CN109694902A - 一种花生染色体探针染色试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种花生染色体探针染色试剂盒及其使用方法,该试剂盒包括Probe Mix干粉、浓度为100μg/ml DAPI母液、2×SSC缓冲液、DAPI缓冲液、染色缸和品种对照核型,其中Probe Mix干粉中的探针包括TAM荧光标记的DP‑1、DP‑7和FAM荧光标记DP‑5、DP‑8。本发明建立了花生探针染色技术,并开发了探针染色试剂盒,它是一种新型花生带型分析方法,与传统的分带技术和荧光原位杂交等分带技术相比,该技术方法简单、高效且成本更低,可有效用于花生物种识别和基因组分类等,并为下一步自动化分析鉴定花生染色体奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及花生细胞学研究领域,特别涉及一种花生染色体探针染色试剂盒及其使用方法。
背景技术
植物染色体工程技术,是利用细胞遗传学的方法,人为地、有目的、有计划地增、减、代换、易位同种或异种染色体、或染色体片段,从而创造符合人们需要的具有不同染色体结构的新植物。染色体工程育种在植物种质资源的创造、育种改良、遗传研究材料创制等方面发挥着重要作用。而构建植物染色体核型依赖于单条染色体的识别技术,但是,植物染色体鉴定技术的落后,限制了植物染色体的深入研究和染色体工程技术的发展。因此,需要发展细胞学鉴定方法,促进植物染色体结构和功能研究。
纵观染色体研究历程,染色体鉴定技术先后经历了染色体分带技术、以质粒DNA探针为主的荧光原位杂交技术(FISH)以及最新发展的单链寡核苷酸探针FISH等。三种技术相比,质粒DNA FISH比分带技术带型更稳定,更易于识别。单链寡核苷酸探针FISH技术比质粒DNA FISH技术,程序更为简单、方法更高效,成本更低。
花生是世界上重要的经济作物。简单、高效、低成本的染色体鉴定技术有利于花生品种或种质的批量鉴定。目前,寡核苷酸FISH技术已经成功在许多作物上应用,并大幅提升了染色体的鉴定效率。然而,寡核苷酸FISH技术依然包含较多的人为操作步骤,不利于自动化鉴定。
前人研究发现,寡核苷酸不仅可以进行变性FISH,还可以进行非变性FISH。迄今为止,小麦、黑麦、大麦和玉米都有寡核苷酸非变性FISH的报道。这主要是因为寡核苷酸可能具备直接侵入DNA双联的能力。我们研究发现,适当长度的寡核苷酸探针侵入能力更强,更稳定,并且可以在极低浓度侵入到染色体,产生信号,这为我们发展寡核苷酸探针染液提供一个很好的思路。
发明内容
本发明针对花生开发了一种比寡核苷酸FISH效率更高的探针染色技术,并设计了试剂盒。它可以高效的染色花生染色体,并且可以重复利用,有益于未来自动化分析鉴定花生染色体。
为了实现上述目的,本发明所采用的技术方案是:
一种花生染色体探针染色试剂盒,包括Probe Mix干粉、浓度为100μg/ml DAPI母液、2×SSC缓冲液、DAPI缓冲液、染色缸。
上述试剂盒还包括品种对照核型。
Probe Mix干粉中的探针包括TAM荧光标记的DP-1、DP-7和FAM荧光标记DP-5、DP-8,每种探针含量均为0.2OD,具体如下:
2×SSC缓冲液由0.3M的柠檬酸三钠C6H5Na3O7·2H2O和3M的NaCl组成。
DAPI缓冲液由0.1M柠檬酸和0.05M Na2HPO4组成。
染色缸为黑色避光的玻璃染色缸。
一种花生染色体探针染色试剂盒的使用方法,包括以下步骤:
(1)染液配制:用2×SSC缓冲液溶解Probe Mix干粉,其中探针DP-1、DP-5、DP-7和DP-8终浓度均为0.005OD/ml;
(2)将包含有花生染色体的载玻片置于染液中,染色5-6h;然后用2×SSC缓冲液冲洗3-5次,再在每张载玻片上滴加体积比为2.5:500、浓度100μg/ml的DAPI母液和DAPI缓冲液的混合液,染色3-4min,之后用DAPI缓冲液冲洗5次,滴加防荧光淬灭封片剂,盖上盖玻片,在荧光显微镜下照相。
染色温度为35-37℃。
步骤(2)的染液在染色缸中。
本发明有益效果:
本发明建立了花生探针染色技术,并开发了探针染色试剂盒,它是一种新型花生带型分析方法,与传统的分带技术和荧光原位杂交等分带技术相比,该技术方法简单、高效且成本更低,可有效用于花生物种识别和基因组分类等,并为下一步自动化分析鉴定花生染色体奠定基础。
附图说明
图1为利用本发明试剂盒对花生栽培种四粒红中期染色体染色结果(a)和核型图(b)。图1b中A、B分别代表花生的A和B基因组。
图2为利用本发明试剂盒对21个花生栽培种和30个花生野生种染色体染色获得的染色核型以及基因组分类情况。
图3为利用本发明试剂盒对经处理的花生根尖组织染色结果。图中a和b分别为两个不同的视野区域。图中a和b从左到右图片分别为DAPI染色,红色探针染色信号和DAPI染色与信号的合成图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1、花生染色体探针染色试剂盒
所述的试剂盒包括Probe Mix干粉、浓度为100μg/ml DAPI母液、2×SSC缓冲液、DAPI缓冲液、染色缸和品种对照核型。
其中Probe Mix干粉中的探针包括TAM荧光标记的探针DP-1、DP-7和FAM荧光标记的探针DP-5、DP-8,每种探针含量均为0.2OD,具体如下:
2×SSC缓冲液由0.3M的柠檬酸三钠C6H5Na3O7·2H2O和3M的NaCl组成。
DAPI缓冲液由0.1M柠檬酸和0.05M Na2HPO4组成。
染色缸为黑色避光的玻璃染色缸。
实施例2、花生染色体探针染色试剂盒的使用方法,包括以下步骤:
(1)染液配制:利用1ml 2×SSC缓冲液溶解Probe Mix干粉,倒入染色缸,并加入39ml2×SSC缓冲液,使DP-1、DP-5、DP-7和DP-8终浓度均为0.005OD/ml;
(2)将包含有花生染色体的载玻片(76×26×1mm)置于染色缸染液中,35-37℃染色6h;取出载玻片,用2×SSC缓冲液冲洗3次,然后在每张载玻片上滴加500μl体积比2.5:500的DAPI母液(100μg/ml)和DAPI缓冲液的混合液,染色3-4min,之后用DAPI缓冲液冲洗4-5次,滴加5μl防荧光淬灭封片剂,盖上盖玻片,在荧光显微镜下照相。
实施例3、花生栽培种四粒红染色体的染色
采用实施例2的方法,用同一染色缸染液对花生栽培种四粒红中期染色体进行染色,染色获得图片(图1a),并剪出每条染色体,排列出核型(图1b)。从图1中可以看出,利用试剂盒Probe Mix染液染色后,染色体存在明显的红绿特征信号,A基因组以红色信号为主,B基因组以绿色信号为主,根据颜色可明显区分花生的A和B基因组。此外花生各染色体带型差异不同,特征如下:A基因组中,1号染色体只有端部有微弱的信号,2号染色体着丝粒处有较弱的红和绿色信号,3号染色体着丝粒和短臂近着丝粒处有强的红和绿色信号,4号染色体着丝粒处有较强的红色信号且长臂端部绿色信号较强,5号染色体同时有强的着丝粒红色信号和且长臂中间绿色信号,6号染色体有弱的红色着丝粒信号,7号染色体有很强的短臂端部信号,8号染色体有较强的红色着丝粒信号,9号染色体着丝粒处有强的红色信号且是最小的染色体,10号染色体是易被拉伸成两段的随体染色体;B基因组中,1号、7号、8号和10号染色体只有弱的端粒信号,没有其它信号,但1号染色体最大,7号、8号和10号染色体较难区分,2号染色体有弱的绿色着丝粒信号,3号染色体着丝粒和短臂近着丝粒处有较强的红和绿色信号,4号染色体着丝粒处有强的绿色信号,5号染色体同时有非常强的着丝粒绿色信号,6号染色体有中等强度的绿色着丝粒信号,9号染色体着丝粒处有中等强度的绿色信号且它是B基因组最小的染色体。
实施例4、花生属物种染色体的染色验证
采用实施例2的方法,用同一染色缸染液对21个花生栽培种和30个花生野生种(表1)染色体染色,拍照,排列染色体核型,结果构建了这51个物种的核型图(图2)。从核型图可以看出A基因组信号以红色为主,且均包含9号“小染色体”,而B基因组以绿色为主,包含大面积绿色着丝粒信号的5号染色体;F基因组有着丝粒大面积绿色信号的5号染色体,但其它染色体以红色信号为主;E基因组和K基因组均包含短臂大面积绿色信号的9号明显不同于A、B和F基因组,但E基因组其它染色体信号以绿色为主,而K基因组以红色为主;H基因组信号很少,明显不同于A、B、F、E和K基因组。在花生各物种中,重复序列分布是相对稳定的,DP-1、DP-5、DP-7和DP-8均是利用重复序列设计的探针,因此用它们染色获得的染色核型图也是相对稳定的,表明可以以这个核型图为对照,有效区分栽培种和野生种基因组。
实施例5、花生根尖组织的染色
将花生根尖组织经酒精:醋酸的混合液(体积比3:1)处理后,然后放入包含有本发明染色液的缸染中,染色12h;然后用水冲洗5次,再将根尖放在载玻片上,滴加质量浓度45%的醋酸;盖上盖玻片压片,-80℃冰冻24h后,揭掉盖玻片,烘烤风干后,在每张载玻片上滴加体积比2.5:500的DAPI母液(100μg/ml)和DAPI缓冲液的混合液,染色3-4min,之后用DAPI缓冲液冲洗5次,滴加5μl防荧光淬灭封片剂,盖上盖玻片,在荧光显微镜下照相(图3)。可以看出,花生组织染色质上出现了明显的红色信号,表明该试剂盒可以有效对经过处理的植物死体进行染色。
表1对照核型所用品种的系谱号、来源和区组
序列表
<110> 河南省农业科学院
<120> 一种花生染色体探针染色试剂盒及其使用方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
tgcgatcata ccagcactaa tgcaccggat cccgtcagaa ctctgaagtt aagcgtg 57
<210> 2
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
tttagggttt agggtttagg gtttagggtt tagggtttag ggtttagggt ttaggg 56
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 31
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
tgaaaacttt ttatttttaa attttgaaac t 31
Claims (9)
1.一种花生染色体探针染色试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒包括Probe Mix干粉、浓度为100μg/ml DAPI母液、2×SSC缓冲液、DAPI缓冲液、染色缸。
2.根据权利要求1所述的花生染色体探针染色试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括品种对照核型。
3.根据权利要求1所述的花生染色体探针染色试剂盒,其特征在于,所述的Probe Mix干粉中的探针包括TAM荧光标记的DP-1、DP-7和FAM荧光标记DP-5、DP-8,每种探针含量均为0.2OD,具体如下:
4.根据权利要求1所述的花生染色体探针染色试剂盒,其特征在于,所述2×SSC缓冲液由0.3M的柠檬酸三钠C6H5Na3O7·2H2O和3M的NaCl组成。
5.根据权利要求1所述的花生染色体探针染色试剂盒,其特征在于,所述DAPI缓冲液由0.1M柠檬酸和0.05M Na2HPO4组成。
6.根据权利要求1所述的花生染色体探针染色试剂盒,其特征在于,所述染色缸为黑色避光的玻璃染色缸。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的花生染色体探针染色试剂盒的使用方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)染液配制:用2×SSC缓冲液溶解Probe Mix干粉,其中探针DP-1、DP-5、DP-7和DP-8终浓度均为0.005OD/ml;
(2)将包含有花生染色体的载玻片置于染液中,染色5-6h;然后用2×SSC缓冲液冲洗3-5次,再在每张载玻片上滴加体积比为2.5:500、浓度100μg/ml的DAPI母液和DAPI缓冲液的混合液,染色3-4min,之后用DAPI缓冲液冲洗5次,滴加防荧光淬灭封片剂,盖上盖玻片,在荧光显微镜下照相。
8.根据权利要求7所述的花生染色体探针染色试剂盒的使用方法,其特征在于,染色温度为35-37℃。
9.根据权利要求7所述的花生染色体探针染色试剂盒的使用方法,其特征在于,步骤(2)的染液在染色缸中。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112680442A (zh) * | 2021-02-03 | 2021-04-20 | 河南省农业科学院 | 一种花生野生种基因组特异探针和使用方法 |
CN112852947A (zh) * | 2021-02-03 | 2021-05-28 | 河南省农业科学院 | 一种人的染色体探针和荧光染色核型试剂盒的设计方法及应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106987590A (zh) * | 2017-05-25 | 2017-07-28 | 河南省农业科学院 | 一种花生寡核苷酸探针及其设计方法和使用方法 |
CN107130033A (zh) * | 2017-05-25 | 2017-09-05 | 河南省农业科学院 | 一种花生基因组染色体序列图与实际核型染色体序号对应的方法 |
CN107604088A (zh) * | 2017-09-22 | 2018-01-19 | 河南省农业科学院 | 一种花生a和b基因组间染色体易位系的创制及鉴定方法 |
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106987590A (zh) * | 2017-05-25 | 2017-07-28 | 河南省农业科学院 | 一种花生寡核苷酸探针及其设计方法和使用方法 |
CN107130033A (zh) * | 2017-05-25 | 2017-09-05 | 河南省农业科学院 | 一种花生基因组染色体序列图与实际核型染色体序号对应的方法 |
CN107604088A (zh) * | 2017-09-22 | 2018-01-19 | 河南省农业科学院 | 一种花生a和b基因组间染色体易位系的创制及鉴定方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
PEI DU等: "High-resolution chromosome painting with repetitive and single-copy oligonucleotides in Arachis species identifies structural rearrangements and genome differentiation", 《BMC PLANT BIOLOGY》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112680442A (zh) * | 2021-02-03 | 2021-04-20 | 河南省农业科学院 | 一种花生野生种基因组特异探针和使用方法 |
CN112852947A (zh) * | 2021-02-03 | 2021-05-28 | 河南省农业科学院 | 一种人的染色体探针和荧光染色核型试剂盒的设计方法及应用 |
CN112852947B (zh) * | 2021-02-03 | 2023-11-24 | 河南省农业科学院 | 一种人的染色体探针和荧光染色核型试剂盒的设计方法及应用 |
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