CN104004849A - 利用基因组原位杂交快速构建黄瓜中期染色体核型方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用黄瓜基因组原位杂交技术快速构建黄瓜中期染色体核型的方法，它是通过提取黄瓜基因组DNA，并将其标备探针。取黄瓜根尖进行酶解，火焰干燥法制片，获得分散度良好的中期染色体制片。将基因组DNA探针变性后杂交到变性的中期染色体制片上，利用高严谨度的杂交条件，使得染色体串联重复序列产生清晰可辨的荧光信号，从而构建黄瓜的中期染色体核型。本发明利用黄瓜基因组DNA作为探针，通过一次GISH快速构建黄瓜中期染色体核型，提高了试验效率。通过此方法，基于黄瓜基因组DNA探针在每条染色体上信号分布模式的不同，可快速构建出黄瓜中期染色体核型，为物种的核型分析研究提供了新的方法与参考。

Description

利用基因组原位杂交快速构建黄瓜中期染色体核型方法

一、技术领域

本发明公开了利用黄瓜自身基因组原位杂交技术快速构建黄瓜有丝分裂中期染色体核型的方法，有利于开展黄瓜及其它物种的核型分析研究，属于植物生物技术领域。

二、技术背景

黄瓜(Cucumis sativus L.，2n＝2x＝14)是世界上最重要的蔬菜作物之一。黄瓜具有一些特殊的性状，如性别表型多样化、线粒体的父性遗传性等；同时黄瓜的基因组相对较小(约370Mb)，染色体数目少，仅为14条，使得黄瓜成为近年来分子细胞遗传学研究的模式物种之一。然而黄瓜中期染色体小，染色能力弱，且染色体间形态很相似，对其分子细胞遗传学的研究虽然已有几十年之久，但对其核型分析或染色体的识别往往需要借助多种复杂的方法。

核型是指染色体组在有丝分裂中期的表型。包括染色体的数目、大小和形态的总和。染色体核型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间关系所不可缺少的重要手段。不同物种的染色体都有各自特定的形态结构(包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等)特征，而且这种形态特征是相对稳定的。核型分析可以为细胞遗传分类、物种间亲缘的关系、以及染色体数目和结构变异的研究提供重要依据。因此，在细胞遗传研究领域中具有重要意义。

荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)技术的发展及应用，为准确鉴定植物染色体提供了有效的方法。Koo等(2005)利用随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphicDNAs，RAPDs)标记产物为探针的FISH研究，并结合C带分析，准确识别出了每条黄瓜染色体。不久，Han等(2008)利用多种卫星DNA，结合45S rDNA、5S rDNA在黄瓜染色体上分布的不同，对黄瓜有丝分裂中期的染色体核型进行了分析，并建立了核型模式图。Zhao等(2011)利用多个重复序列探针及多个Fosmid克隆分别对黄瓜中期染色体进行了区分，并建立了FISH核型模式图。最近，Lou等(2014)利用黄瓜单拷贝基因为探针与45S rDNA相结合，识别出了每条黄瓜中期染色体。以上这些研究对于染色体的鉴定与识别，均需要制备多种不同类型的探针。前人的研究中，主要集中于利用C-分带、染色体特异的克隆以及多种串联重复序列等对黄瓜染色体核型进行分析，技术较为繁琐。高等植物核基因组含有大量重复序列，如玉米基因组中含85％以上的重复序列。经调查，黄瓜基因组中含有～20％-30％的卫星DNA，而这些卫星DNA中，90％以上都是串联重复序列(TypeI，II，III，IV)。前人利用多个串联重复序列(Type I，II，III，IV，45S rDNA等)探针组合的FISH杂交，根据不同探针在黄瓜染色体上信号分布及信号强度的不同，采用多次重复杂交的方法，对黄瓜有丝分裂中期染色体进行了准确的识别分析，然而，该方法同样需要制备各种不类型的探针，技术流程较为繁琐。基因组原位杂交能有效地反应基因组中的重复序列分布特征，黄瓜基因组中的重复序列多为串联重复序列，且在不同染色体上存在明显特征性的分布模式，这为利用基于基因组原位杂交进行核型的构建提供了可能。

目前，利用自身基因组荧光原位杂交分析，分析黄瓜基因组重复序列的分布特征，从而构建黄瓜有丝分裂中期染色体核型的研究尚未见报道。我们利用黄瓜基因组DNA直接作为探针与黄瓜有丝分裂中期染色体进行杂交，可以直接揭示DNA序列沿染色体的分布模式。根据杂交信号在每条染色体上分布位置及信号强度的不同，成功对黄瓜有丝分裂中期的染色体核型进行了分析。

三、发明内容

技术问题

本发明利用自身基因组原位杂交快速构建黄瓜中期染色体核型方法的目的，是针对以往黄瓜有丝分裂中期染色体核型构建方法的繁琐等不足，发明了一种仅通过黄瓜自身基因组作探针的一次基因组原位杂交(genomic in situ hybridization，GISH)即可快速构建出黄瓜中期染色体核型的方法，加快了黄瓜的细胞遗传学研究进展，并为其他物种的核型分析提供了新的方法与思路。

技术方案

本发明所提供的利用自身基因组原位杂交快速构建黄瓜中期染色体核型，其特征在于：仅通过一次GISH试验即可对黄瓜有丝分裂中期染色体进行准确的识别。

上述利用自身基因组原位杂交能够快速构建黄瓜中期染色体核型，是通过以下方法获得的：

取黄瓜植株或萌发的种子根尖，于0.002M的8-羟基喹啉溶液中25℃预处理3h，以富集中期分裂细胞，再放入体积比为3∶1的E∶G(乙醇∶冰醋酸)固定液中固定至少24小时，备用。

取出固定好的根尖，利用4％纤维素酶和2％果胶酶混合溶液，于37℃酶解根尖约1h，后将酶解好的根尖固定于上述固定液中，然后用烧片法制片，镜检，备用。

取黄瓜幼嫩叶片，用CTAB法提取黄瓜基因组DNA，然后采用缺刻平移法标探针，具体根据探针标记试剂盒说明，用Digoxigenin-11-dUTP(购自Roche公司)将黄瓜基因组DNA标上探针，备用。

通过GISH，将20μL杂交混合液(含有50ng标记好的基因组DNA探针、50％去离子甲酰胺，2×SSC，10％硫酸葡聚糖)杂交到黄瓜有丝分裂中期染色体上，经过37℃杂交过夜、2×SSC洗片。加上带有荧光基团的抗Digoxigenin抗体进行信号的放大，于37℃反应1h，利用高严谨度条件洗片后，加入DAPI进行染色体的复染。

利用荧光显微镜观察染色体的信号特征，根据每条染色体的信号分布模式，即可构建出中期染色体核型。

有益效果

本发明与现有技术相比，具有如下优点和积极效果：

1)利用黄瓜基因组探针仅通过一次GISH即可通过每条染色体上信号分布模式的不同准确地识别每条黄瓜染色体(图1)，与现有技术相比，充分提高了试验效率。

2)现有的技术在构建黄瓜核型时，主要利用染色体特异的探针或多种串联重复序列进行多次重复FISH定位，这需要获取多个探针，以及进行载玻片的重复利用及信号的去除，程序相对繁琐。同时在重复FISH定位时，对探针的要求相对较高。而使用现在的方法可以直接进行核型的构建，适合于尚未进行测序的绝大多数物种的核型分析。

3)在材料准备方面，制作分散度高的片子，这样可以使杂交上去的探针信号更加清晰，更容易区分每条染色体，加快了实验进程。

4)提取高浓度的黄瓜基因组DNA，将有利于提高探针的浓度，使得目标探针信号在染色体上清晰可辨。

四、附图说明

图1：黄瓜基因组DNA探针在黄瓜中期染色体上的定位，颜色较深(黑色)为杂交信号，基因组DNA的信号清晰，每条染色体的信号都有明显区别。

图2：基于黄瓜基因组DNA探针在每条黄瓜染色体上分布模式的不同，快速构建出了黄瓜中期染色体核型。A：1到7号染色体的排列；B：1到7号染色体上基因组原位杂交信号的特征；C：染色体与杂交信号合并图。

图3：根据染色体的大小及着丝粒的位置确定了探针在每条染色体上的位置及分布范围，画出了黄瓜核型模式图，每条染色体的系统命名参考Zhao等(2011)的命名。

五、具体实施方式

本发明黄瓜基因组原位杂交快速构建黄瓜中期染色体核型方法的实施程序包括：

(1)基因组DNA的提取：取黄瓜幼嫩叶片，采用CTAB法提取黄瓜基因组DNA，具体方法参照Murray等(1980)的方法。提取高浓度的黄瓜基因组DNA备用。

(2)探针的制备：基因组DNA探针的标记采用缺刻平移法。根据探针标记试剂盒说明，用Digoxigenin-11-dUTP(购自Roche公司)将黄瓜基因组DNA标上探针，备用。

(3)材料准备：在黄瓜植株上或萌发的种子上取适当的根尖，于0.002M的8-羟基喹啉溶液中25℃预处理3h，以富集中期分裂细胞，再放入体积比为3∶1的E∶G(乙醇∶冰醋酸)固定液中固定至少24小时，超过一周的话可将根尖和花蕾换到70％的乙醇中。

(4)酶解根尖：利用4％纤维素酶和2％果胶酶混合溶液，于37℃酶解根尖约1h，后将酶解好的根尖固定于上述固定液中备用。

(5)制片：取出酶解好的其中一个根尖，放在干净的载玻片上用镊子敲碎，再加上100μL的固定液，在酒精灯上烧片干燥制片。

(6)探针的杂交：杂交液总体系为20μL，将探针杂交液(含有50ng标记好的基因组DNA探针、50％去离子甲酰胺，2×SSC，10％硫酸葡聚糖)于90℃变性6min，冰浴10min；载玻片于80℃的70％去离子甲酰胺中变性1min30s，以70％、90％、100％系列冰乙醇脱水各5min，晾干，将变性的探针杂交液滴于变性后的玻片上，封片，置杂交盒37℃杂交过夜。

(7)信号的放大：将杂交后的片子放入2×SSC溶液中浸泡至封片脱落，放入2×SSC中，摇床震荡洗涤10min，转入42℃的2×SSC中洗涤15min，再放入2×SSC中洗涤10min，1×TNT洗涤10min，取出后直接滴加罗丹明偶联的抗地高辛抗体(购自Roche公司)，于37℃温育1h，使信号放大。

(8)信号的检测：在室温风干的制片上加入含有抗荧光淬灭剂的DAPI，盖玻片封片后，染色体制片在避光的条件下，用Olympus BX60荧光显微镜观察杂交信号。

(9)核型的构建：用Photometrics SenSys CCD(charge coupled device)1400E照相装置和Metamorph 4.6.3(Universal Imaging Crop)软件获取图像，Adobe Photoshop CS6软件进行染色体的排列，进而构建出黄瓜中期染色体核型，并根据染色体的大小及着丝粒的位置确定探针在每条染色体上的位置及分布范围。

参考文献：

Koo DH，Choi HW，Cho J，et al.，A high-resolution karyotype of cucumber(Cucumis sativus L.‘Winter Long’)revealedby C-banding，pachytene analysis，and RAPD-aided fluorescence in situ hybridization[J].Genome，2005，48：534-540.

Han YH，Zhang ZH，Liu JH，et al.，Distribution of the tandem repeat sequences and karyotyping in cucumber(Cucumissativus L.)by fluorescence in situ hybridization[J].Cytogenet Genome Res，2008，122：80-88.

Zhao X，Lu JY，Zhang ZH，et al.，Comparison of the distribution of the repetitive DNA sequences in three variants ofCucumis sativus reveals their phylogenetic relationships[J].Journal of Genetics and Genomics，2011，38(1)：39-45.

Lou QF，Zhang YX，He YH，et al.，Single copy gene-based chromosome painting in cucumber and its application forchromosome rearrangement analysis in Cucumis[J].The Plant Journal，2014，DOI：10.1111/tpj.12453.

Murray HG，Thompson WF，Rapid isolation of higher weight DNA[J].Nucl.Acids Res，1980，8：4321-4326.

Claims (3)

1.利用黄瓜基因组原位杂交快速构建黄瓜中期染色体核型方法，其特征在于：

利用黄瓜基因组DNA作为探针，仅通过一次基因组原位杂交(GISH)试验即可对黄瓜有丝分裂中期染色体进行准确地鉴定。

2.根据权利要求1所述的利用黄瓜基因组DNA作为探针，仅通过一次GISH试验即可快速构建黄瓜中期染色体的核型，是通过以下方法获得的：

1)黄瓜基因组DNA是采用CTAB法提取获得，1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的相对浓度，紫外分光光度计检测基因组DNA的纯度；

2)采用缺刻平移法将黄瓜基因组DNA用Digoxigenin-11-dUTP标上探针，备用；

3)采用4％纤维素酶和2％果胶酶混合液，酶解黄瓜根尖，利用火焰干燥法制作黄瓜染色体制片，镜检，挑选染色体分散度高的制片，备用；

4)将标好的探针杂交到黄瓜中期染色体上，反应12h后，加上带有荧光基团的抗体进行反应1h，高严谨条件洗脱后，利用荧光显微镜检测信号，根据每条染色体信号分布模式的特异性，构建核型。

3.根据权利要求1所述的利用黄瓜基因组DNA作为探针，仅通过一次GISH试验即可快速构建黄瓜中期染色体的核型，是由于不需要利用多个探针以及进行多次重复的杂交，提高了试验效率。