CN107604088A - 一种花生a和b基因组间染色体易位系的创制及鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种花生A和B基因组间染色体易位系的创制及鉴定方法，所述的创制方法是以花生栽培品种四粒红为材料，在盛花期使用Co60‑γ射线辐照花生植株，得到A和B基因组间染色体易位的花生植株。本发明采用花期Co60‑γ辐射诱导，产生了大量的A和B基因组染色体间易位，实现了A和B基因组间染色质交流，为花生育种与分子细胞遗传研究提供了新的资源材料，也为在远缘杂交后代材料中人工创造外源染色体(片段)渗入系提供了途径。本发明利用基因组荧光原位杂交技术鉴定花生A和B基因组间染色体易位系，首次创制并鉴定了一批花生栽培种A和B基因组染色体易位系新材料，为鉴定花生染色体易位提供了有效手段。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，涉及一种花生A和B基因组间染色体易位系的创制及鉴定方法。
背景技术
花生(Arachis hypogaea L.，2n＝4x＝40，AABB)是世界上重要的油料作物。在长期人工选择及驯化过程中，花生栽培种遗传多样性降低，育种亲本遗传基础日趋狭窄，严重影响了育种效率，创制新种质和挖掘新基因变得尤为重要。
花生栽培种是异源四倍体，是由二倍体野生种A.duranensis和A.经过偶然杂交，然后加倍形成四倍体野生花生A.monticola，又经过人工驯化最终演化而来。经过长期系统研究，花生学界普遍认为A.duranensis和A.是花生栽培种的二倍体祖先种，分别提供了花生栽培种的A和B基因组(Robledo G，Lavia GI，Seijo G.Speciesrelations among wild Arachis species with the A genome as revealed by FISHmapping of rDNA loci and heterochromatin detection[J].Theoretical&AppliedGenetics，2009，118(7)：1295～1307)，2016年，国际花生基因组计划公布了对A.duranensis和A.两个野生种基因组测序结果，发现其染色体序列与栽培种高度相似，支持了A.duranensis和A.分别是花生栽培种A和B基因组供体亲本的推断(Bertioli D J,Cannon S B,Froenicke L,et al.The genome sequences of Arachisduranensis and Arachis ipaensis,the diploid ancestors of cultivated peanut[J].Nature Genetics,2016,48(4):438.)。
花生常规育种通常是利用品种间有性杂交来实现，然而常规的杂交育种只能实现基因组内同源染色体之间的物质交换，且耗时较长，育种进程较慢。利用人工诱变可以显著提高染色体变异效率，扩大变异范围，达到改良某些性状、加速育种进程的目的。
目前，在植物染色体变异诱致方面，常用的方法有两种：(1)化学诱变：主要是利用EMS(甲基磺酸乙酯)和Zebularine等化学试剂浸渍、涂抹等方法诱发遗传物质的突变。EMS通常是通过与核苷酸中的磷酸、嘌呤和嘧啶等分子直接反应来诱发突变。Zebularine是一种新的诱变剂，具有降低基因组甲基化水平、激活沉默基因表达的效应，在小麦远缘杂交中能够诱导大量外源染色体系。(2)物理辐射：主要是利用60Co-γ射线、X射线、α射线等诱导染色体变异。60Co-γ对植株减数分裂期等敏感时期辐射，能够诱发高效产生易位染色体。例如：Zhuang等利用电离辐射获得涉及荆州黑麦2R染色体的50个变异体(Zhuang L,Liu P,Liu Z,et al.Multiple structural aberrations and physical mapping of ryechromosome 2R introgressed into wheat[J].Mol Breeding,2015,35:133.DOI10.1007/s11032-015-0333-2)。在花生辐射诱变方面，利用60Co-γ射线对花生种子进行辐射，其油酸含量、亚油酸含量、含油量等性状出现了明显变化，但尚未见到诱导出花生A、B基因组间染色体易位的报道，也缺少利用60Co-γ射线创制目的花生基因组染色体易位的研究。
本发明在以A.和A.duranensis全基因组DNA作探针通过荧光原位杂交区分花生A和B基因组染色体的基础上，拟利用60Co-γ辐射花生栽培种诱导其自身染色体变异，创制花生出A和B基因组间染色体易位系，建立一种A和B基因组间染色体易位系的创制和鉴定方法，为创制花生新种质，实现A和B基因组间染色体物质交流，提高花生染色体工程育种效率提供方法和技术。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种花生A和B基因组间染色体易位系的创制及鉴定方法，通过Co60-γ射线辐照花生栽培品种，以A.duranensis和A.基因组DNA为探针与突变体进行荧光原位杂交，从而获得并鉴定出一批花生A和B基因组间染色体单易位、双易位和中间插入易位突变系，为花生育种创制新材料。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种花生A和B基因组间染色体易位系的创制方法，以花生栽培品种四粒红为材料，在盛花期使用Co60-γ射线辐照花生植株，得到A和B基因组间染色体易位的花生植株。
所述的创制方法具体如下：
(1)将花生栽培品种“四粒红”种植于花盆中，从植株开花第一天开始，每天早晨将开放花朵从花柄基部掐掉，以控制花朵结实；待花生植株进入盛花期，采用Co60-γ射线对整个花生植株进行辐照处理，辐照后，将花生植株放置于隔离环境中，让其自交，在花生植株成熟时收获荚果；
(2)将收获的荚果清洗干净后使用体积分数75％的乙醇和质量分数0.1％的HgCl2分别消毒30s和10min，在无菌条件下解刨开荚果，取出花生种子接种到含有浓度为0.075mg/L IAA、0.01mg/L Kn和质量分数5％蔗糖的MS固体培养基上，在25℃恒温光照培养间培养15d，直至发育成完整的花生植株。
所述的盛花期为开花量为总花量的50％。
在Co60-γ射线辐照花生植株的前一天，停止掐花。
所述的辐照时间为上午9点，辐照剂量为1600rad，辐射速率为224rad/min。
花生A和B基因组间染色体易位系的鉴定方法，鉴定方法具体如下：
(1)分别提取花生栽培种A、B基因组供体祖先种A.duranensis和A.全基因组DNA，并通过缺刻平移法对A.duranensis全基因组DNA进行荧光素标记，得到荧光素标记A.duranensis DNA探针；对A.全基因组DNA进行地高辛标记，得到地高辛标记的A.DNA探针；
(2)取完整花生植株的组织培养苗根尖，进行有丝分裂中期染色体制片，然后利用A.duranensis和A.DNA探针对制片进行基因组荧光原位杂交，杂交完成后用DAPI染液对杂交后的载玻片染色4min，所述的DAPI染液为100μg/mL DPAI原液2.5μL+DAPI缓冲液500μL；染色后用DAPI缓冲液洗，吹干，滴6-7μL VECTA shield mounting胶，盖上盖玻片，再通过荧光显微镜照相观察，并进行图片分析处理，统计发生A、B基因组间染色体易位的染色体、易位类型及易位染色体数量。
所述的缺刻平移法荧光标记的具体方法为：
荧光素标记A.duranensis DNA探针：先在0.2mL eppendorf管中配置反应液，依次加入800ng/μL A.duranensis DNA 3μL、10×DNA Polymerase I Buffer 2.5μL、1.3mMdNTP mix 2.5μL、5U/μL DNaseI 0.5μL、1mM Fluoresceint-12-dUTP 0.7μL、5U/μL DNAPolymerase I 1μL、14.8μL ddH2O，将反应液混合均匀，在16℃温浴25min，再加入0.5M的EDTA 2.5μL终止反应，放入-20℃冰箱备用；
地高辛标记的A.DNA探针：先在0.2mL eppendorf管中配置反应液，依次加入800ng/μL A.DNA 3μL、10×DNA Polymerase I Buffer 2.5μL、1.3mM dNTP mix2.5μL、5U/μL DNaseI 0.5μL、1mM Digoxigenin-11-dUTP 0.7μL、5U/μL DNA Polymerase I1μL、14.8μL ddH2O，将反应液混合均匀，在16℃温浴25min，再加入0.5M的EDTA 2.5μL终止反应，放入-20℃冰箱备用。
所述的基因组荧光原位杂交的具体方法如下：
(1)先在1.5mL eppendorf管中配制杂交液，依次加入7.5μL去离子甲酰胺、1.5μL20×SSC缓冲液、2.5μL荧光素标记A.duranensis DNA探针、2.5μL地高辛标记A.DNA探针、0.5μL鲑鱼精DNA、2μL质量分数50％硫酸葡聚糖溶液，将杂交液混合均匀，放于105℃的加热板块上，变性13min，取出后立刻将离心管放到-20℃无水乙醇中，冷却10min以上；
(2)有丝分裂中期染色体制片经-70℃冰冻揭片后，在无水乙醇中脱水6h后，放置在体积分数70％的甲酰胺溶液中，78℃变性70s，再在-20℃条件下用体积分数70％、95％、100％酒精梯度脱水各5min，吹干载玻片备用；
(3)将步骤(1)的杂交液滴到步骤(2)的载玻片上，盖上盖玻片，于37℃杂交12h；
(4)将步骤(3)的制片揭去盖玻片，然后在50℃条件下依次用2×SSC缓冲液浸泡10min、体积分数50％的甲酰胺溶液浸泡10min、2×SSC缓冲液浸泡10min，然后在室温下用1×TNT缓冲液浸泡5min；将载玻片吹干，加上抗地高辛1μL和1×TNB缓冲液50μL的混合液，盖上盖玻片，放入暗盒中37℃室温培养40min后揭片，用1×TNT缓冲液室温洗涤载玻片3次，每次5min，最后将载玻片吹干。
所述的20×SSC缓冲液中包括0.3M的柠檬酸三钠C6H5Na3O7·2 H2O和3M的NaCl。
所述的1×TNT缓冲液中包括0.1M的Tris-HCl、0.15M的NaCl和质量分数0.05％的Tween-20。
所述的1×TNB缓冲液中包括0.5M的Tris-HCl、0.15M的NaCl和0.5％的BlockingReagent。
所述的DAPI缓冲液中包括0.1M柠檬酸和0.05M Na2HPO4。
一种所述的创制方法在培育花生及其它异源多倍体植物上的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明公开了一种采用诱导创制花生A和B基因组间染色体易位系的新方法，该方法采用花期Co60-γ辐射诱导，产生了大量的A和B基因组染色体间易位，实现了A和B基因组间染色质交流，为花生育种与分子细胞遗传研究提供了新的资源材料，也为在远缘杂交后代材料中人工创造外源染色体(片段)渗入系提供了途径。
(2)本发明公开了一种利用基因组荧光原位杂交技术鉴定花生A和B基因组间染色体易位系的新方法，首次创制并鉴定了一批花生栽培种A和B基因组染色体易位系新材料，为鉴定花生染色体易位提供了有效手段。
附图说明
图1：花生突变体染色体易位的GISH分析。红色为Digoxigenin-11-dUTP标记的A.基因组探针在B组染色体上的信号，绿色表示Fluoresceint-12-dUTP标记的A.duranensis基因组探针在A组染色体上的信号，箭头所示为A与B基因组间易位染色体。
其中a为对照材料，b为材料162-30-2，c为材料162-21-1，d为材料162-12-1，e为材料162-5-2，f为材料162-1-1。
可以明显看出图1a中对照材料包含20条A组染色体和20条B组染色体，没有易位；图1b中材料162-30-2包含一条染色体插入易位；图1c中材料162-21-1包含一条染色体易位；图1d中材料162-12-1包含一条染色体易位；图1e中材料162-5-2包含两条染色体易位；图1f中材料162-1-1包含两条染色体易位。
图2：染色体变异系荧光原位杂交核型图。
可以明显看出本发明获得了一批花生A与B基因组间染色体易位系。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规方法，或按照制造厂商所建议的条件与实施步骤。
本发明所用部分试剂如下：
20×SSC缓冲液中包括0.3M的柠檬酸三钠C6H5Na3O7·2H2O和3M的NaCl。
1×TNT缓冲液中包括0.1M的Tris-HCl、0.15M的NaCl和质量分数0.05％的Tween-20。
1×TNB缓冲液中包括0.5M的Tris-HCl、0.15M的NaCl和0.5％的BlockingReagent。
DAPI缓冲液中包括0.1M柠檬酸和0.05M Na2HPO4。
实施例1、花生A和B基因组间染色体易位系的创制方法
实验材料：花生栽培品种“四粒红”(异源四倍体2n＝4x＝40)，由河南省农业科学院经济作物研究所保存。
实验材料种植于花盆中，利用Co60-γ射线辐射并通过基因组荧光原位杂交进行鉴定，获得A与B基因组间染色体易位系。具体方法如下：
(1)将花生栽培品种“四粒红”种植于花盆中，从植株开花第一天开始，每天早晨将新开放的花朵从花柄基部掐掉，以控制花朵结实；待花生植株进入盛花期(开花量为总花量的50％)，采用Co60-γ射线对整个花生植株进行辐照处理，在Co60-γ射线(河南省科学院同位素研究所有限公司)辐照花生植株的前一天，停止掐花；辐照后，将花生植株放置于隔离环境中，让其自交，在花生植株成熟时收获荚果；所述的辐照时间为上午9点，辐照剂量为1600rad，辐射速率为224rad/min。
(2)将收获的荚果清洗干净后使用体积分数75％的乙醇和质量分数0.1％的HgCl2分别消毒30s和10min，在无菌条件下解刨开荚果，取出花生种子接种到含有浓度为0.075mg/L IAA(吲哚-3-乙酸)、0.01mg/L Kn(激动素)和质量分数5％蔗糖的MS固体培养基(MS+0.075mg/L IAA+0.01mg/L Kn+5％蔗糖)上，在25℃恒温光照培养间培养，直至发育成完整的花生植株。
实施例2、花生A和B基因组间染色体易位系的鉴定方法
花生A和B基因组间染色体易位系的鉴定方法，具体为：
(1)探针标记：分别提取花生栽培种A、B基因组供体祖先种A.duranensis和A.全基因组DNA，并通过缺刻平移法对A.duranensis全基因组DNA进行荧光素标记，得到荧光素标记A.duranensis DNA探针；对A.全基因组DNA进行地高辛标记，得到地高辛标记的A.DNA探针；具体方法为：
荧光素标记A.duranensis DNA探针：先在0.2mL eppendorf管中配置反应液，依次加入800ng/μL A.duranensis DNA 3μL、10×DNA Polymerase I Buffer 2.5μL、1.3mMdNTP mix 2.5μL、5U/μL DNaseI 0.5μL、1mM Fluoresceint-12-dUTP 0.7μL、5U/μL DNAPolymerase I 1μL、14.8μL ddH2O，将反应液混合均匀，在16℃温浴25min，再加入0.5M的EDTA 2.5μL终止反应，放入-20℃冰箱备用；
地高辛标记的A.DNA探针：先在0.2mL eppendorf管中配置反应液，依次加入800ng/μL A.DNA 3μL、10×DNA Polymerase I Buffer 2.5μL、1.3mM dNTP mix2.5μL、5U/μL DNaseI 0.5μL、1mM Digoxigenin-11-dUTP 0.7μL、5U/μL DNA Polymerase I1μL、14.8μL ddH2O，将反应液混合均匀，在16℃温浴25min，再加入0.5M的EDTA 2.5μL终止反应，放入-20℃冰箱备用。
(2)制片：剪取实施例1培养基内完整花生植株长10-15mm，粗0.8-1.2mm的新鲜侧根，用蒸馏水清洗干净，放入8-羟基喹啉溶液(0.002mol/L)中进行预处理3-4h，然后将其转入卡诺氏固定液中(无水乙醇∶冰醋酸体积比3∶1)，室温处理12-24h，放入-20℃冰箱待用。48h后用质量分数45％醋酸制片，使用相差显微镜进行染色体观察，备用。
(3)制片变性与杂交：利用A.duranensis和A.DNA探针对步骤(2)的制片进行基因组荧光原位杂交，具体方法为：
(a)先在1.5mL eppendorf管中配制杂交液，依次加入7.5μL去离子甲酰胺、1.5μL20×SSC缓冲液、2.5μL荧光素标记A.duranensis DNA探针、2.5μL地高辛标记A.DNA探针、0.5μL鲑鱼精DNA(10mg/ml，Sigma)、2μL质量分数50％硫酸葡聚糖溶液，将杂交液混合均匀，放于105℃的加热板块上，变性13min，取出后立刻将离心管放到-20℃无水乙醇中，冷却10min以上；
(b)将步骤(a)的制片经-70℃冰冻揭片后，在无水乙醇中脱水6h后，放置在体积分数70％的甲酰胺溶液中，78℃变性70s，再在-20℃条件下用体积分数70％、95％、100％酒精梯度脱水各5min，吹干载玻片备用；
(c)将步骤(a)的杂交液滴到步骤(b)的载玻片上，盖上盖玻片，于37℃杂交12h；
(d)将步骤(c)的制片揭去盖玻片，然后在50℃条件下依次用2×SSC缓冲液浸泡10min、体积分数50％的甲酰胺溶液浸泡10min、2×SSC缓冲液浸泡10min，然后在室温下用1×TNT缓冲液浸泡5min；将载玻片吹干，加上抗地高辛(Anti-Digoxigenin-Rhodamine，Roche，货号：11207750910)1μL和1×TNB缓冲液50μL的混合液，盖上盖玻片，放入暗盒中37℃室温培养40min后揭片，用1×TNT缓冲液室温洗涤载玻片3次，每次5min，最后将载玻片吹干。
(e)染色与镜检：杂交完成后，用DAPI染液(100μg/mL DPAI原液2.5μL+DAPI缓冲液500μL)对载玻片染色4min，染色后用DAPI缓冲液洗，吹干，滴6-7μL VECTA shieldmounting胶，盖上盖玻片，再通过Leica DM6000荧光显微镜照相观察，通过Photoshop软件进行图片分析处理，统计发生A、B基因组间染色体易位的染色体、易位类型及易位染色体数量。
(f)染色体变异分析：对采用实施例1的方法创制的多个花生植株进行染色体变异分析，每一颗植株至少观察3个及以上细胞，且每一个细胞均包含相同的染色体易位才可以确定其为发生了A、B基因组间染色体易位。研究一共鉴定28棵花生植株，结果表明，28棵花生植株中有8个易位材料(如图1所示)，分别命名为：162-8-3、162-12-1、162-21-1、162-7-4、162-25、162-5-2、162-1-1、162-30-2，占比28.6％，其中单易位5粒，双易位为2粒，中间插入1粒(见图2)。
结果表明，本发明通过Co60-γ辐射成功创制出A、B基因组间染色体易位，并利用荧光原位杂交技术进行了鉴定，为花生育种与遗传研究创制新的材料。
以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种花生A和B基因组间染色体易位系的创制方法，其特征在于，以花生栽培品种四粒红为材料，在盛花期使用Co60-γ射线辐照花生植株，得到A和B基因组间染色体易位的花生植株。
2.根据权利要求1所述的花生A和B基因组间染色体易位系的创制方法，其特征在于，所述的创制方法具体如下：
(1)将花生栽培品种“四粒红”种植于花盆中，从植株开花第一天开始，每天早晨将开放花朵从花柄基部掐掉，以控制花朵结实；待花生植株进入盛花期，采用Co60-γ射线对整个花生植株进行辐照处理，辐照后，将花生植株放置于隔离环境中，让其自交，在花生植株成熟时收获荚果；
(2)将收获的荚果清洗干净后使用体积分数75％的乙醇和质量分数0.1％的HgCl2分别消毒30s和10min，在无菌条件下解刨开荚果，取出花生种子接种到含有浓度为0.075mg/LIAA、0.01mg/L Kn和质量分数5％蔗糖的MS固体培养基上，在25℃恒温光照培养间培养，直至发育成完整的花生植株。
3.根据权利要求2所述的花生A和B基因组间染色体易位系的创制方法，其特征在于，所述的盛花期为开花量为总花量的50％。
4.根据权利要求2所述的花生A和B基因组间染色体易位系的创制方法，其特征在于，在Co60-γ射线辐照花生植株的前一天，停止掐花。
5.根据权利要求2-4任一项所述的花生A和B基因组间染色体易位系的创制方法，其特征在于，所述的辐照时间为上午9点，辐照剂量为1600rad，辐射速率为224rad/min。
6.花生A和B基因组间染色体易位系的鉴定方法，其特征在于，所述的鉴定方法具体如下：
(1)分别提取花生栽培种A、B基因组供体祖先种A.duranensis和A.全基因组DNA，并通过缺刻平移法对A.duranensis全基因组DNA进行荧光素标记，得到荧光素标记A.duranensis DNA探针；对A.全基因组DNA进行地高辛标记，得到地高辛标记的A.DNA探针；
(2)取完整花生植株的组织培养苗根尖，进行有丝分裂中期染色体制片，然后利用A.duranensis和A.DNA探针对制片进行基因组荧光原位杂交，杂交完成后用DAPI染液对杂交后的载玻片染色4min，所述的DAPI染液为100μg/mL DPAI原液2.5μL+DAPI缓冲液500μL；染色后用DAPI缓冲液洗，吹干，滴6-7μL VECTA shield mounting胶，盖上盖玻片，再通过荧光显微镜照相观察，并进行图片分析处理，统计发生A、B基因组间染色体易位的染色体、易位类型及易位染色体数量。
7.根据权利要求6所述的花生A和B基因组间染色体易位系的鉴定方法，其特征在于，所述的缺刻平移法荧光标记的具体方法为：
荧光素标记A.duranensis DNA探针：先在0.2mL eppendorf管中配置反应液，依次加入800ng/μL A.duranensis DNA 3μL、10×DNA Polymerase I Buffer 2.5μL、1.3mM dNTPmix 2.5μL、5U/μL DNaseI 0.5μL、1mM Fluoresceint-12-dUTP 0.7μL、5U/μL DNAPolymerase I 1μL、14.8μL ddH2O，将反应液混合均匀，在16℃温浴25min，再加入0.5M的EDTA 2.5μL终止反应，放入-20℃冰箱备用；
地高辛标记的A. DNA探针：先在0.2mL eppendorf管中配置反应液，依次加入800ng/μL A. DNA 3μL、10×DNA Polymerase I Buffer 2.5μL、1.3mM dNTP mix2.5μL、5U/μL DNaseI 0.5μL、1mM Digoxigenin-11-dUTP 0.7μL、5U/μL DNA Polymerase I1μL、14.8μL ddH2O，将反应液混合均匀，在16℃温浴25min，再加入0.5M的EDTA 2.5μL终止反应，放入-20℃冰箱备用。
8.根据权利要求6所述的花生A和B基因组间染色体易位系的鉴定方法，其特征在于，所述的基因组荧光原位杂交的具体方法如下：
(1)先在1.5mL eppendorf管中配制杂交液，依次加入7.5μL去离子甲酰胺、1.5μL 20×SSC缓冲液、2.5μL荧光素标记A.duranensis DNA探针、2.5μL地高辛标记A.DNA探针、0.5μL鲑鱼精DNA、2μL质量分数50％硫酸葡聚糖溶液，将杂交液混合均匀，放于105℃的加热板块上，变性13min，取出后立刻将离心管放到-20℃无水乙醇中，冷却10min以上；
(2)有丝分裂中期染色体制片经-70℃冰冻揭片后，在无水乙醇中脱水6h后，放置在体积分数70％的甲酰胺溶液中，78℃变性70s，再在-20℃条件下用体积分数70％、95％、100％酒精梯度脱水各5min，吹干载玻片备用；
(3)将步骤(1)的杂交液滴到步骤(2)的载玻片上，盖上盖玻片，于37℃杂交12h；
(4)将步骤(3)的制片揭去盖玻片，然后在50℃条件下依次用2×SSC缓冲液浸泡10min、体积分数50％的甲酰胺溶液浸泡10min、2×SSC缓冲液浸泡10min，然后在室温下用1×TNT缓冲液浸泡5min；将载玻片吹干，加上抗地高辛1μL和1×TNB缓冲液50μL的混合液，盖上盖玻片，放入暗盒中37℃室温培养40min后揭片，用1×TNT缓冲液室温洗涤载玻片3次，每次5min，最后将载玻片吹干。
9.根据权利要求8所述的花生A和B基因组间染色体易位系的鉴定方法，其特征在于，
所述的20×SSC缓冲液中包括0.3M的柠檬酸三钠C6H5Na3O7·2H2O和3M的NaCl；
所述的1×TNT缓冲液中包括0.1M的Tris-HCl、0.15M的NaCl和质量分数0.05％的Tween-20；
所述的1×TNB缓冲液中包括0.5M的Tris-HCl、0.15M的NaCl和0.5％的BlockingReagent；
所述的DAPI缓冲液中包括0.1M柠檬酸和0.05M Na2HPO4。
10.一种如权利要求1所述的创制方法在培育花生及其它异源多倍体植物上的应用。
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Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN108760706A (zh) * | 2018-06-08 | 2018-11-06 | 农业部环境保护科研监测所 | 一种快速筛选镉低积累水稻品种的方法 |
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009053039A1 (en) * | 2007-10-23 | 2009-04-30 | Roche Diagnostics Gmbh | Methods and systems for solution based sequence enrichment and analysis of genomic regions |
| CN103798132A (zh) * | 2014-02-19 | 2014-05-21 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种规模化创制小麦异源易位系的方法 |
| CN104004849A (zh) * | 2014-06-09 | 2014-08-27 | 南京农业大学 | 利用基因组原位杂交快速构建黄瓜中期染色体核型方法 |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009053039A1 (en) * | 2007-10-23 | 2009-04-30 | Roche Diagnostics Gmbh | Methods and systems for solution based sequence enrichment and analysis of genomic regions |
| CN103798132A (zh) * | 2014-02-19 | 2014-05-21 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种规模化创制小麦异源易位系的方法 |
| CN104004849A (zh) * | 2014-06-09 | 2014-08-27 | 南京农业大学 | 利用基因组原位杂交快速构建黄瓜中期染色体核型方法 |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108760706A (zh) * | 2018-06-08 | 2018-11-06 | 农业部环境保护科研监测所 | 一种快速筛选镉低积累水稻品种的方法 |
| CN108760706B (zh) * | 2018-06-08 | 2021-08-06 | 农业部环境保护科研监测所 | 一种快速筛选镉低积累水稻品种的方法 |
| CN109694902A (zh) * | 2019-01-28 | 2019-04-30 | 河南省农业科学院 | 一种花生染色体探针染色试剂盒及其使用方法 |
| CN109694902B (zh) * | 2019-01-28 | 2022-04-12 | 河南省农业科学院 | 一种花生染色体探针染色试剂盒及其使用方法 |
| CN113430192A (zh) * | 2020-07-05 | 2021-09-24 | 东北林业大学 | 一种水曲柳悬浮细胞诱变方法 |
| CN112708623A (zh) * | 2021-02-03 | 2021-04-27 | 河南省农业科学院 | 一种高效涂染花生a、b亚基因组的探针套、设计方法及应用 |
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