CN101736018A

CN101736018A - 一种水稻香味基因及其功能标记

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Publication number: CN101736018A
Application number: CN201010103607A
Authority: CN
Inventors: 胡培松; 唐绍清; 邵高能; 罗炬; 焦桂爱; 魏详进; 唐傲
Original assignee: China National Rice Research Institute
Current assignee: China National Rice Research Institute
Priority date: 2010-01-26
Filing date: 2010-01-26
Publication date: 2010-06-16
Anticipated expiration: 2030-01-26
Also published as: CN101736018B

Abstract

一种水稻香味基因及其功能标记，属于生物技术领域。其特征在于所述的水稻香味基因与第八染色体上的编码甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2等位，所述的水稻香味基因与正常的Badh2相比在第4和5外显子之间发生了803bp的缺失，该缺失碱基位于基因转录起始密码子下游1628bp与2430bp之间，803bp缺失碱基对应于第4外显子90bp，第4内含子694bp和第5外显子19bp。并根据水稻香味基因设计香味基因功能标记FMbadh2-E4-5。通过该方法，可以有目标的将香味基因转到非香味水稻品种中去，极大地促进了新优质香稻品种的培育。

Description

一种水稻香味基因及其功能标记

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种水稻香味基因及其功能标记的开发。

背景技术

香稻由于其独特的香味特性而备受人们的欢迎，而且香米在市场上的价格也都远远高于非香稻米，因此香稻育种已成为现代水稻育种的重要内容之一，明确香味遗传的分子生物学机理有利于新品种的选育。

到目前为止，水稻香味基因研究取得了较大的进展，许多学者对水稻香味基因进行了遗传分析及基因定位。Ahn et al.(1992)首先利用限制性片段长度多态性标记将控制香味的隐性基因定位在第八染色体上，与RFLP标记RG28的遗传距离为4.5cM。Lorieux et al.(1996)利用RFLP、随机扩增多态性DNA、序列标记位点以及同工酶等4种标记，结合气相色谱对挥发性物质2AP的测定，将香味基因定位在第八染色体上RFLP标记RG1和RG28之间。Jin et al.(1995-1996)以CT9993/KDML105衍生的F₂分离群体为研究材料，用RAPD引物扩增出一个与香味基因紧密连锁的产物，经NcoI酶切后发展了RFLP探针jas500，然后对F₂分离群体进行检测，证明KDML105的香味遗传受一对隐性基因控制并将控制香味的基因aro定位在第八染色体上。Dong et al.(2001)利用RFLP分子标记以及初级三体对Della和三个日本地方香稻品种Kabashiko、Shiroikichi和Henroyori进行了遗传分析和基因定位，认为这四个品种的香味基因等位且均由隐性单基因控制，并将其定位于第八染色体上。Wanchana etal.(2005)主要通过简单序列重复区间标记和细菌人工染色体克隆的方法，将香味基因fgr定位在第八染色体上遗传距离为2.9cM的两个简单重复序列标记RM223和RM342之间，并进一步找到fgr基因附近的标记10L03FW和CP04133，两标记间170kb的DNA序列包含有22个开放阅读框，同时对序列的分析显示出了香稻与非香稻的差异就在编码甜菜碱醛脱氢酶的一个基因上。Bradbury et al.(2005)对fgr区域的17个基因进行序列测定发现控制甜菜碱醛脱氢酶(BADH2)的基因Badh2在香和非香水稻品种中有明显区别，其中香稻品种在Badh2的编码区第7外显子出现了8bp的缺失和3个SNPs，结果导致翻译提前终止，产生无功能的截断BADH2蛋白。据此，Bradbury等预测Badh2基因可能是控制香味性状的基因。Chen et al.(2006)也通过定位群体，将fgr定位于标记L02和标记L06间69Kb区域，同时fgr区域的序列分析显示了三个候选基因，功能互补实验结果显示，转Badh2的转基因植株2AP含量较对照有了明显的降低，而其余两个候选基因在转基因前后香味性状基本没有改变，这表明只有Badh2基因和香味性状有关。Chen et al.(2008)还发现了Badh2中的另外一个等位基因，即第2外显子7bp的缺失，并将非香的Badh2转化到第2外显子变异的香稻品种中，发现转基因植株的2AP含量显著下降，结果表明该位点的缺失同样导致水稻香味的产生。

与此同时，多个学者还对控制香味基因的不同位点进行探索和研究。Bourgis et al.(2008)在badh2的启动子区域发现MITE结构，即12bp碱基的变化(8bp缺失和4bp插入)，在所有研究的香型的水稻品种中都表现为缺失，以此认为香味基因启动子区域与水稻香味的产生可能存在一定的关系。同时，Fitzgerald et al.(2008)也在对464份材料的分析之后得出相似结论，并不是所有的香稻材料都包含Badh2编码区第7外显子上的缺失，认为可能存在新的非等位香味基因或等位香味基因内的不同位点发生了变异。许多学者也根据现有的水稻香味基因开发了相应的分子标记，但是一些香味水稻虽然有香味，但其香味基因序列并非与上述研究保持一致，这将为新香味基因的发掘与利用提供了机会。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于获得了一种新的水稻香味基因特异序列，并设计提供了该水稻香味基因的功能标记的技术方案。

所述的一种水稻香味基因，其特征在于所述的水稻香味基因与第八染色体上的编码甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2等位，所述的水稻香味基因与正常的Badh2相比在第4和5外显子之间发生了803bp的缺失，该缺失碱基位于基因转录起始密码子下游1628bp与2430bp之间，803bp缺失碱基对应于第4外显子90bp，第4内含子694bp和第5外显子19bp。

所述的水稻香味基因特异序列设计香味基因功能标记FMbadh2-E4-5，所述的FMbadh2-E4-5正反引物序列如下：

正向引物序列(5’-3’)为TGCTGGATGCTTTGAGTA，

反向引物序列(5’-3’)为GTTTAGCACACCTGAAGGAAGACCA。

所述的香味基因功能标记，其特征在于可用于对特定香稻材料香味基因进行分子标记辅助选择。

通过该方法，可以有目标的将香味基因转到非香味水稻品种中去，极大地促进了新优质香稻品种的培育。

附图说明

图1为本发明中水稻香味基因结构和3个功能位点示意图；

图2为利用3个功能标记对4个非香稻及22个香稻材料基因型检测结果。

图1中：第2及第7外显子为已报道的功能位点；第4与和第5外显子间803bp缺失为本实验发现的功能位点，涵盖第4外显子90bp、第4内含子694bp和第5外显子19bp的缺失。

图2中：1-4：非香稻材料，分别为日本晴，秋光，南京11，IR36；5-12：经FMbadh2-E2(A)检测在第2外显子7bp缺失的香稻材料，依次为苏香粳1号，武香粳14，香粳糯，卡鸡糯，白毛香粳，黑香粳，密香糯，花壳香粳；13-20：经FMbadh2-E4-5(B)检测在第4、5外显子803bp缺失的香稻材料，依次为渠坤香糯，在妙香糯，花香糯，上思小香糯，紫香糯，洋县红香寸，无芒香糯，本地香糯；21-26：经FMbadh2-E7(C)检测在第7外显子8bp缺失的香稻材料，依次为Basmati370，Della，香玉1号，苏御糯，豫南香98，香米。

具体实施方式

以下通过具体实施例来进一步说明本发明。

实施例1：一种水稻香味基因新缺失位点的获得方法：

1.地方香稻品种在妙香糯叶片基因组DNA的提取

DNA提取方法主要参考卢扬江和郑康乐(1992)的方法，具体方法如下：将新鲜叶片2-3cm左右放入研钵，加入400μL DNA提取液，研磨，直至叶片磨碎，再加入400μL DNA提取液，混匀；加入500μL氯仿萃取液，盖紧盖子，上下颠倒混匀；11000rpm/min离心1分钟至清晰分相；吸取上清液400μL转入新的做好标记的1.5mL离心管中；加入800μL预冷的无水乙醇，盖紧盖子，上下颠倒混匀，12000rpm/min离心3分钟至沉淀附于离心管底部，弃上清液。75％乙醇洗涤沉淀，将1.5mL微量离心管倒置于平铺于桌上的纸上，自然干燥；最后加入100μL的1/10TE缓冲液溶解沉淀。

2.在妙香糯种子及叶片香味鉴定方法如下：

1)咀嚼法：将成熟糙米放入口中咀嚼来判别香味的有无。

2)氢氧化钾法：将2g左右供试材料的绿叶剪成碎片，放入小锥形瓶中，在每个装有样品的瓶内加10ml左右17g/L氢氧化钾溶液，立即盖上瓶盖，置于室温下10分钟，然后逐一打开培养皿，立即用鼻嗅之，鉴别植株叶片香味。

3.利用2个功能标记对香稻材料进行基因型检测

通过采用两个功能标记(Shi et al，2008)

功能标记FMbadh2-E2：

正向引物序列(5’-3’)为CCTCTGCTTCTGCCTCTGAT

反向引物序列(5’-3’)为GATTGCGCGGAGGTACTTG

功能标记FMbadh2-E7：

正向引物序列(5’-3’)为GGTTGCATTTACTGGGAGTT

反向引物序列(5’-3’)为CAGTGAAACAGGCTGTCAAG

对在秒香糯基因组DNA进行香味基因基因型检测，发现在妙香糯在两个功能位点都没有发生缺失，这表明控制该材料香味控制基因可能属于一个新的非等位香味基因或在相同基因内不同位点变异而导致香味的等位基因。

4.香味基因等位性验证

首先将在妙香糯与非香材料日本晴杂交，其F₁叶片表现出非香，而与香稻品种中香糯(籼稻，来源于中国河北，香味基因第7外显子存在8bp缺失)杂交，其杂交种子、F₁植株叶片及F₁所产生的种子都表现出香味，这表明控制在妙香糯的香味基因与中香糯香味基因等位，都是由于第八染色体上编码甜菜碱醛脱氢酶基因失活而导致的香味。

5.在妙香糯香味基因测序分析

首先采用9对测序引物如表1(引物序列信息参考Shi et al，2008)对在妙香糯badh2进行DNA扩增，扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶上电泳；使用TIANGEN公司所生产的DNA回收试剂盒回收DNA片段，并连接到pGEM-T Easy Vector(Promega)，并转化到DH5α感受态细胞后筛选阳性单克隆菌落，在含有氨苄抗生素的LB液体培养基上37℃培养12小时，将菌液送至上海英骏生物技术有限公司进行测序分析。

表1本实验所采用的香味基因测序引物

¹⁾PCR产物以日本晴为扩增模板

1)PCR的反应体系及程序具体方法如下：

反应体系含10×PCR buffer 1.0μL(含25mmolL^-1MgCl₂)，2mmolL^-1dNTPs0.8μL，5μmolL^-1正、反引物各1.0μL，Taq DNA聚合酶(2UμL^-1)0.25μL，模板DNA 1.0μL，ddH₂O 4.95μL。反应程序为：94℃模板预变性2min；94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃下延伸10min。

2)DNA扩增片段分离方法如下：

1.2％琼脂糖凝胶上恒压电泳分离，然后通过EB染色检测结果。

3)载体连接反应体系如下：

线性载体DNA约20ng，外源DNA片断约200ng，10×连接缓冲液2μL，T4DNA连接酶(5UμL^-1)1μL，加ddH₂O至20μL。

4)载体转化方法如下：

a.取一管低温保存的约50μL感受态细胞，冰浴中溶化，加入10μL连接产物，轻微摇荡混匀，冰浴30min；

b.42℃热击30s后迅速冰浴5分钟，加入800μL液体LB培养基，37℃震荡培养1h，使菌恢复正常生长状态；

c.将上述菌液3000rpm/min离心5min，弃上清液剩下约100μL左右的混合液涂布于LB固体培养基上(涂有氨苄，IPTG及X-gal混合液)，37℃培养12-16h，然后挑取阳性克隆用于测序分析，并设置阴性对照。

6.在妙香糯香味基因序列分析

采用Contig-Express软件对9个测序片段进行组装拼接。

拼接后完整的香味基因组序列与日本晴Badh2序列及其mRNA序列进行比对。其中日本晴Badh2序列引自网站www.gramene.org，Badh2的mRNA序列检索号为EU770322(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez)。序列比对分析在网站http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/index.html上进行。

通过对在妙香糯badh2序列与日本晴Badh2序列及其mRNA序列进行比对分析。在香味基因内部发现803bp的缺失的现象(距离基因转录起始位点1628bp与2430bp之间)，该缺失位点位于Badh2第4和第5外显子之间(对应于第4外显子90bp，第4内含子694bp，第5外显子19bp)(如图1)，以此认为Badh2内部803bp的缺失是导致香味的产生直接原因。

实施例2：水稻香味基因功能标记的开发及对部分香稻材料香味基因的检测

1.供试材料

本实验所研究的香稻材料列于表2中，包括22份香稻材料及4份非香稻材料。

表2本实验所研究的4份非香稻及22份香稻材料

注：-表示非香材料；+表示香味材料

2.22份香稻及4份非香稻材料香味鉴定

香味鉴定方法咀嚼法和氢氧化钾法同实施例1所述。

结果表明，22份香稻种子及叶片都表现出香味，4分非香稻材料都无香味。

3.DNA提取，PCR扩增分析

DNA提取方法及PCR扩增分析如实施例1所示。

4.香味基因功能标记的设计及合成

功能标记FMbadh2-E4-5采用Primer Premier 5.0软件进行合成。

FMbadh2-E4-5正反引物序列如下：

正向引物序列(5’-3’)为TGCTGGATGCTTTGAGTA，

反向引物序列(5’-3’)为GTTTAGCACACCTGAAGGAAGACCA。

5.功能标记对香/非香型水稻品种的基因型检测

结合Shi et al，2008报道的两个功能标记，利用上述3个功能标记，对22份香稻材料及4份非香稻材料香味基因内部特异性位点进行了检测。其中在4个非香稻品种中3个位点都没有发生缺失；在22份香稻材料，FMbadh2-E2、FMbadh2-E4-5和FMbadh2-E7等3个标记分别有8、8和6个材料在其特异性位点发生了缺失，结果表明利用功能标记可以很好地区分香与非香的水稻品种，可用于水稻香味基因标记辅助选择(图2)。

Claims

1.一种水稻香味基因，其特征在于所述的水稻香味基因与第八染色体上的编码甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2等位，所述的水稻香味基因与正常的Badh2相比在第4和5外显子之间发生了803bp的缺失，该缺失碱基位于基因转录起始密码子下游1628bp与2430bp之间，803bp缺失碱基对应于第4外显子90bp，第4内含子694bp和第5外显子19bp。

2.根据上述的水稻香味基因特异序列设计香味基因功能标记FMbadh2-E4-5，所述的FMbadh2-E4-5正反引物序列如下：

正向引物序列(5’-3’)为TGCTGGATGCTTTGAGTA，

反向引物序列(5’-3’)为GTTTAGCACACCTGAAGGAAGACCA。

3.如权利要求2所述的香味基因功能标记，其特征在于可用于对特定香稻材料香味基因进行分子标记辅助选择。