CN103773890B - 鉴别棉花A genome和A sub-genome全套染色体的方法 - Google Patents
鉴别棉花A genome和A sub-genome全套染色体的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103773890B CN103773890B CN201410060083.3A CN201410060083A CN103773890B CN 103773890 B CN103773890 B CN 103773890B CN 201410060083 A CN201410060083 A CN 201410060083A CN 103773890 B CN103773890 B CN 103773890B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cotton
- genome
- bac
- karyomit
- clone
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
Abstract
本发明属于分子细胞遗传学领域，具体涉及一种鉴别棉花A基因组或A亚基因组染色体的方法。用来源于海岛棉pima-90BAC文库的BAC克隆299N22，在不同棉种中进行BAC-FISH，可明显分辨出棉花A基因组或A亚基因组染色体。以该BAC克隆做探针在5个四倍体棉种的A亚基因组染色体和2个二倍体棉种的A基因组染色体上均表现出明显信号，且信号分布在所有染色体上，而在D基因组和D亚基因组染色体均无信号。利用本发明的BAC克隆采用BAC-FISH方法，可快速鉴别A基因组或A亚基因全套组染色体。
Description
技术领域
本发明属于分子细胞遗传学领域，具体涉及鉴别棉花A基因组和A亚基因组全套染色体的BAC-FISH方法。
背景技术
细菌人工染色体荧光原位杂交（BAC-FISH）是将包含不同特性的BAC克隆直接定位到染色体上的技术，由于克隆的外源片段一般为100kb以上，其探针与靶DNA序列相遇的机会大，杂交信号检出率高。因此，它较单拷贝或低拷贝小片段DNA序列杂交更为容易检出信号，而且准确可靠。目前已被广泛应用于核型分析、基因定位、物理图谱的构建、比较作图及进化研究，其在植物基因组学和分子细胞遗传学研究中具有不可替代的作用。近年来，随着植物基因组测序的迅速发展，BAC-FISH在序列信息和染色体生物学间的桥梁作用也显得越来越重要。BAC-FISH首次在棉花领域的应用是在1995年（Hanson等）。随后，随着科技技术的不断改进成熟，尤其是棉花基因组学研究的深入，棉花高密度的遗传图谱以及BAC文库的成功构建，BAC-FISH在棉花上的应用逐渐广泛起来。
棉花是世界上重要的经济作物，棉属共包含52个棉种，共5个四倍体和47个二倍体。棉花二倍体棉种分为A、B、C、D、E、F、G和K共8个染色体组。四倍体棉种为异源四倍体，其染色体组为AD。如今，世界范围内主要的栽培种是陆地棉（AD）和海岛棉（AD），分别占栽培面积的95%和5%左右。目前，D组棉种雷蒙德氏棉的基因组测序已经完成，A组棉种亚洲棉的基因组测序正在进行中。对棉花A、D组染色体的研究将会对四倍体棉的进化研究以及对棉花育种都会有很大的帮助。通过筛选BAC文库获得不同类型的特异BAC克隆，来进行荧光原位杂交实验，是一个研究染色体结构和染色体之间亲缘关系很好的方法。
发明内容
本发明的目的是提供鉴别棉花A基因组和A亚基因组全套染色体的BAC-FISH方法。
本发明首先筛选到鉴别棉花A基因组或A亚基因组染色体的FISH探针，该BAC克隆299N22由SSR引物NAU1201筛选海岛棉pima-90BAC（王文生，2006）文库所得，SSR引物NAU1201的序列信息为：
ForwardPrimer:CCGATATCTTACTTTCCAACCT
ReversePrimer:AAGGGGTTTGAAGGGTTATC
该引物扩增出的目的片段长度大约为150bp，序列为：CCGATATCTTACTTTCCAACCTCTTTCTTCCATCTCCATCTCCATCTCCTTTCTGCAATTATTCCCAACTTTCCATGGCTTCCTTCACACCCAATCTAGAACCTGCCCCTGACACCTCTCTTCAGTTCAAGCCCAAGAAACCCAGGATAACCCTTCAAACCCCTT
用引物NAU1201扩增BAC克隆299N22可获得长度大约为150pb的目的片段。
利用该BAC克隆做探针，在不同棉种有丝分裂中期的染色体上进行杂交试验，结果表明：在5个四倍体棉种的A亚组全套染色体及在2个A基因组棉种的染色体上均表现出信号，且信号分布在所有的染色体上，而四倍体棉种D亚基因组染色体无信号。
根据本发明的具体实施方式，所述BAC-FISH方法包括以下步骤：
1）取材及预处理：取种子在温水中浸泡12h左右，然后在光照培养箱里培养，待根长至1～2cm时，截取根尖用(25ppm)放线菌酮25℃下处理2h，然后用蒸馏水冲洗1次，用95%乙醇：冰乙酸（3:1）固定液固定2h到24h；
2）酶解：取出固定好的根尖，用蒸馏水冲洗1次，在37℃下用2%纤维素酶+1%果胶酶混合液处理根尖45min；
3）制片：用60%乙酸进行压片，保留下好的制片在-80℃下保存4h以上，然后在-80℃下揭掉盖片，迅速置于80℃烤干，在60℃烘箱中烘干10h，最后放在4℃保存备用；
4）标记探针：探针的标记采用Bio-NickTranslationMix系统标记，首先提取特异BAC克隆(299N22)的质粒，然后参考Roche公司的说明，先取1μL相应浓度的质粒溶解于ddH2O中，配成16μL，再加入4μLBio-NickTranslationMix混合，短暂离心，然后15℃保温90min，最后是65℃温浴10min，以灭活体系中的酶活性，最后放在-20℃保存备用。
5）进行荧光原位杂交。
6）荧光显微镜观察，用Zeiss荧光显微镜观察荧光信号，用Zeiss-Isis成像系统软件进行荧光原位杂交图像的获取、采集、加工。采用Photoshop作图软件处理图片。
BAC-FISH技术是一个很好的研究染色体结构和染色体之间进化亲缘关系的方法，本发明可以作为种属间基因组水平的遗传标记，这对研究棉花种内或种间的分化以及棉花基因组进化具有重要作用，同时对于棉花的遗传进化研究和棉花育种也具有重要意义，本发明也可以用于涉及A基因组或A亚基因组染色体的棉花远缘杂交育种的基因组检测。
附图说明
图1以BAC克隆299N22为探针（黄绿色），分别荧光原位杂交陆地棉(A)、海岛棉(B)、达尔文氏棉(C)、黄褐棉(D)、毛棉(E)、亚洲棉(F)、草棉(G)和雷蒙德氏棉(H)的有丝分裂中期染色体的杂交图像。染色体显示为蓝色，299N22为黄绿色信号。Bar=5μm。可明显看出，草棉和亚洲棉（A组棉种）的26条染色体均有黄绿色信号，雷蒙德氏棉（D组棉种）的26条染色体上几乎检测不到信号，而5个四倍体棉的52条染色体中，其中26条有黄绿色信号，剩余的26条几乎无信号。
具体实施方式
实施例1以BAC克隆299N22为探针，分别杂交陆地棉（AD）1、草棉A1、雷蒙德氏棉D5中期分裂染色体
1材料和方法
1.1实验材料
实验材料是四倍体的陆地棉TM-1、草棉和雷蒙德氏棉，均来自于中国农业科学院棉花研究所。所用的BAC文库为海岛棉Pima90-53BAC文库（王文生，2006），由河北农业大学作物种质资源重点实验室马峙英教授惠赠。实验试剂：纤维素酶OnazukaR-10和果胶酶PectolyaseY-23购自Solarbio公司，生物素探针标记试剂盒购自Roche公司，其他均为国产分析纯试剂。
1.2实验方法
1）采用三步PCR法进行BAC文库的筛选（石雪萍等，2010），即用SSR引物NAU1201依次对板池（1个384板所有的单克隆混合）、行池（1个384板中1行24个单克隆混合）和1行24个单克隆层层进行菌液PCR扩增，所有扩增产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，最后得到阳性单克隆299N22。
2）取材及预处理：取三个棉种的种子在温水中浸泡12h左右，然后在光照培养箱里培养，待根长至1～2cm时，截取根尖用(25ppm)放线菌酮25℃下处理2h，然后用蒸馏水冲洗1次，用95%乙醇：冰乙酸（3:1）固定液固定2h到24h；
3）酶解：取出固定好的根尖，用蒸馏水冲洗1次，在37℃下用2%纤维素酶+1%果胶酶混合液处理根尖45min；
4）制片：酶解好的根尖用60%乙酸进行压片，保留下好的制片在-80℃下保存4h以上，然后在-80℃下揭掉盖片，迅速置于80℃烤干，在60℃烘箱中烘干10h，最后放在4℃保存备用；
5）标记探针：探针的标记采用Bio-NickTranslationMix系统标记。首先提取特异BAC克隆(299N22)的质粒，然后参考Roche公司的说明，先取1μL相应浓度的质粒溶解于ddH2O中，配成16μL，再加入4μLBio-NickTranslationMix混合，短暂离心，然后15℃保温90min，最后是65℃温浴10min，以灭活体系中的酶活性，最后放在-20℃保存备用。
6）荧光原位杂交流程，参照王春英等（2001）介绍的方法。生物素标记的探针在荧光显微镜下观察显示黄绿色。染色体用DAPI衬染在荧光显微镜下观察显示蓝色。
7）荧光显微镜观察，用Zeiss荧光显微镜观察荧光信号，用Zeiss-Isis成像系统软件进行荧光原位杂交图像的获取、采集、加工。采用Photoshop作图软件处理图片。
2实验结果
实验结果显示，陆地棉52条染色体可清晰的分辨出来，其中26条染色体可检测到黄绿色荧光信号，而其他26条染色体上几乎没有检测到信号（图1(A)），草棉的26条染色体均可检测到黄绿色信号（图1(G)），雷蒙德氏棉的26条染色体几乎检测不到信号（图1(H)）。由此可见，陆地棉52条染色体中，有黄绿色信号的26条染色体为A亚组染色体，没有检测到黄绿色信号的26条染色体为D亚组染色体。
Claims (2)
1.鉴别棉花A基因组和A亚基因组全套染色体的BAC-FISH方法，其特征在于，所述方法包括使用来自海岛棉pima-90BAC文库的BAC克隆299N22进行细菌人工染色体荧光原位杂交的步骤，其中，所述克隆299N22的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。
2.来自海岛棉pima-90BAC文库的BAC克隆299N22用于鉴别棉花A基因组和A亚基因组全套染色体的应用，其中，所述克隆299N22的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410060083.3A CN103773890B (zh) | 2014-02-21 | 2014-02-21 | 鉴别棉花A genome和A sub-genome全套染色体的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410060083.3A CN103773890B (zh) | 2014-02-21 | 2014-02-21 | 鉴别棉花A genome和A sub-genome全套染色体的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103773890A CN103773890A (zh) | 2014-05-07 |
| CN103773890B true CN103773890B (zh) | 2016-02-03 |
Family
ID=50566646
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410060083.3A Expired - Fee Related CN103773890B (zh) | 2014-02-21 | 2014-02-21 | 鉴别棉花A genome和A sub-genome全套染色体的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103773890B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104212888B (zh) * | 2014-08-19 | 2016-05-04 | 中国农业科学院棉花研究所 | 标记棉花A genome和A sub-genome染色体端部的方法 |
| CN106967833B (zh) * | 2017-05-22 | 2020-09-29 | 中国农业科学院棉花研究所 | 用于二倍体a基因组棉种和/或四倍体棉种鉴定的引物及其pcr鉴定方法 |
| CN108517371B (zh) * | 2018-05-11 | 2020-06-05 | 中国农业科学院棉花研究所 | 用于二倍体d基因组棉种或四倍体棉种鉴定的引物及方法 |
| CN112877407B (zh) * | 2021-03-30 | 2023-10-17 | 安阳工学院 | 一种棉花中期染色体非变性荧光原位杂交方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1995396A (zh) * | 2006-12-30 | 2007-07-11 | 中国农业科学院棉花研究所 | 棉花粗线期染色体荧光原位杂交方法 |
-
2014
- 2014-02-21 CN CN201410060083.3A patent/CN103773890B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1995396A (zh) * | 2006-12-30 | 2007-07-11 | 中国农业科学院棉花研究所 | 棉花粗线期染色体荧光原位杂交方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BAC-FISH在植物基因组研究中的应用;甘仪梅等;《生物技术通报》;20131231(第10期);58-65 * |
| 雷蒙德氏棉3条染色体特异BAC的筛选与定位;覃琴等;《棉花学报》;20131231;第25卷(第4期);323-328 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103773890A (zh) | 2014-05-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Joshi et al. | Down-regulation of miR-199b associated with imatinib drug resistance in 9q34. 1 deleted BCR/ABL positive CML patients | |
| CN103773890B (zh) | 鉴别棉花A genome和A sub-genome全套染色体的方法 | |
| CN106086216B (zh) | 一种与马氏珠母贝生长性状关联的snp标记及引物和应用 | |
| CN104561306B (zh) | 一种与猪眼肌面积性状有关的猪unc13b基因snp标志物 | |
| CN107400720B (zh) | 一种klf3基因cnv标记辅助检测黄牛生长性状的方法及其专用试剂盒 | |
| CN110079615B (zh) | 一种检测茶卡羊kmt2d基因cnv标记的方法及其应用 | |
| CN107119117B (zh) | 一种检测秦川牛gbp2基因cnv标记的方法及其应用 | |
| CN101736018A (zh) | 一种水稻香味基因及其功能标记 | |
| CN105349674A (zh) | 一种与秦川牛生长相关的cnv标记的检测方法与应用 | |
| CN108410996A (zh) | 与山羊产绒性状相关的InDel分子标记及其应用 | |
| CN105349543B (zh) | 用于中国明对虾遗传性别鉴定的dna序列及其获取和应用 | |
| Ma et al. | Parentage assignment of the mud crab (Scylla paramamosain) based on microsatellite markers | |
| CN104672315B (zh) | 控制黄瓜无卷须性状的基因及与黄瓜卷须性状相关的snp标记 | |
| CN1995396B (zh) | 棉花粗线期染色体荧光原位杂交方法 | |
| CN105349691B (zh) | 一种鉴定中国明对虾遗传性别的dna序列标签及其应用 | |
| CN109988847A (zh) | 一种检测茶卡羊she基因cnv标记的方法及其应用 | |
| CN104313164B (zh) | 鉴别棉花D genome和D sub-genome全套染色体的方法 | |
| CN102559909A (zh) | 一种悬钩子属植物中期染色体荧光原位杂交方法 | |
| CN111926104B (zh) | 一种鉴定甘蔗与斑茅杂交后代真实性的ssr分子标记及其方法 | |
| CN106755507B (zh) | 鉴别栽培黑麦与野生黑麦染色体的分子检测方法 | |
| CN103361340B (zh) | 海湾扇贝耐热相关热休克蛋白70基因标记及其辅助育种方法 | |
| CN104419763A (zh) | 黄瓜单拷贝基因的染色体物理定位方法 | |
| CN105543342B (zh) | 一种显示大黄鱼着丝粒和短臂的方法 | |
| CN110964790B (zh) | 一种检测茶卡羊pigy基因cnv标记的方法及其应用 | |
| CN104212888A (zh) | 标记棉花A genome和A sub-genome染色体端部的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160203 Termination date: 20170221 |