不育系与杂株，提高BT-CMS纯度鉴定效率，从而保障BT型核质互作雄性不育系繁种的安全性。

另外，本发明实施例还公开了鉴别包台型核质互作雄性不育系水稻的方法，包括以下步骤：

获取水稻幼苗的DNA；

使用上述的BT79-F/BT79-R引物对其进行扩增；

对扩增产物进行电泳分析，若出现521bp大小的单一条带，表明该水稻为BT型核质互作雄性不育系。

在本发明的实施例中，所述扩增反应为20μL反应体系，其成分为：2μl 10×缓冲液(含25mM MgCl₂)，0.4μl 10mM dNTP，0.8μl BT79-F(10pmol/μl)，0.8μl BT79-R(10pmol/μl)，0.8μl待测样品，0.4μl Taq DNA聚合酶(2U/μl)，加水补足至20μl；反应程序为：95℃预变性5min；32个循环：95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s；最后72℃延伸8min。

第三方面，本发明公开了包括第一方面涉及的引物的试剂或试剂盒。

第四方面，本发明公开了第三方面涉及的试剂或试剂盒的用途，所述用途为下述任一种：

1)在鉴定或者辅助鉴定水稻BT型核质互作雄性不育系中的应用；

2)在区分水稻BT型核质互作雄性不育系与保持系中的应用；

3)在选育水稻BT型核质互作雄性保持系中的应用；

4)预测水稻BT型核质互作雄性表型中的应用；

5)在制备鉴定或辅助鉴定水稻BT型核质互作雄性表型产品中的应用；

6)在制备预测水稻BT型核质互作雄性表型产品中的应用。

7)在选育杂交粳稻中的应用。

下方将结合具体实施例进行说明。

实施例1BT-CMS型不育系与其对应的保持系鉴别

本实施例选择5组BT型不育系(BT-CMS)及其对应的保持系以验证本发明引物对BT79-F/BT79-R是否对所选的BT型不育系均具有特异性，按以下步骤进行。

1、供试品系

为5组BT型不育系及其对应的保持系，分别是台A(BT-CMS)、台B(保持系)；嘉66A(BT-CMS)、嘉66B(保持系)；嘉81A(BT-CMS)、嘉81B(保持系)；浙粳7A(BT-CMS)、浙粳7B(保持系)；134A(BT-CMS)、秀水134(保持系)。

2、获取DNA样品

由上述可知，本发明实施例涉及的Atp6-orf79基因为线粒体的嵌合基因，存在于线粒体中。一般而言，线粒体DNA由于裸露分散在线粒体基质中，不与组蛋白结合，更易于收到氧化物氧化而损伤或突变；通过一般手段提取的线粒体DNA，其中不免存在细胞核中存在的线粒体假基因的影响。而一般的组织DNA提取方法得到的DNA是细胞的总DNA混合物，其包括线粒体DNA、核DNA，也保护核中线粒体假基因。尽管常用的线粒体DNA提取方法能够得到大量的线粒体DNA，但是对于核中线粒体假基因的干扰，往往不能克服其带来的影响。

因而，对于获取DNA样品可以采用以下两种方法：

方法一：

①材料准备：待鉴定的水稻种子室温浸种2天，37℃催芽1天，待露白后播种于基质中，人工气候箱内培养10天左右。单株幼苗剪碎后液氮磨样待用。

②加入400μL 2％CTAB裂解液，65℃水浴30min；加入250μL氯仿上下混匀，12000rpm离心10min后取上清。

③上清转入新的1.5mL离心管内，加入2/3体积异丙醇，混匀后-20℃冰箱内静置1h。

④12000rpm离心10min，弃上清，沉淀出的DNA用70％乙醇洗涤2次，通风橱内干燥，加入150μL双蒸水溶解，-20℃保存备用，即为水稻DNA样品，其中包含细胞核基因组DNA和线粒体DNA。

方法二：

试剂：

缓冲液A：50mM Tris-HCl，2.5mM EDTA，0.44M蔗糖，0.15％BSA，0.05％β-巯基乙醇；

缓冲液B：50mM Tris-HCl，20mM EDTA，0.05％β-巯基乙醇；

缓冲液C：10mM Tris-HCl，20mM EDTA，0.6M蔗糖；

缓冲液D：50mM Tris-HCl，10mM EDTA；

裂解液：50mM Tris-HCl，20mM EDTA，1.5％SDS；

另：蛋白酶K(40U/mg，Sigma公司)，水饱和酚(pH＝5，MIBio公司)，氯仿，75％乙醇，无水乙醇，TE缓冲液。

步骤：

(1)剪取水稻黄化幼苗，按每克10ml的比例加入预冷的缓冲液A匀浆，匀浆后用3层纱布过滤，4℃，14000g离心15min，收集沉淀。

(2)使用10ml预冷的缓冲液A重悬沉淀，4℃，1000g离心15min，取上清液；上清液加入10ml预冷的缓冲液B，4℃，14000g离心15min，收集沉淀；重复一次。

(4)10ml预冷的缓冲液C重悬沉淀，4℃，14000g离心15min，收集沉淀，即为纯化的水稻线粒体；

(5)2ml缓冲液D充分悬浮沉淀，加入经37℃预处理的蛋白酶K(终浓度为100μg/ml)以及1ml裂解液，37℃反应1h。

(6)加入等体积的水饱和酚，轻摇10min，混合液4℃，8000g离心15min，取上清。

(7)加入等体积的氯仿，轻摇10min，混合液4℃，8000g离心15min，取上清液。

(8)加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静置1h。

(9)4℃，10000g离心15min，收集沉淀。75％乙醇洗涤2次，干燥后溶解于100μL TE缓冲液中，-20℃保存，即为水稻线粒体DNA样品。

3、PCR扩增

20μL反应体系成分为：

2μl 10×缓冲液(含25mM MgCl₂)，0.4μl 10mM dNTP，0.8μl BT79-F(10pmol/μl)，0.8μl BT79-R(10pmol/μl)、下游引物(10pmol/μl)，0.8μl待检基因组DNA，0.4μl Taq DNA聚合酶(2U/μl)，加水补足至20μl。

反应程序为：95℃预变性5min；32个循环：95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s；最后72℃延伸8min。PCR扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳、溴化乙腚染色后置于紫外灯下观察。

4、分析电泳结果：

1)两种DNA样品提取方法的鉴别

使用上述两种方法提取DNA样品，并对这些DNA样品使用本发明实施例提供的BT79-F和BT79-R进行PCR扩增。其中使用的水稻品种有嘉66A、嘉66B。通过电泳分析扩增产物，比较两种提取方法的获得的产物对于后续PCR扩增以及产物分析的影响。

结果如图2所示，以BT型核质互作不育系幼苗线粒体DNA(第二种方法获取的DNA样品)、混合DNA(第一种方法获取的DNA样品)为模板，均能扩增出单一条带，扩增效率基本相同。

由此表明，使用本发明实施例提供的引物鉴定时，不需要单独提取水稻幼苗线粒体DNA，只需以常规方法提取水稻DNA，尽管这种方法含有细胞核基因组DNA，但是以其为模板进行PCR扩增，仍然能够有效地扩增出目的产物片段，即可表明本发明实施例提供的扩增引物具有高度的特异性和灵敏性，对于鉴定该线粒体嵌合基因的特异性具有简化操作和实用性的优势，尤其可以克服细胞核中线粒体假基因的影响。

2)不同品系的特异性鉴别

应用简单的第一种方法获取水稻幼苗DNA样品，进行PCR扩增和电泳分析，结果如图3、图4所示。

①5个BT型品系均能扩增出521bp大小的单一条带，5个对应的保持系均没有条带(图3)。

②从当季收获的台A、台B种子中，各随机抽样50粒左右播种成苗，单株提取DNA，所有台A均能扩增出521bp的单一条带(图4A)，所有台B均没有条带(图4B)。

实施例2：BT-CMS型不育系与常规粳稻的鉴别

选择3种BT型核质互作雄性不育系及6种常规粳稻以证明本发明引物BT79对BT型核质互作雄性不育系特异性鉴定的可行性。按以下步骤进行。

供试水稻品系为3种BT型核质互作雄性不育系：春江16A、春江23A、嘉212A；6种常规粳稻品种：秀水134、嘉禾218、嘉花1号、南粳46、南粳9108、嘉58。采用实施例1中的第一种方法提取其幼苗DNA样品，并进行PCR扩增和电泳分析。

如图5所示：3种不育系春江16A、春江23A、嘉212A均能扩增出521bp的单一条带，6种常规粳稻品种均无条带。

由此说明本发明实施例提供的引物对能够准确地扩增出目标条带，有效区分和鉴别BT-CMS型水稻与常规粳稻、保持系，有利于提高BT-CMS纯度鉴定效率，以保障BT型核质互作雄性不育系繁种的安全性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 台州市农业科学研究院

<120> 鉴别BT-CMS型水稻的引物、试剂盒及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ttgtatttac ttgaatgatg ct 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

caaaccacca ctgtcctgtc t 21

<210> 3

<211> 1547

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ttaaaaagat gggaaattcc aatgaatttc gatcacaatc atgtggtaat aatgggtttg 60

aatcagagag actcgatctg gaaactcctc aatgattata acgtgaactc gttgaagaga 120

aggagacaag cagaaataga cgcttttttt gaaccatttg agagggcgca gcgtatccgt 180

ttcaataact ggcagaacgg aatagagttg ttagatgggg ctgaatggag gaacggcgat 240

atagttatcc ctggaggcgg cggaccagta atttcaagcc ccttggatca atttttcatt 300

gatccattat ttggtcttga tatgggtaac ttttatttat cattcacaaa tgaatccttg 360

tctatggcgg taactgtcgt tttggtgcca tctttatttg gagttgttac gaaaaagggc 420

gggggaaagt cagtgccaaa tgcatggcaa tccttggtag agcttattta tgatttcgtg 480

ctgaacctgg taaacgaaca aataggtgga aatgttaaac aaaagttttt ccctcgcatc 540

tcggtcactt ttactttttc gttatttcgt aatccccagg gtatgatacc ctttagcttc 600

acagtgacaa gtcattttct cattactttg gctctttcat tttccatttt tataggcatt 660

acgatcgttg gatttcaaag acatgggctt cattttttta gcttcttatt accagcggga 720

gtcccactgc cattagcacc ttttttagta ctccttgagc taatctctca ttgttttcgt 780

gcattaagct caggaatacg tttatttgct aatatgatgg ccggtcatag ttcagtaaag 840

attttaagtg ggttcgcttg gactatgcta tttctgaata atattttcta tttcatagga 900

gatcttggtc ccttatttat agttctagca ttaaccggtc tggaattagg tgtagctata 960

ttacaagctc atgtttctac gatctcaatt tgtatttact tgaatgatgc tataaatctc 1020

catcaaaatg agtaatttca taattgaata aaaacgagga gccgaagatt ttagggggcg 1080

ggacaaacgc ggaagtgtat tgcgttacaa aaaatgacaa ctagcatttg ttttttcatt 1140

tcatgttcga attcgttttt cgttggaaaa accaacgccg accccaaaca agtctctcca 1200

atataaggag agcggagctt aaaaatatta ttttattaat tgtgctatgg caaatctggt 1260

ccgatggctc ttctccacta cccgagggac taacggtctt ccatatttca tcttcggtgt 1320

cgttgtagga ggcgccctgt tgtttgcttt gctaaagtat caggcccctc tgtacgaccc 1380

ggctttaatg gcaaaaatca tagatcataa tataaaagcc gggcacccta tagaggttga 1440

ctattcgtgg tggggcacct ctattcgtgt agtctttcct aagtaagaaa gacaggacag 1500

tggtggtttg ctcatacttt cattacaaaa ccatactatg gaattct 1547

Claims (5)

1.用于鉴别包台型核质互作雄性不育系水稻的引物，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1所示的BT79-F及如SEQ ID NO.2所示的BT79-R；BT79-F和BT79-R用于扩增BT型核质互作雄性不育系水稻的线粒体嵌合基因Atp6-orf79的特异性序列，所述扩增产物片段长度为521bp；

其中，所述线粒体嵌合基因Atp6-orf79全长1547bp，如SEQ ID NO.3所示，所述BT79-F针对的扩增起始位置为990bp，所述BT79-R针对的扩增起始位置为1469bp；所述特异性序列为所述线粒体嵌合基因Atp6-orf79沿5’至3’端方向第990bp至第1469bp之间的序列。

2.鉴别包台型核质互作雄性不育系水稻的方法，其特征在于，包括以下步骤：

获取水稻幼苗的DNA样品；

使用权利要求1中所述的BT79-F/BT79-R引物对所述DNA样品进行PCR扩增；

对扩增产物进行电泳分析，若出现521bp大小的单一条带，表明该水稻为BT型核质互作雄性不育系。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述扩增反应为20μL反应体系，其成分为：2μl 10×缓冲液(含25mM MgCl₂)，0.4μl 10mM dNTP，0.8μl BT79-F(10pmol/μl)，0.8μlBT79-R(10pmol/μl)，0.8μl待测样品，0.4μl Taq DNA聚合酶(2U/μl)，加水补足至20μl；

反应程序为：95℃预变性5min；32个循环：95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s；最后72℃延伸8min。

4.一种包括权利要求1所述的引物的试剂或试剂盒。

5.权利要求4所述的试剂或试剂盒的用途，所述用途为下述任一种：

1)在鉴定或者辅助鉴定水稻包台型核质互作雄性不育系中的应用；

2)在区分水稻包台型核质互作雄性不育系与保持系中的应用；

3)在选育水稻包台型核质互作雄性保持系中的应用；

4)预测水稻包台型核质互作雄性表型中的应用；

5)在制备鉴定或辅助鉴定水稻包台型核质互作雄性表型产品中的应用；

6)在制备预测水稻包台型核质互作雄性表型产品中的应用；

7)在选育杂交粳稻中的应用。

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