CN106987590B - 一种花生寡核苷酸探针及其设计方法和使用方法 - Google Patents

一种花生寡核苷酸探针及其设计方法和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种花生寡核苷酸探针及其设计方法和使用方法，所述的寡核苷酸探针共有八种，为SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。本发明利用微卫星和端粒序列开发寡核苷酸探针，并利用新开发的寡核苷酸探针组配探针套，构建花生栽培种及野生种寡核苷酸核型，目的是建立经济高效且通用性强的花生细胞学标记设计技术与染色体识别技术，丰富花生染色体标记，识别花生栽培种与野生种基因组及其染色体，鉴定花生野生种染色体结构变异。本发明利用高通量小数据量简化测序(只测基因组4Gb数据量)和生物信息学分析，成功开发了花生寡核苷酸探针标记，为低成本高效率开发花生细胞学标记建立了一种新的有效方法。

Description

一种花生寡核苷酸探针及其设计方法和使用方法
技术领域
本发明涉及一种花生细胞学标记的设计和用法，特别涉及一种花生寡核苷酸探针及其设计方法和使用方法。
背景技术
花生是世界上重要的油料和经济作物，是众多发展中国家重要的植物油脂与蛋白质来源。中国是世界上最大的花生生产、消费和出口国，2016年花生总产约为1650万吨。
到目前为止，已经命名和鉴定的花生属物种约有80个，依据花生属物种间杂交亲和性和形态学等特征，花生属被分为9个区组(section)，包括花生区组(A、B和D基因组)、围脉区组(Ex)、大根区组(C)、三粒子区组(Tris)、匍匐区组(P)、异形花区组(H)、直立区组(E)、三叶区组(Trie)和根茎区组(R)。然而近年来，发现花生属中存在许多野生种分类错误，例如，A.batizocoi、A.cruziana和A.krapovickasii基因组应为K基因组；A.benensis和A.trinitensis基因组应为F基因组；A.decora、A.palustris和A.praecox的基因组应为G基因组等。
为了能够准确区分花生属物种基因组染色体，人们对花生进行了大量研究，也经历了与小麦染色体研究类似的进程。在花生染色体研究初期，人们首先用C-分带的方法识别花生属染色体，但C-分带在花生属物种染色体上带纹少、特异性差。在原位杂交技术出现以后，人们同样也发现了一些花生重复序列元件，如rDNA、反转录转座子、端粒序列和着丝粒序列重复等。基于rDNA基因FISH和花生染色体着丝粒异染色质DAPI带型，B基因组物种被重新划分，并推测出花生栽培种A和B基因组野生供体亲本可能分别为A.duranensis和
Figure BDA0001305152590000011
有研究者利用A.duranensis BAC库筛选了7个花生重复序列探针，构建了较高清晰度栽培花生染色体核型。尽管如此，由于花生染色体标记信号主要分布在着丝粒处或端部，花生染色体辨识度仍然较低。可喜的是栽培种花生二倍体祖先A.duranensis和
Figure BDA0001305152590000012
全基因组测序已经完成，两个基因组大小总和约2.7Gb，其中64％为重复序列。在重复序列中A.duranensis转座元件占61.7％，
Figure BDA0001305152590000013
转座元件占68.5％，这些转座元件中一半为长末端重复序列，10％为DNA转座子序列，7.8％(A.duranensis)和11.7％
Figure BDA0001305152590000014
为长散重复序列(LINE)，显示出花生重复序列探针标记有很大的开发空间。
然而，以基因组DNA、重复序列或单拷贝基因序列等探针为主的FISH技术，通常需要DNA提取、质粒的繁殖与提取或者PCR扩增获得DNA，再用缺刻平移等方法标记探针，因此探针准备程序复杂、费时，而且每次标记反应量有限。因而大规模鉴定染色体存在成本高，准备工作繁琐等问题。
寡核苷酸(Oligonucleotide)最初是应用于RNA研究的，它是一类长度约为几十个碱基的短核苷酸的总称(包括DNA和RNA)。寡核苷酸具有极强的穿透能力，不用克隆、不用退火、易与DNA分子、蛋白质或药物小分子等相互作用。自DNA合成仪问世后，寡核苷酸具有易制备、使用方便、并且可以根据任意碱基序列人工合成其单链形式的特点，因此广泛用于人工基因合成、PCR、DNA测序文库构建和分子探针的制备，并得到大量研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题：克服花生细胞学标记开发困难的问题，设计一种经济高效且通用性强的花生寡核苷酸探针，增加花生细胞学标记；并应用新设计的寡核苷酸探针建立花生染色体荧光原位杂交染色体识别技术，构建花生栽培种及野生种高清染色体核型，解决花生栽培种与野生种基因组、染色体及染色体结构变异鉴定和识别困难的问题。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种花生寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针共有八种，具体为：
探针Oligo DP-1：TAMARA-5′-TGCGATCATACCAGCACTAATGCACCGGATCCCGTCAGAACTCTGAAGTTAAGCGTG-3′；
探针Oligo DP-2：FAM-5′-ACTACTACTACTACTACTACTACTACTACT-3′；
探针Oligo DP-3：FAM-5′-CATTAAATCAGTTATAGTTTGTTTGATGGTA-3′；或
TAMARA-5′-CATTAAATCAGTTATAGTTTGTTTGATGGTA-3′；
探针Oligo DP-4：TAMARA-5′-ATTATTATTATTATTATTATTATTATTATT-3′；
探针Oligo DP-5：FAM-5′-TTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGG-3′；
探针Oligo DP-6：TAMARA-5′-AAAAAATCGGAGGAGCCTGCCGAAGATGAGG-3′；
探针Oligo DP-7：FAM-5′-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3′；或
TAMARA-5′-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3′；
探针Oligo DP-8：FAM-5′-TGAAAACTTTTTATTTTTAAATTTTGAAACT-3′。
一种花生寡核苷酸探针的设计方法，包括以下两种方式：
(a)利用微卫星和端粒序列开发寡核苷酸探针
Oligo DP-1、Oligo DP-2、Oligo DP-4和Oligo DP-5由SSR和端粒序列开发获得，其中，Oligo DP-2和Oligo DP-4通过直接合成所有十种形式三碱基SSR寡核苷酸(AAC)10、(AAG)10、(AGG)10、(ACT)10、(CAT)10、(CAC)10、(ACG)10、(CAG)10、(ATT)10和(GCC)10，然后利用荧光原位杂交筛选有信号的探针获得；OligoDP-1是利用花生基因组DNA序列与小麦5SrDNA比对分析后，截取同源序列上的一段获得；OligoDP-5是直接截取端粒重复序列上的一段获得；
(b)利用基因组简化测序序列开发寡核苷酸探针
Oligo DP-3、Oligo DP-6、Oligo DP-7和Oligo DP-8是通过基因组简化测序和生物信息学分析设计获得：首先提取A.duranensis基因组DNA，由测序公司进行Illumina测序，测4Gb数据量，然后输入Jellyfish基因分析软件计算kmer，设计参数为kmer＝31nt统计拷贝数>1,000次的寡核苷酸；将统计识别的寡核苷酸利用软件CD-HIT Suite、DNAMAN和RepeatMasker，剔除同源重复>60％寡核苷酸序列；再按拷贝数从大到小各选取150条寡核苷酸序列，合成探针；最后利用随机引物法标记探针，将探针用花生品种“四粒红”根尖细胞中期染色体进行荧光原位杂交筛选，有信号的探针进行5′-TAMRA或者FAM人工合成修饰获得。
一种包含花生寡核苷酸探针的探针套，所述的探针套有两种，具体为：
探针套Oligo#1，包括FAM标记的Oligo DP-2、Oligo DP-5和Oligo DP-7，其中各探针浓度分别为Oligo DP-2 100.00ng/μl、Oligo DP-5 100.00ng/μl、Oligo DP-7 26.67ng/μl；
探针套Oligo#2，包括TAMARA标记的Oligo DP-1、Oligo DP-3、Oligo DP-4和OligoDP-6，其中各探针浓度分别为Oligo DP-1 33.33ng/μl、Oligo DP-3 100.00ng/μl、OligoDP-4 100.00ng/μl、Oligo DP-6 100.00ng/μl。
一种利用探针套对花生栽培种和二倍体野生种染色体进行荧光原位杂交混合涂染分析的方法，包括以下步骤：
(1)前期准备
(a)杂交液的制备：先在离心管中配制杂交液，1张染色体标本制片所用杂交液包括去离子甲酰胺分析纯7.5μl、20×SSC缓冲液1.5μl、50％的硫酸葡聚糖溶液2μl、Oligo#12μl和Oligo#2 2μl；杂交液在离心管内混匀后在75℃变性13min，然后立即将离心管置于-20℃的100％酒精中10-15min；
(b)染色体标本变性：在花生栽培种或二倍体野生种根尖有丝分裂中期制片，-70℃冰冻揭片，载玻片放置在70％的甲酰胺溶液中，75℃变性70s，再在-20℃条件下分别在70％、95％、100％的酒精中梯度脱水各5min，吹干载玻片；
(2)荧光原位杂交混合涂染分析
将步骤(a)的杂交液滴到步骤(b)的载玻片上，盖上盖玻片，于37℃杂交6-8h；室温条件下取下盖玻片，分别用2×SSC缓冲液浸泡3次，各10min；再用1×PBS缓冲液浸泡5min；将载玻片沥干，在每张载玻片上加含0.5μg/ml DAPI的DAPI缓冲液500μl，染色3-4min，用DAPI缓冲液冲洗4-5次，滴7μl防荧光淬灭封片剂，盖上20mm×20mm盖玻片，用荧光显微镜照相获取混合涂染图片，根据图片染色体上带型分布特征，构建花生栽培种及野生种高清染色体核型，用于识别花生栽培种与野生种基因组、染色体及染色体结构变异。
所述的2×SSC缓冲液包含0.3M的柠檬酸三钠Na3C6H5O7·2H2O和3M的NaCl。
所述的1×PBS缓冲液包含0.14M NaCl、0.0027M KCl、0.01M Na2HPO4、0.0018MKH2PO4。
所述的DAPI缓冲液包含0.1M柠檬酸和0.05M Na2HPO4。
本发明的有益效果：
1、本发明首先利用花生栽培种A基因组供体A.duranensis基因组DNA进行测序，获得4Gb数据量序列，通过生物信息学分析，开发花生寡核苷酸探针，同时利用微卫星(SSR)和端粒序列开发花生寡核苷酸探针。然后利用新开发的寡核苷酸探针组配探针套，构建花生栽培种及野生种寡核苷酸核型，目的是建立经济高效且通用性强的花生细胞学标记设计技术与染色体识别技术，丰富花生染色体标记，识别花生栽培种与野生种基因组及其染色体，鉴定花生野生种染色体结构变异。
2、本发明利用高通量小数据量简化测序(只测基因组4Gb数据量)和生物信息学分析，成功开发了花生寡核苷酸探针标记，为低成本高效率开发花生细胞学标记建立了一种新的有效方法。
3、本发明根据寡核苷酸探针在染色体上带型分布特征，构建了花生栽培种及野生种高清染色体核型，为识别花生栽培种与野生种基因组、染色体及染色体结构变异奠定了技术基础，揭示了寡核苷酸探针具有很好的应用前景。
附图说明
图1为在四粒红(上排)、A.duranensis(中排)和
Figure BDA0001305152590000041
(下排)染色体上利用45SrDNA(e、j和o；红色)、5S rDNA(e、j和o；绿色)、A.duranensis(a绿色)和
Figure BDA0001305152590000042
(a红色)基因组DNA顺序FISH对新开发的寡核苷酸探针Oligo DP-1(b、g和l；绿色)和Oligo DP-2(c、h和m；红色)进行染色体定位。f和k为DAPI染色，d、i和n分别为(b和c)、(g和h)和(l和m)的叠加图，其中Oligo DP-1为绿色，Oligo DP-2为红色。
可以看出Oligo DP-1和Oligo DP-2在四粒红、A.duranensis和
Figure BDA0001305152590000043
染色体上均有杂交信号。
图2为在四粒红(上排)、A.duranensis(中排)和
Figure BDA0001305152590000044
(下排)染色体上利用45SrDNA(e、j和o；红色)、5S rDNA(e、j和o；绿色)、A.duranensis(a绿色)和
Figure BDA0001305152590000045
(a红色)基因组DNA顺序FISH对新开发的寡核苷酸探针Oligo DP-3(b、g和l；绿色)和Oligo DP-4(c、h和m；红色)进行染色体定位。f和k为DAPI染色，d、i和n分别为(b和c)、(g和h)和(l和m)的叠加图，其中Oligo DP-3为绿色，Oligo DP-4为红色。
可以看出Oligo DP-3和Oligo DP-4在四粒红、A.duranensis和
Figure BDA0001305152590000051
染色体上均有杂交信号。
图3为在四粒红(上排)、A.duranensis(中排)和
Figure BDA0001305152590000052
(下排)染色体上利用45SrDNA(e、j和o；红色)、5S rDNA(e、j和o；绿色)、A.duranensis(a绿色)和
Figure BDA0001305152590000053
(a红色)基因组DNA顺序FISH对新开发的寡核苷酸探针Oligo DP-5(b、g和l；绿色)和Oligo DP-6(c、h和m；红色)进行染色体定位。f和k为DAPI染色，d、i和n分别为(b和c)、(g和h)和(l和m)的叠加图，其中Oligo DP-5为绿色，Oligo DP-6为红色。
可以看出Oligo DP-5和Oligo DP-6在四粒红、A.duranensis和
Figure BDA0001305152590000054
染色体上均有杂交信号。
图4为在四粒红(上排)、A.duranensis(中排)和
Figure BDA0001305152590000055
(下排)染色体上利用45SrDNA(e、j和o；红色)、5S rDNA(e、j和o；绿色)、A.duranensis(a绿色)和
Figure BDA0001305152590000056
(a红色)基因组DNA顺序FISH对新开发的寡核苷酸探针Oligo DP-7(b、g和l；绿色)和Oligo DP-8(c、h和m；红色)进行染色体定位。f和k为DAPI染色，d、i和n分别为(b和c)、(g和h)和(l和m)的叠加图，其中Oligo DP-7为绿色，Oligo DP-8为红色。
可以看出Oligo DP-7和Oligo DP-8在四粒红、A.duranensis和
Figure BDA0001305152590000057
染色体上均有杂交信号。
图5为以Oligo#1(a、e、g、i、k、m、o、q和s；绿色)和Oligo#2(a、e、g、i、k、m、o、q和s；红色)、45S rDNA(b、f、h、j、l、n、p、r和t；红色)、5S rDNA(b、f、h、j、l、n、p、r和t；绿色)、A.duranensis(c，绿色)和
Figure BDA0001305152590000058
(c，红色)基因组DNA为探针信号在花生属9个物种染色体上的顺序FISH/GISH分析和四粒红DAPI着丝粒异染色质带(d，蓝色)。
可以看出Oligo#1和Oligo#2在栽培种花生和野生种上均产生了丰富的杂交信号。
图6为花生栽培种四粒红和8个花生属物种染色体新核型。染色体左侧SSON为Oligo#1(绿色)和Oligo#2信号(红色)，右侧45S/5S列为45S rDNA(红色)和5S rDNA(绿色)信号。
可以看出每个物种均有自己特殊的染色体带型，可以用于识别物种基因组和染色体。
图7为花生属物种中的染色体变异。Oligo#1信号为绿色和Oligo#2信号为红色，45SrDNA信号为红色和5S rDNA信号为绿色。
可以看出(a)为杂合rDNA分布变异；(b)为rDNA倒位；(c)为同源染色体臂比变异；(d)为Oligo#1序列分布位点变异；(e)为染色体形态类型变异。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。文中如果没有特别说明，其中的百分含量均为重量百分含量。
本发明所用部分试剂如下：
2×SSC缓冲液包含0.3M的柠檬酸三钠Na3C6H5O7·2H2O和3M的NaCl。
1×PBS缓冲液包含0.14M NaCl、0.0027M KCl、0.01M Na2HPO4、0.0018M KH2PO4。
DAPI缓冲液包含0.1M柠檬酸和0.05M Na2HPO4。
实施例1、一种花生寡核苷酸探针的设计方法
本发明花生寡核苷酸探针的设计方法，包括以下两种方式：
(a)利用微卫星(SSR)和端粒序列开发寡核苷酸探针
首先直接合成所有十种形式三碱基SSR寡核苷酸(AAC)10、(AAG)10、(AGG)10、(ACT)10、(CAT)10、(CAC)10、(ACG)10、(CAG)10、(ATT)10和(GCC)10，然后利用花生栽培品种“四粒红”根尖中期染色体进行荧光原位杂交筛选，发现探针Oligo DP-2和Oligo DP-4在四粒红染色体上有信号，进一步利用45S rDNA、5S rDNA、A.duranensis和
Figure BDA0001305152590000061
基因组DNA顺序FISH对新开发的寡核苷酸探针OligoDP-2和Oligo DP-4在四粒红、A.duranensis和
Figure BDA0001305152590000062
染色体上进行定位。发现OligoDP-2和Oligo DP-4在四粒红、A.duranensis和
Figure BDA0001305152590000063
多数染色体着丝粒处均产生稳定的杂交信号(图1c、h和m；图2c、h和m)。利用花生基因组DNA与小麦5S rDNA(GenBank:M10470.1)比对分析后，截取同源序列上的一段，荧光原位杂交分析发现其在花生染色体上有信号，获得Oligo DP-1，采取上述相同的定位方法，发现Oligo DP-1在四粒红、A.duranensis和
Figure BDA0001305152590000064
的几条染色体臂上产生稳定的杂交信号(图1b、g和l)。截取端粒重复序列上的一段获得Oligo DP-5，定位后发现在四粒红、A.duranensis和
Figure BDA0001305152590000065
的染色体末端、着丝粒和臂上产生了杂交信号(图3b、g和l)。寡核苷酸探针Oligo DP-1、Oligo DP-2、Oligo DP-4和Oligo DP-5的序列如下：
探针Oligo DP-1：TAMARA-5′-TGCGATCATACCAGCACTAATGCACCGGATCCCGTCAGAACTCTGAAGTTAAGCGTG-3′(SEQ ID NO.1)；
探针Oligo DP-2：FAM-5′-ACTACTACTACTACTACTACTACTACTACT-3′(SEQ ID NO.2)；
探针Oligo DP-4：TAMARA-5′-ATTATTATTATTATTATTATTATTATTATT-3′(SEQ IDNO.4)；
探针Oligo DP-5：FAM-5′-TTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGG-3′(SEQ ID NO.5)。
(b)利用基因组简化测序序列开发寡核苷酸探针
首先提取A.duranensis基因组DNA，由测序公司进行Illumina测序，测4Gb数据量。然后利用Jellyfish(Version 1.1.11)软件计算kmer，设计参数为kmer＝31nt统计拷贝数>1,000次的寡核苷酸。然后将统计识别的寡核苷酸用软件CD-HIT Suite(http://weizhong-lab.ucsd.edu/cdhit_suite/cgi-bin/index.cgi？cmd＝cd-hit)、DNAMAN(http://www.lynnon.com)和RepeatMasker(http://www.repeatmasker.org/)剔除同源重复>60％寡核苷酸序列。然后按拷贝数从大到小各选取150条寡核苷酸序列，合成探针。利用随机引物法标记探针，将探针用四粒红根尖细胞中期染色体进行荧光原位杂交筛选，获得有信号的探针。将有信号的探针送Invitrogen公司(上海)进行5′-TAMRA或者FAM人工合成修饰，获得了寡核苷酸探针Oligo DP-3、Oligo DP-6、Oligo DP-7和Oligo DP-8，通过利用45SrDNA、5S rDNA、A.duranensis和
Figure BDA0001305152590000071
基因组DNA对寡核苷酸探针进行顺序FISH定位，发现Oligo DP-3(图2b、g和l)、Oligo DP-6(图3c、h和m)、Oligo DP-7(图4b、g和l)和OligoDP-8(图4c、h和m)在四粒红、A.duranensis和
Figure BDA0001305152590000072
多数染色体着丝粒处均产生稳定的杂交信号。寡核苷酸探针Oligo DP-3、Oligo DP-6、Oligo DP-7和Oligo DP-8的具体序列如下：
探针Oligo DP-3：FAM-5′-CATTAAATCAGTTATAGTTTGTTTGATGGTA-3′或
TAMARA-5′-CATTAAATCAGTTATAGTTTGTTTGATGGTA-3′(SEQ ID NO.3)；
探针Oligo DP-6：TAMARA-5′-AAAAAATCGGAGGAGCCTGCCGAAGATGAGG-3′(SEQ IDNO.6)；
探针Oligo DP-7：FAM-5′-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3′或
TAMARA-5′-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3′(SEQ ID NO.7)；
探针Oligo DP-8：FAM-5′-TGAAAACTTTTTATTTTTAAATTTTGAAACT-3′(SEQ IDNO.8)。
实施例2、花生寡核苷酸探针的使用方法
1、探针套的设计
本发明利用Oligo DP-1～Oligo DP-7组配了两组探针套，分别为Oligo#1(FAM标记的Oligo DP-2、Oligo DP-5和Oligo DP-7)和Oligo#2(TAMARA标记的Oligo DP-1、OligoDP-3、Oligo DP-4和Oligo DP-6)，探针浓度见表1。
2、试验材料
所用花生栽培种四粒红和8个二倍体野生种均有河南农业科学院经济作物研究所保存(表2)。
表1：花生寡核苷酸探针套
Figure BDA0001305152590000081
表2：四粒红和8个花生野生种的区组及编号
Figure BDA0001305152590000082
3、荧光原位杂交混合涂染分析
利用探针套对花生栽培品种四粒红和8个二倍体野生种进行混合涂染分析，包括以下步骤：
(1)前期准备
(a)杂交液的制备：先在离心管中配制杂交液，1张染色体标本制片所用杂交液包括去离子甲酰胺分析纯7.5μl、20×SSC缓冲液1.5μl、50％的硫酸葡聚糖溶液2μl、Oligo#12μl和Oligo#2 2μl；杂交液在离心管内混匀后在75℃变性13min，然后立即将离心管置于-20℃的100％酒精中10-15min；
(b)染色体标本变性：在花生栽培种或二倍体野生种根尖有丝分裂中期制片，-70℃冰冻揭片，载玻片放置在70％的甲酰胺溶液中，75℃变性70s，再在-20℃条件下分别在70％、95％、100％的酒精中梯度脱水各5min，吹干载玻片；
(2)荧光原位杂交混合涂染分析
将步骤(a)的杂交液滴到步骤(b)的载玻片上，盖上盖玻片，于37℃杂交6-8h；室温条件下取下盖玻片，分别用2×SSC缓冲液浸泡3次，各10min；再用1×PBS缓冲液浸泡5min；将载玻片沥干，在每张载玻片上加含0.5μg/ml DAPI的DAPI缓冲液500μl，染色3-4min，用DAPI缓冲液冲洗4-5次，滴7μl防荧光淬灭封片剂(VECTAshield mounting)，盖上20mm×20mm盖玻片，用荧光显微镜照相获取混合涂染图片(图5)。从图5中可以看出Oligo#1和Oligo#2在栽培种花生四粒红和8个野生种染色体上均产生了丰富的红色和绿色杂交信号。
根据图片染色体上带型分布特征，把栽培种花生四粒红和8个野生种染色体剪切出来，按照从大到小构建花生栽培种及野生种高清染色体核型(图6)。从图6中可以看出每个物种均有自己特殊的染色体带型，首先栽培种四粒红花生Ahy和Bhy基因组具有显著差异，Bhy基因组Bhy5染色体上有明显区别于其它基因组染色体的Oligo#2信号，并且除Bhy5和Bhy2染色体外，其它染色体着丝粒处均具有明亮的Oligo#1信号。Ahy基因组有小染色体Ahy9、只有Oligo#1末端大量信号的Ahy7和只有Oligo#2着丝粒信号的Ahy1和Ahy5染色体等染色体明显区别于其它基因组。A.duranensis的Adu1着丝粒缺少Oligo#2信号，Adu5长臂Oligo#1信号明显多于Ahy5，
Figure BDA0001305152590000091
的Bi2和Bi10缺少Oligo#1信号外，其余信号的密度和分布位置几乎与栽培种一致。其次，A.chiquitana的9号小染色体长度明显大于A.duranensis、A.stenosperma、A.diogoi和A.villosa小染色体且缺少着丝粒Oligo#2信号，Ac5相比其它染色体组5号染色体也缺少长臂中间插入Oligo#1信号。A.duranensis、A.stenosperma、A.diogoi和A.villosa在1、4、5、6、7和8号染色体上信号差异较大，A.diogoi基因组在这些染色体上都有杂交信号，其中Adi4、Adi5和Adi8上同时具有Oligo#1和Oligo#2强杂交信号。A.stenosperma在As4上同时具有Oligo#1和Oligo#2强杂交信号，As7和As8着丝粒有少量的Oligo#1或Oligo#2信号，区别于其它几个基因组。A.duranensis和A.villosa核型较为近似，只在1号着丝粒处存在Oligo#1信号差异。最后，A.batizocoi和A.stenophylla核型明显不同于A和B基因组，A.batizocoi和A.stenophylla均具有Oligo#1信号，几乎覆盖9号染色体整个短臂，10号染色体同时具有45S和5S rDNA位点，明显区别于其它基因组。A.batizocoi和A.stenophylla基因组之间不同的是A.batizocoi在Kb3和Kb8上有5S rDNA位点，而A.stenophylla对应染色体上没有；ES5、ES6和ES7同时具有Oligo#1或Oligo#2信号，而Kb5、Kb6和Kb7上只有Oligo#1信号；此外，K105和ES10的45S和5S rDNA位点是颠倒的，说明本发明可以识别不同的基因组。
进一步把杂交信号分布特殊的染色体和部分同源染色体挑拣出比较差异，发现存在多种染色体结构变异如A基因组7号染色体的同源染色体间显示不同的rDNA信号，其中在As7同源染色体间，45S rDNA位点为一对大小相同的杂交信号，在Ac7上则为一大一小，在Adi7上为一条有信号而另一条没有，表现为杂合rDNA分布变异(图7a)；Bi10、Kb10和Es10上也显示出rDNA变异，Bi10只有45S rDNA位点，Kb10和Es10则同时具有45S rDNA和5SrDNA位点，但Kb10和Es10上的45S rDNA和5S rDNA位点位置相反，并且Es10长臂上有Oligo#1和Oligo#2信号，而Kb10长臂上则没有，表现为rDNA倒位(图7b)；同源染色体臂比多态性，从染色体带型看，花生栽培种Ahy2与其供体亲本A.duranensis的Adu2Oligo#1均有大面积的着丝粒带和长臂45SrDNA位点，而Ahy10与Adu10Oligo#1均有少量着丝粒信号和长臂45SrDNA位点，同时，Ahy2和Adu10为m染色体，而Ahy10和Adu2为sm染色体，显示出两对染色体均由m染色体转变为sm染色体，表现为同源染色体臂比变异(图7c)；Oligo#1信号分布位置变异，Oligo#1在不同物种染色体不同位置产生了清晰信号，包括染色体端部、染色体臂中、近着丝粒和着丝粒处均有分布，且序列扩增明显，表现为Oligo#1序列分布位点变异(图7d)；染色体形态多样性，在野生种染色体中存在中着丝粒染色体小染色体“A染色体”(Ac9和As9)，亚中着丝粒染色体Es9和亚端着丝粒染色体Es10等多种类型，表现为染色体形态类型变异(图7e)等，显示出本发明可以用于变异染色体结构识别。
以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省农业科学院
<120> 一种花生寡核苷酸探针及其设计方法和使用方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgcgatcata ccagcactaa tgcaccggat cccgtcagaa ctctgaagtt aagcgtg 57
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
actactacta ctactactac tactactact 30
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cattaaatca gttatagttt gtttgatggt a 31
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
attattatta ttattattat tattattatt 30
<210> 5
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tttagggttt agggtttagg gtttagggtt tagggtttag ggtttagggt ttaggg 56
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaaaaatcgg aggagcctgc cgaagatgag g 31
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 31
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tgaaaacttt ttatttttaa attttgaaac t 31

Claims (7)

1.一种花生寡核苷酸探针，其特征在于，所述的寡核苷酸探针由八种组成，具体为：
探针Oligo DP-1：TAMARA-5′-TGCGATCATACCAGCACTAATGCACCGGATCCCGTCAGAACTCTGAAGTTAAGCGTG-3′；
探针Oligo DP-2：FAM-5′-ACTACTACTACTACTACTACTACTACTACT-3′；
探针Oligo DP-3：FAM-5′-CATTAAATCAGTTATAGTTTGTTTGATGGTA-3′；或
TAMARA-5′-CATTAAATCAGTTATAGTTTGTTTGATGGTA-3′；
探针Oligo DP-4：TAMARA-5′-ATTATTATTATTATTATTATTATTATTATT-3′；
探针Oligo DP-5：FAM-5′-TTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGG-3′；
探针Oligo DP-6：TAMARA-5′-AAAAAATCGGAGGAGCCTGCCGAAGATGAGG-3′；
探针Oligo DP-7：FAM-5′-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3′；或
TAMARA-5′-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3′；
探针Oligo DP-8：FAM-5′-TGAAAACTTTTTATTTTTAAATTTTGAAACT-3′。
2.一种如权利要求1所述的花生寡核苷酸探针的设计方法，其特征在于，包括以下两种方式：
(a)利用微卫星和端粒序列开发寡核苷酸探针
Oligo DP-1、Oligo DP-2、Oligo DP-4和Oligo DP-5由SSR和端粒序列开发获得，其中，Oligo DP-2和Oligo DP-4通过直接合成所有十种形式三碱基SSR寡核苷酸(AAC)10、(AAG)10、(AGG)10、(ACT)10、(CAT)10、(CAC)10、(ACG)10、(CAG)10、(ATT)10和(GCC)10，然后利用荧光原位杂交筛选有信号的探针获得；OligoDP-1是利用花生基因组DNA序列与小麦5SrDNA比对分析后，截取同源序列上的一段获得；OligoDP-5是直接截取端粒重复序列上的一段获得；
(b)利用基因组简化测序序列开发寡核苷酸探针
Oligo DP-3、Oligo DP-6、Oligo DP-7和Oligo DP-8是通过基因组简化测序和生物信息学分析设计获得：首先提取A.duranensis基因组DNA，由测序公司进行Illumina测序，测4Gb数据量，然后输入Jellyfish基因分析软件计算kmer，设计参数为kmer＝31nt统计拷贝数>1,000次的寡核苷酸；将统计识别的寡核苷酸利用软件CD-HIT Suite、DNAMAN和RepeatMasker，剔除同源重复>60％寡核苷酸序列；再按拷贝数从大到小各选取150条寡核苷酸序列，合成探针；最后利用随机引物法标记探针，将探针用花生品种“四粒红”根尖细胞中期染色体进行荧光原位杂交筛选，有信号的探针进行5′-TAMRA或者FAM人工合成修饰获得。
3.一种包含权利要求1所述的花生寡核苷酸探针的探针套，其特征在于，所述的探针套有两种，具体为：
探针套Oligo#1，包括FAM标记的Oligo DP-2、Oligo DP-5和Oligo DP-7，其中各探针浓度分别为Oligo DP-2 100.00ng/μl、Oligo DP-5 100.00ng/μl、Oligo DP-7 26.67ng/μl；
探针套Oligo#2，包括TAMARA标记的Oligo DP-1、Oligo DP-3、Oligo DP-4和Oligo DP-6，其中各探针浓度分别为Oligo DP-1 33.33ng/μl、Oligo DP-3 100.00ng/μl、Oligo DP-4100.00ng/μl、Oligo DP-6 100.00ng/μl。
4.一种利用权利要求3所述的探针套对花生栽培种和二倍体野生种染色体进行荧光原位杂交混合涂染分析的方法，包括以下步骤：
(1)前期准备
(a)杂交液的制备：先在离心管中配制杂交液，1张染色体标本制片所用杂交液包括去离子甲酰胺分析纯7.5μl、20×SSC缓冲液1.5μl、50％的硫酸葡聚糖溶液2μl、Oligo#1 2μl和Oligo#2 2μl；杂交液在离心管内混匀后在75℃变性13min，然后立即将离心管置于-20℃的100％酒精中10-15min；
(b)染色体标本变性：在花生栽培种或二倍体野生种根尖有丝分裂中期制片，-70℃冰冻揭片，载玻片放置在70％的甲酰胺溶液中，75℃变性70s，再在-20℃条件下分别在70％、95％、100％的酒精中梯度脱水各5min，吹干载玻片；
(2)荧光原位杂交混合涂染分析
将步骤(a)的杂交液滴到步骤(b)的载玻片上，盖上盖玻片，于37℃杂交6-8h；室温条件下取下盖玻片，分别用2×SSC缓冲液浸泡3次，各10min；再用1×PBS缓冲液浸泡5min；将载玻片沥干，在每张载玻片上加含0.5μg/ml DAPI的DAPI缓冲液500μl，染色3-4min，用DAPI缓冲液冲洗4-5次，滴7μl防荧光淬灭封片剂，盖上20mm×20mm盖玻片，用荧光显微镜照相获取混合涂染图片，根据图片染色体上带型分布特征，构建花生栽培种及野生种高清染色体核型，用于识别花生栽培种与野生种基因组、染色体及染色体结构变异。
5.根据权利要求4所述的利用探针套对花生栽培种和二倍体野生种染色体进行荧光原位杂交混合涂染分析的方法，其特征在于，所述的2×SSC缓冲液包含0.3M的柠檬酸三钠Na3C6H5O7·2H2O和3M的NaCl。
6.根据权利要求4所述的利用探针套对花生栽培种和二倍体野生种染色体进行荧光原位杂交混合涂染分析的方法，其特征在于，所述的1×PBS缓冲液包含0.14M NaCl、0.0027MKCl、0.01M Na2HPO4、0.0018M KH2PO4。
7.根据权利要求4所述的利用探针套对花生栽培种和二倍体野生种染色体进行荧光原位杂交混合涂染分析的方法，其特征在于，所述的DAPI缓冲液包含0.1M柠檬酸和0.05MNa2HPO4。
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