CN109694902B - 一种花生染色体探针染色试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种花生染色体探针染色试剂盒及其使用方法，该试剂盒包括Probe Mix干粉、浓度为100μg/ml DAPI母液、2×SSC缓冲液、DAPI缓冲液、染色缸和品种对照核型，其中Probe Mix干粉中的探针包括TAM荧光标记的DP‑1、DP‑7和FAM荧光标记DP‑5、DP‑8。本发明建立了花生探针染色技术，并开发了探针染色试剂盒，它是一种新型花生带型分析方法，与传统的分带技术和荧光原位杂交等分带技术相比，该技术方法简单、高效且成本更低，可有效用于花生物种识别和基因组分类等，并为下一步自动化分析鉴定花生染色体奠定基础。

Description

一种花生染色体探针染色试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及花生细胞学研究领域，特别涉及一种花生染色体探针染色试剂盒及其使用方法。

背景技术

植物染色体工程技术，是利用细胞遗传学的方法，人为地、有目的、有计划地增、减、代换、易位同种或异种染色体、或染色体片段，从而创造符合人们需要的具有不同染色体结构的新植物。染色体工程育种在植物种质资源的创造、育种改良、遗传研究材料创制等方面发挥着重要作用。而构建植物染色体核型依赖于单条染色体的识别技术，但是，植物染色体鉴定技术的落后，限制了植物染色体的深入研究和染色体工程技术的发展。因此，需要发展细胞学鉴定方法，促进植物染色体结构和功能研究。

纵观染色体研究历程，染色体鉴定技术先后经历了染色体分带技术、以质粒DNA探针为主的荧光原位杂交技术(FISH)以及最新发展的单链寡核苷酸探针FISH等。三种技术相比，质粒DNA FISH比分带技术带型更稳定，更易于识别。单链寡核苷酸探针FISH技术比质粒DNA FISH技术，程序更为简单、方法更高效，成本更低。

花生是世界上重要的经济作物。简单、高效、低成本的染色体鉴定技术有利于花生品种或种质的批量鉴定。目前，寡核苷酸FISH技术已经成功在许多作物上应用，并大幅提升了染色体的鉴定效率。然而，寡核苷酸FISH技术依然包含较多的人为操作步骤，不利于自动化鉴定。

前人研究发现，寡核苷酸不仅可以进行变性FISH，还可以进行非变性FISH。迄今为止，小麦、黑麦、大麦和玉米都有寡核苷酸非变性FISH的报道。这主要是因为寡核苷酸可能具备直接侵入DNA双联的能力。我们研究发现，适当长度的寡核苷酸探针侵入能力更强，更稳定，并且可以在极低浓度侵入到染色体，产生信号，这为我们发展寡核苷酸探针染液提供一个很好的思路。

发明内容

本发明针对花生开发了一种比寡核苷酸FISH效率更高的探针染色技术，并设计了试剂盒。它可以高效的染色花生染色体，并且可以重复利用，有益于未来自动化分析鉴定花生染色体。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种花生染色体探针染色试剂盒，包括Probe Mix干粉、浓度为100μg/ml DAPI母液、2×SSC缓冲液、DAPI缓冲液、染色缸。

上述试剂盒还包括品种对照核型。

Probe Mix干粉中的探针包括TAM荧光标记的DP-1、DP-7和FAM荧光标记DP-5、DP-8，每种探针含量均为0.2OD，具体如下：

2×SSC缓冲液由0.3M的柠檬酸三钠C₆H₅Na₃O₇·2H₂O和3M的NaCl组成。

DAPI缓冲液由0.1M柠檬酸和0.05M Na₂HPO₄组成。

染色缸为黑色避光的玻璃染色缸。

一种花生染色体探针染色试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)染液配制：用2×SSC缓冲液溶解Probe Mix干粉，其中探针DP-1、DP-5、DP-7和DP-8终浓度均为0.005OD/ml；

(2)将包含有花生染色体的载玻片置于染液中，染色5-6h；然后用2×SSC缓冲液冲洗3-5次，再在每张载玻片上滴加体积比为2.5:500、浓度100μg/ml的DAPI母液和DAPI缓冲液的混合液，染色3-4min，之后用DAPI缓冲液冲洗5次，滴加防荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片，在荧光显微镜下照相。

染色温度为35-37℃。

步骤(2)的染液在染色缸中。

本发明有益效果：

本发明建立了花生探针染色技术，并开发了探针染色试剂盒，它是一种新型花生带型分析方法，与传统的分带技术和荧光原位杂交等分带技术相比，该技术方法简单、高效且成本更低，可有效用于花生物种识别和基因组分类等，并为下一步自动化分析鉴定花生染色体奠定基础。

附图说明

图1为利用本发明试剂盒对花生栽培种四粒红中期染色体染色结果(a)和核型图(b)。图1b中A、B分别代表花生的A和B基因组。

图2为利用本发明试剂盒对21个花生栽培种和30个花生野生种染色体染色获得的染色核型以及基因组分类情况。

图3为利用本发明试剂盒对经处理的花生根尖组织染色结果。图中a和b分别为两个不同的视野区域。图中a和b从左到右图片分别为DAPI染色，红色探针染色信号和DAPI染色与信号的合成图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1、花生染色体探针染色试剂盒

所述的试剂盒包括Probe Mix干粉、浓度为100μg/ml DAPI母液、2×SSC缓冲液、DAPI缓冲液、染色缸和品种对照核型。

其中Probe Mix干粉中的探针包括TAM荧光标记的探针DP-1、DP-7和FAM荧光标记的探针DP-5、DP-8，每种探针含量均为0.2OD，具体如下：

2×SSC缓冲液由0.3M的柠檬酸三钠C₆H₅Na₃O₇·2H₂O和3M的NaCl组成。

DAPI缓冲液由0.1M柠檬酸和0.05M Na₂HPO₄组成。

染色缸为黑色避光的玻璃染色缸。

实施例2、花生染色体探针染色试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)染液配制：利用1ml 2×SSC缓冲液溶解Probe Mix干粉，倒入染色缸，并加入39ml2×SSC缓冲液，使DP-1、DP-5、DP-7和DP-8终浓度均为0.005OD/ml；

(2)将包含有花生染色体的载玻片(76×26×1mm)置于染色缸染液中，35-37℃染色6h；取出载玻片，用2×SSC缓冲液冲洗3次，然后在每张载玻片上滴加500μl体积比2.5:500的DAPI母液(100μg/ml)和DAPI缓冲液的混合液，染色3-4min，之后用DAPI缓冲液冲洗4-5次，滴加5μl防荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片，在荧光显微镜下照相。

实施例3、花生栽培种四粒红染色体的染色

采用实施例2的方法，用同一染色缸染液对花生栽培种四粒红中期染色体进行染色，染色获得图片(图1a)，并剪出每条染色体，排列出核型(图1b)。从图1中可以看出，利用试剂盒Probe Mix染液染色后，染色体存在明显的红绿特征信号，A基因组以红色信号为主，B基因组以绿色信号为主，根据颜色可明显区分花生的A和B基因组。此外花生各染色体带型差异不同，特征如下：A基因组中，1号染色体只有端部有微弱的信号，2号染色体着丝粒处有较弱的红和绿色信号，3号染色体着丝粒和短臂近着丝粒处有强的红和绿色信号，4号染色体着丝粒处有较强的红色信号且长臂端部绿色信号较强，5号染色体同时有强的着丝粒红色信号和且长臂中间绿色信号，6号染色体有弱的红色着丝粒信号，7号染色体有很强的短臂端部信号，8号染色体有较强的红色着丝粒信号，9号染色体着丝粒处有强的红色信号且是最小的染色体，10号染色体是易被拉伸成两段的随体染色体；B基因组中，1号、7号、8号和10号染色体只有弱的端粒信号，没有其它信号，但1号染色体最大，7号、8号和10号染色体较难区分，2号染色体有弱的绿色着丝粒信号，3号染色体着丝粒和短臂近着丝粒处有较强的红和绿色信号，4号染色体着丝粒处有强的绿色信号，5号染色体同时有非常强的着丝粒绿色信号，6号染色体有中等强度的绿色着丝粒信号，9号染色体着丝粒处有中等强度的绿色信号且它是B基因组最小的染色体。

实施例4、花生属物种染色体的染色验证

采用实施例2的方法，用同一染色缸染液对21个花生栽培种和30个花生野生种(表1)染色体染色，拍照，排列染色体核型，结果构建了这51个物种的核型图(图2)。从核型图可以看出A基因组信号以红色为主，且均包含9号“小染色体”，而B基因组以绿色为主，包含大面积绿色着丝粒信号的5号染色体；F基因组有着丝粒大面积绿色信号的5号染色体，但其它染色体以红色信号为主；E基因组和K基因组均包含短臂大面积绿色信号的9号明显不同于A、B和F基因组，但E基因组其它染色体信号以绿色为主，而K基因组以红色为主；H基因组信号很少，明显不同于A、B、F、E和K基因组。在花生各物种中，重复序列分布是相对稳定的，DP-1、DP-5、DP-7和DP-8均是利用重复序列设计的探针，因此用它们染色获得的染色核型图也是相对稳定的，表明可以以这个核型图为对照，有效区分栽培种和野生种基因组。

实施例5、花生根尖组织的染色

将花生根尖组织经酒精：醋酸的混合液(体积比3:1)处理后，然后放入包含有本发明染色液的缸染中，染色12h；然后用水冲洗5次，再将根尖放在载玻片上，滴加质量浓度45％的醋酸；盖上盖玻片压片，-80℃冰冻24h后，揭掉盖玻片，烘烤风干后，在每张载玻片上滴加体积比2.5:500的DAPI母液(100μg/ml)和DAPI缓冲液的混合液，染色3-4min，之后用DAPI缓冲液冲洗5次，滴加5μl防荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片，在荧光显微镜下照相(图3)。可以看出，花生组织染色质上出现了明显的红色信号，表明该试剂盒可以有效对经过处理的植物死体进行染色。

表1对照核型所用品种的系谱号、来源和区组

序列表

<110> 河南省农业科学院

<120> 一种花生染色体探针染色试剂盒及其使用方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

tgcgatcata ccagcactaa tgcaccggat cccgtcagaa ctctgaagtt aagcgtg 57

<210> 2

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

tttagggttt agggtttagg gtttagggtt tagggtttag ggtttagggt ttaggg 56

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 31

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

tgaaaacttt ttatttttaa attttgaaac t 31

Claims (7)

1.一种花生染色体探针染色试剂盒的使用方法，其特征在于，所述试剂盒包括ProbeMix干粉、浓度为100μg/ml DAPI母液、2×SSC缓冲液、DAPI缓冲液、染色缸；

所述的Probe Mix干粉中的探针由TAM荧光标记的DP-1、DP-7和FAM荧光标记DP-5、DP-8组成，每种探针含量均为0.2OD，具体如下：

Probe Mix 引物序列 OD/管 5'修饰 DP-1 5'-TGCGATCATACCAGCACTAATGCACCGGATCCCGTCAGAACTCTGAAGTTAAGCGTG-3' 0.2 TAM DP-5 5'-TTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGG-3' 0.2 FAM DP-7 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3' 0.2 TAM DP-8 5'-TGAAAACTTTTTATTTTTAAATTTTGAAACT-3' 0.2 FAM

所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：

(1)染液配制：用2×SSC缓冲液溶解Probe Mix干粉，其中探针DP-1、DP-5、DP-7和DP-8终浓度均为0.005OD/ml；

(2)将包含有花生染色体的载玻片置于染液中，染色5-6h；然后用2×SSC缓冲液冲洗3-5次，再在每张载玻片上滴加体积比为2.5:500、浓度100μg/ml的DAPI母液和DAPI缓冲液的混合液，染色3-4min，之后用DAPI缓冲液冲洗5次，滴加防荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片，在荧光显微镜下照相。

2.根据权利要求1所述的花生染色体探针染色试剂盒的使用方法，其特征在于，所述试剂盒还包括品种对照核型。

3.根据权利要求1所述的花生染色体探针染色试剂盒的使用方法，其特征在于，所述2×SSC缓冲液由0.3M的柠檬酸三钠C₆H₅Na₃O₇·2H₂O和3M的NaCl组成。

4.根据权利要求1所述的花生染色体探针染色试剂盒的使用方法，其特征在于，所述DAPI缓冲液由0.1M柠檬酸和0.05M Na₂HPO₄组成。

5.根据权利要求1所述的花生染色体探针染色试剂盒的使用方法，其特征在于，所述染色缸为黑色避光的玻璃染色缸。

6.根据权利要求1所述的花生染色体探针染色试剂盒的使用方法，其特征在于，染色温度为35-37℃。

7.根据权利要求1所述的花生染色体探针染色试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(2)的染液在染色缸中。

Images