CN1995396B - 棉花粗线期染色体荧光原位杂交方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种荧光原位杂交技术，其以粗线期染色体作为靶DNA进行荧光原位杂交。本发明的杂交技术，可用于绘制高密度的粗线期染色体物理图谱，可直接应用于图位克隆技术分离目的基因，直接指导棉花全基因组测序；大大提高了棉花的功能基因及分子标记序列在染色体上的直接定位的检出效率；粗线期染色体为二价体形式，包括两个同源染色体，避免了同源染色体难以识别的缺点；大大提高了染色体荧光原位杂交的分辨率。本发明尤其是用于棉花的染色体原位杂交。

Description

棉花粗线期染色体荧光原位杂交方法

技术领域

本发明涉及细胞遗传学和分子生物学领域，具体地说涉及棉花粗线期染色体的荧光原位杂交技术(FISH)。

背景技术

总的说来，染色体荧光原位杂交技术(FISH)的发展主要沿着两条路线前进：一方面是采用不同的探针，从以基因组为探针的FISH发展到以重复序列为探针的FISH，发展到以BAC、YAC、cosmid文库为探针的FISH，再发展到以低拷贝或单拷贝DNA序列为探针的FISH；另一方面则是努力提高FISH技术的分辨率，将靶目标从中期染色体(包括体细胞和减数分裂中期染色体，分辨率为1-3Mb)发展到减数分裂粗线期染色体(分辨率为50-100kb)，然后在发展到DNA纤维(分辨率为几kb)，使其分辨率由几Mb发展到几kb，这更进一步拓展了FISH技术的应用领域，成为分子细胞生物学的一项代表技术。

棉属荧光原位杂交采用的靶DNA大多是体细胞或减数分裂中期染色体，目前还没有在棉花的荧光原位杂交中采用粗线期染色体为靶DNA的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用粗线期染色体FISH的方法。

本发明的杂交方法是采用粗线期染色体作为靶DNA，进行荧光原位杂交。具体地说包括如下步骤：

1、取含有粗线期染色体的细胞和组织制片。

可以用体细胞或者是花粉母细胞来制片，制片时要选择细胞分裂旺盛的组织来制片，保证有大量的粗线期细胞。对于棉花来说，可以采取棉花的花药制片。首先将花药用固定液固定，双蒸水洗涤，尿苷处理，水洗，纤维素酶、果胶酶和蜗牛酶处理，水洗；取雄蕊管基部的花药置于无尘载玻片上，滴加乙酸，压破花药使花粉母细胞溢出，去除残渣，盖玻片盖片，在酒精灯上微热，垫小片滤纸轻压即可。可在相差显微镜下检查制片的质量，选择高质量的制片干燥备用。

2、设计探针并作标记。

根据靶序列设计探针，设计探针时可借助软件来设计，如Oligo，Primer Express，TaqMan，DNAProbe等等。

探针在设计时通常按照如下原则：探针的位置要尽量靠近上游引物；探针长度在15～45nt之间(最好是20～30nt)；避免产生二级结构；GC含量在40～70％，Tm值在65～70℃，通常比引物Tm值高5～10℃；探针的5’端要避免为G；整个探针中的C含量要高于G含量；检查探针的特异性，避免非特异性互补。

探针的标记可以采用随机引物法、缺口平移法、末端标记法以及PCR法。按标记物的性质分为放射性标记和非放射性标记，非放射性标记是近年来兴起的标记方法，通常有光敏生物素标记、酶促生物素标记、DNA半抗原标记等等方法。

3、杂交。

将标记好的探针和含有甲酰胺、硫酸葡聚糖的杂交液混合好，然后，将探针杂交液铺在染色体制片上，盖上盖玻片，进行原位杂交，杂交在通常37℃下进行，为了提高特异性，可以适当提高杂交的温度，杂交时间通常在12个小时以上，为了保证杂交的充分和信号的强度，最好不低于36小时。杂交后显色，封片。

4、荧光显微镜观察。

本发明采用粗线期荧光原位杂交，具有如下优点：

1.可用于绘制高密度的粗线期染色体物理图谱，可直接应用于图位克隆技术分离目的基因，直接指导棉花全基因组测序。

2.大大提高了棉花的功能基因及分子标记序列在染色体上的直接定位的检出效率。

3.棉花粗线期染色体为二价体形式，包括两个同源染色体，避免了同源染色体难以识别的缺点。

4.大大提高了棉花染色体荧光原位杂交的分辨率。

附图说明

图1是信号多重放大荧光原位杂交的镜检图片，所用探针为EST序列G1185，基因库编号CA994275，长度为934bp，图1为镜检全图，箭头所示为信号；

图2是分离出的带有杂交信号的单条染色体；

图3是双色荧光原位杂交的镜检图片，所用探针为18S rDNA和5S rDNA基因，长度分别为1500bp和300bp，箭头A为18S rDNA信号，箭头B为5S rDNA信号。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

1、粗线期染色体制片：

1)粗线期染色体制片取自含有减数分裂前期的花粉母细胞的花蕾。含有处于粗线期的花粉母细胞的花药的判断：摘取适当大小的花蕾(可能含有处于粗线期的花粉母细胞的花蕾因棉种和栽培环境不同而长度不同)，除去花萼和花冠，取出少量花药，置载片上加一滴卡宝品红或乙酸洋红，用镊子将花药压碎，在低倍物镜下(10×或20×)进行镜检，看到边缘发亮的近圆形细胞，即正进行减数分裂的花粉母细胞。将上述花药用改良的固定液：无水乙醇-冰乙酸-三氯甲烷(5∶3∶2)固定20小时(花药如不及时制片，可换入70％的乙醇中于4℃长期保存备用)。

2)双蒸水水洗固定后的花药三次，转入0.5mmol/L尿苷水溶液中，常温处理2～4小时。水洗花药后，将其转入在0.075mol/L KCl溶液中含4％(g/ml)的纤维素酶cellulase R-10、1％(g/ml)的果胶酶pectolyase Y-23、1％(g/ml)的蜗牛酶cytohelicase的混合液中酶解2～2.5小时。仔细用双蒸水水洗花药三次，置于冰上待用。

3)用镊子取步骤2)处理后的花药数枚，置于一张无尘载玻片上，加入一小滴60％乙酸，用镊子的平头一端把花药压破，使花粉母细胞溢出，再用镊子捡除花药壁的大块残渣，盖玻片盖片，在酒精灯上微热，垫小片滤纸轻压即可。

4)在相差显微镜下检查制片质量，选择高质量的粗线期染色体制片于-70℃冰冻或液氮脱盖片，空气干燥一天后备用。杂交之前，干燥制片置于50～60℃温箱中再充分干燥12h或过夜。

2、探针的制备

信号多重放大荧光原位杂交选取的探针为EST序列G1185，基因库编号CA994275，利用Oligo6软件设计的引物为：

5′GGATTATGAATGGCGACAAG3′(上游引物，SEQ ID NO：1)，

5′TTTAGAAATCTTCCTCCGTT3′(下游引物，SEQ ID NO：2)，PCR产物长度为934bp；

双色荧光原位杂交选取的探针为18S rDNA和5S rDNA基因，利用Oligo6软件设计引物，18S rDNA基因设计的引物为：

5′TGTGAAACTGCGAATGGCTC3′(上游引物，SEQ ID NO：3)，

5′ACAAAGGGCAGGGACGTAGT3′(下游引物，SEQ ID NO：4)，PCR产物长度为1500bp；

5S rDNA基因设计的引物为：

5′GAGAGTAGTACAACGATGGG3′(上游引物，SEQ ID NO：5)，

5′GGAGTTCTGATGGGATCCGG3′(下游引物，SEQ ID NO：6)，PCR产物长度为300bp。

3、探针的标记

EST序列和5S rDNA基因采用缺刻平移法进行探针标记，生物素标记物为biotin-16-dUTP(Roche)，18S rDNA基因采用随机引物法进行探针标记，地高新标记物为digoxigenin-11-dUTP(Roche)。

生物素标记探针：生物素标记物为biotin-16-dUTP(Roche)，采用缺刻平移法进行探针标记。将1μg的模板DNA用灭菌双蒸水稀释到16μL，在加入4μL的Biotin-Nick Translation Mix，混匀后短暂瞬间离心，于15℃温浴90min，加1μL的反应终止液(0.5mol/LEDTA，pH8.0)，然后再65℃温浴10min终止反应。

地高新标记探针：地高新标记物为digoxigenin-11-dUTP(Roche)，采用随机引物法进行探针标记。将1μg的模板DNA用灭菌双蒸水稀释到16μL，在沸水浴中变性DNA10min，迅速放入冰水混合物中冷却10min，在加入4μLDIG-HighPrime于变性DNA中，37℃温浴20h，加2μL的反应终止液(0.2mol/LEDTA，pH8.0)，或65℃温浴10min终止反应。

4、荧光原位杂交

例1信号多重放大荧光原位杂交

杂交之前，将制好的片子60℃烘箱中干燥过夜；滴加100μg/μLDNase-free RNase数滴，盖上该片，37℃处理1小时，DNase-freeRNase用2×SSC(0.3mol/LNaCl与0.03mol/L柠檬酸三钠)缓冲液配制，在用2×SSC缓冲液漂去盖片，用2×SSC缓冲液洗制片3×5分钟(洗涤3次，每次5分钟)；滴加0.01％(适合体细胞)或1％(适合花粉母细胞)Pepsin(10mM HCl配制)数滴，盖上盖片，37℃温育1小时，2×SSC缓冲液漂去盖片，2×SSC缓冲液洗制片2×5分钟；2％的PVP40和4g/L的活性碳处理1小时，2×SSC缓冲液洗制片3×5分钟；转入4％的多聚甲醛(50mM MgCl₂1×PBS配制)中37℃下固定10分钟；2×SSC缓冲液洗制片3×5分钟；迅速转入70％、90％、100％乙醇梯度逐级脱水3分钟，凉干载片。

杂交混合液须在使用前新配制，其组成如下：50％去离子甲酰胺(用于防止高温对染色体形态和结构的损害及脱落)；10％硫酸葡聚糖(它能与水结合减少杂交液容积，提高探针的有效浓度)；2×SSC(0.3mol/L NaCl与0.03mol/L柠檬酸三钠的盐溶液，用于浸润染色体DNA)；0.5％的10％SDS；25～100ng/片的探针；20～100倍封阻DNA(鲑鱼精DNA)。在涡流混合器上混匀(此步骤很重要)。该混合液于70℃下变性10分钟，迅速转入冰水中至少10分钟。

加上述变性的杂交混合液50μL于载片上，盖上盖玻片，密封，水浴中进行共变性。根据对照实验选择合适的共变性温度，本实验用80℃(解链温度，melting temperature)10分钟，然后转入37℃水浴中杂交过夜。为了保证杂交的充分和检测到的信号的强度，温育时间不得低于36小时。

20％的甲酰胺(用2×SSC稀释)42℃处理3×5min，依次用2×SSC缓冲液和1×TN(0.1mol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl缓冲液)洗，然后用100μL/片的TNB(TN+0.5blocking)37℃处理30min，接着：1)用5ng/μL链抗亲和素-Cy3(STREPTAVIDIN-Cy3，ZYMED)稀释液50μL/片，37℃处理1h，1×TN洗三次；2)加5ng/μL生物素化链抗亲和素(Biotinylated Anti-Streptavidin，VECTOR)稀释液50μL/片，37℃处理1h，1×TN洗三次；3)加5ng/μL链抗亲和素-Cy3稀释液，50μL/片，37℃处理1h，重复步骤2)和3)依次用1×TN和2×SSC洗，转入70％、90％、100％乙醇梯度逐级脱水3分钟，凉干载片。载玻片用1μg/ml的DAPI复染，1×PBS 3×3分钟洗去多余的DAPI，凉干，用抗衰剂Vectashield(Vector)封片。

例2双色荧光原位杂交

杂交之前，将制好的片子60℃烘箱中干燥过夜；滴加100μg/μLDNase-free RNase(2×SSC缓冲液配制)数滴，盖上盖片，37℃处理1小时，2×SSC缓冲液漂去盖片，2×SSC洗涤3×5分钟；滴加1％Pepsin(10mM HCl配制)数滴，盖上盖片，37℃温育1小时，2×SSC缓冲液漂去盖片，2×SSC缓冲液洗涤2×5分钟；转入4％的多聚甲醛(50mM Mgcl₂ 1×PBS配制)中37℃下固定10分钟；2×SSC缓冲液洗3×5分钟；迅速转入70％、90％、100％乙醇梯度逐级脱水3分钟，凉干载片。

杂交混合液须在使用前新配制，其组成如下：50％去离子甲酰胺(用于防止高温对染色体形态和结构的损害及脱落)；10％硫酸葡聚糖(它能与水结合减少杂交液容积，提高探针的有效浓度)；2×SSC(0.3mol/L NaCl与0.03mol/L柠檬酸的盐溶液，用于浸润染色体DNA)；0.5％的10％SDS；分别加入25-100ng/片用digoxigenin-11-dUTP和biotin-16-DUTP标记的探针；20-100倍封阻DNA；在涡流混合器上混匀(此步骤很重要)。该混合液于80℃下变性10分钟，迅速转入冰水中至少10分钟。加上述变性的杂交混合液50μL于载片上，盖上盖玻片，密封，80℃水浴中进行共变性10分钟，杂交过夜。

杂交制片用2×SSC室温下漂去盖片；2×SSC(0.1％SDS)37℃洗涤3×5分钟；0.2×SSC(0.1％SDS)37℃洗涤3×5分钟；2×SSC室温下冲洗2次，甩干载片；加上50μL/片5％BSA(4×SSC/Teween20配制)，盖上封口膜，37℃封闭30分钟，用于封阻非特异性信号；甩干封闭液(载片不能见干)，加入30μL/片Anti-digoxigenin-Fluorescein抗体(Roche，20ng/μL溶于含5％BSA的PBS缓冲液中)，加盖片37℃温育1小时。2×SSC室温下漂去盖片，20％的甲酰胺(用2×SSC稀释)42℃处理3×5min，依次用2×SSC和1×TN(0.1mol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl缓冲液)洗，然后用100μL/片的TNB(TN+0.5blocking)37℃处理30min，接着：1)用10ng/μL链抗亲和素-Cy3(STREPTAVIDIN-Cy3，ZYMED)稀释液50μL/片，37℃处理1h，1×TN洗三次；2)加10ng/μL生物素化链抗亲和素(Biotinylated Anti-Streptavidin，VECTOR)稀释液50μL/片，37℃处理1h，1×TN洗三次；3)加10ng/μL链抗亲和素-Cy3稀释液，50μL/片，37℃处理1h，依次用1×TN和2×SSC洗，转入70％、90％、100％乙醇梯度逐级脱水3分钟，凉干载片。载玻片用1μg/ml的DAPI复染，1×PBS 3×3分钟洗去多余的DAPI，凉干，用抗衰剂Vectashield(Vector)封片。

5、荧光观察

用安装有CCD摄像头的ZEISS Axioskop2mot plus荧光显微镜观察荧光信号，用ZEISS-ISIS成像系统软件进行原位杂交图像的摄取、采集，Photoshop7.0软件处理图片。结果如图1和图2所示。图1是信号多重放大荧光原位杂交的镜检图片，所用探针为EST序列G1185，基因库编号CA994275，长度为934bp，图1为镜检全图，箭头所示的为染色体上的信号(彩色照片中显示为红色)，图2为分离出的带有杂交信号的单条染色体；图3是双色荧光原位杂交的镜检图片，所用探针为18S rDNA和5S rDNA基因，长度分别为1500bp和300bp，箭头A所示为18S rDNA信号(彩色照片中显示为绿色)，箭头B为5S rDNA信号(彩色照片中显示为红色)。

序列表

<110>中国农业科学院棉花研究所

<120>染色体荧光杂交技术

<130>

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ggattatgaa tggcgacaag    20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tttagaaatc ttcctccgtt    20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tgtgaaactg cgaatggctc    20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

acaaagggca gggacgtagt    20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gagagtagta caacgatggg    20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ggagttctga tgggatccgg    20

Claims (3)

1.棉花粗线期染色体荧光原位杂交方法，其特征在于包括如下步骤：

1)取处于减数分裂的棉花花药，用固定液固定，双蒸水洗涤，尿苷处理，水洗，纤维素酶、果胶酶和蜗牛酶处理，水洗；取雄蕊管基部的花药置于无尘载玻片上，滴加乙酸，压破花药使花粉母细胞溢出，去除残渣，盖玻片盖片，在酒精灯上微热，垫小片滤纸轻压，得制片；

2)设计探针并作标记；

3)杂交，显色，封片；

4)荧光显微镜检测。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中所述的固定液为乙醇、乙酸和三氯甲烷的混合液，其按体积百分比为5∶3∶2。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于其中步骤3)采用Cy3信号放大系统进行显色。

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