CN105063176A - 一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法，属于水稻遗传改良与农业生物技术应用领域。水稻育种中，将香味和红米结合选育优质特用稻，根据香味基因fgr对香与非香的差异和红米基因Rc对红米与白米的差异，开展了分子标记引物的改良、PCR反应体系的优化，建立了能同时检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法。本发明与单个基因的标记检测方法相比，能够对水稻种质资源或育种群体中香味基因fgr和红米基因Rc进行同步鉴定，并可在水稻抽穗前选择单株，用于杂交或回交等，从而提高育种效率，且具有成本低、准确率高等优点。

Description

一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法

技术领域

本发明涉及一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法，属于水稻遗传改良与农业生物技术应用领域。

背景技术

特种稻是具有特殊遗传性状和特殊用途的水稻,近年来成为研究开发的热点。特种稻香型红米品种,有补血、滋阴、开胃和中等功效，素称米中珍品，古代是地方官呈贡皇家的贡米。李时珍《本草纲目》记载：“糯稻，……其性粘，可以酿酒，可以为粢，可以蒸糕，可以熬饧，可以炒食。其类亦多，其谷壳有红、白二色，或有毛，或无毛。其米亦有赤、白二色，赤者酒多糟少”；“赤者粒大而香，水浸之有味；益人温中，益气补下元也；平和五脏，补益血气，其功不莫述”，赤米即红米。现代科研证明，红米、黑米等有色米含有大量人体所需要的营养元素，丰富的蛋白质，氨基酸等，每千克含氨基酸8.4%、蛋白质8.17%、含钙137.56mg、铁79.74mg、锌18.48mg、还含有硒、黄酮、色素和多种维生素，具有颇高的营养保健价值。能清除自由基、延缓衰老；改善营养性贫血；增强免疫力；具有降血脂、抗动脉粥样硬化功能；具有耐氧化、抗疲劳等应激功能；镇定和改善睡眠，加强神经中枢的抑制，对睡眠较差的老年人有催眠效果等，是少年和老年人食用的滋补佳品，也是食品加工、酿造和提取色素的优质原料，特别是红米有着特殊的营养保健功能，具有升高血浆高密度脂肪胆固醇，提高机体抗氧化能力的作用，很适宜于老年人补钙和儿童强筋壮骨。

目前，对水稻种皮红色素已有广泛的研究，结果表明红米的形成由于原花色素在种皮中沉积而形成，属于类黄酮物质,由Rc基因调控。Rc基因被定位于第7号染色体上，在白米种皮水稻材料中,该基因第6个外显子有14bp的碱基缺失,从而导致了该基因的功能丧失。红米对于白米为显性，从形态上淘汰白米植株需要多代，并因稻米成熟后才呈现红色，而育种则需要在抽穗时选株杂交或回交，所以难于当代选株育种。

香型水稻具有独特的香味且口感好，营养价值较高，其销售价格往往比普通大米要高出许多。控制香味的基因fgr位于8号染色体上，在第7个外显子中出现了一个8bp的缺失和3bp的变异，结果导致翻译提前终止，产生无功能的截短蛋白。

在香米育种中，十分关键的问题是对香味性状的准确鉴定，育种家常采用感官鉴定或用1.7%氢氧化钾鉴定的方法以提高香米选择的效率，然而这些方法在对大的群体进行选择时具有一定的局限性。

选育红米与香味相结合的优质高产品种，是特种稻主要育种目标之一。红米基因Rc与香味基因fgr位于不同染色体，有利于分子标记辅助选择进行组合育种。

中国发明“一种鉴定水稻香味的方法及香味性状共分离的分子标记”，申请号200810015264.9公开了一种鉴定水稻香味的方法，但还是通过嗅觉来进行的，有一定的局限性，鉴定不准。为实现对水稻香味基因fgr和红米基因Rc的快速鉴定，采用分子标记进行新品种选育将会是一项非常有实用价值的发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法，以实现对水稻香味基因fgr和红米基因Rc的快速鉴定。水稻育种中，将香味和红米结合选育优质特用稻，根据香味基因fgr对香与非香的差异和红米基因Rc对红米与白米的差异，开展了分子标记引物的改良、PCR反应体系的优化，建立了能同时检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法，构建了水稻香味基因fgr和红米基因Rc分子标记的多重PCR反应体系。

为实现上述发明的目的，本发明采用的技术方案如下：

一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法：

利用PCR反应体系中，同时加入香味基因fgr和红米基因Rc的两对特异引物，并对dNTPs浓度及引物浓度进行优化，在55.5℃的退火温度，扩增出清晰的带型。

所述的香味基因fgr的特异引物如下所示：

正向引物ff序列（5'-3'）为GGAGCTTGCTGATGTGTGTAAA，

反向引物fr序列（5'-3'）为GGAAACAAACCTTAACCATAG；

所述引物ff/fr扩增获得的DNA片段长度267bp为香味，DNA片段长度275bp为非香；该引物可以有效鉴定水稻第8染色体上香味基因fgr中第7外显子是否有8bp区段的缺失；

所述的水稻红米基因Rc的特异引物如下所示：

正向引物Rf序列（5'-3'）为CAGGCACCACACAGAGAATG，

反向引物Rr序列（5'-3'）为CTCCTCTCTTTCAGCACATGG；

所述引物Rf/Rr扩增获得的DNA片段长度161bp为白米，DNA片段长度175bp为红米；该引物可以有效鉴定水稻第7染色体上红米基因Rc中第6外显子是否有14bp区段的缺失。

所述的dNTPs浓度，在20μl体系中的each2.5mMdNTPs浓度最适用量为0.8μl。

所述的引物浓度，引物ff/fr终浓度为0.1μM，引物Rf/Rr终浓度为0.07μM。

本发明的有益效果是：与单个基因的标记检测方法相比，能够对水稻种质资源或育种群体中香味基因fgr和红米基因Rc进行同步鉴定，并可在水稻抽穗前选择单株，用于杂交或回交等，从而提高育种效率，且具有成本低、准确率高等优点。

附图说明

图1香味基因引物ff/fr的PCR检测结果；

图2红米基因引物Rf/Rr的PCR检测结果；

图3红米和香味基因多重PCR体系优化结果；

图4多重PCR体系不同型条带电泳图；

图1、图2和图4中的R6、A01、R45、R55和R52均为水稻参试品系；

图3中1-5、6-10和11-15分别排列为R6、A01、R45、R55和R52；

图4中Ⅰ型为红、非香型，Ⅱ型为白、非香型，Ⅲ型为白、香型，Ⅳ型为红、香型。

具体实施方式

下面通过实例对本发明做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1

单基因PCR反应体系

1.DNA提取：在田间水稻抽穗前抽取叶片，采用CTAB法提取DNA；

2.PCR体系均建立20μl体系，含：模板DNA2μl(20-50ng)，10Xbuffer2μl，25mMMg²⁺1.2μl，each2.5mMdNTPs0.4μl，5UTaq酶0.3μl，引物0.2μM，双蒸水补充至20μl；PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；然后94℃变性45s，55.5℃复性45s，72℃延伸1min,循环35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存；用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；

表1本实验采用的引物

3.红米与香米基因分子标记的两对引物在55.5℃的退火温度，均能扩增出清晰的带型，见图1和图2。

实施例2

多重PCR反应体系

1.构建多重PCR时，在单基因分子标记的PCR体系中其他成分不变的情况下，加入相等的两对引物，按单基因PCR反应体系和程序进行，用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。由于dNTPs浓度不足，红米基因分子标记的引物（Rf/Rr的GC%大于ff/fr，且红米基因的产物片段小于香米基因，因此PCR反应中可优先性结合模板合成产物，经电泳而检测出条带，而香米基因则不能检测出条带，见图3中1-5泳道。

2.多重PCR体系的dNTPs浓度优化：分别在20μl体系中的each2.5mMdNTPs浓度用量梯度为0.4μl、0.8μl和1.2μl。两对引物用量比为1:1，引物终浓度0.1μM条件下，dNTPs用量为0.4μl时，结果Rc基因扩增的带非常亮，fgr基因扩增的带却较弱，见图3中1-5泳道；dNTPs用量为1.2μl时，结果Rc基因扩增的带非常亮，fgr基因扩增的主带都非常亮，副带也非常亮，见图4；多重PCR体系的dNTPs浓度用量为0.8μl最合适，各条主带较均匀，见图3中6-10泳道。

3.多重PCR体系的引物浓度优化：在多重PCR体系最佳的dNTPs浓度下，通过调节两对引物的浓度比，使两个基因的扩增产物的亮度相当。由于dNTPs浓度一定时，两对引物用量为1:1，引物终浓度0.1μM条件下，fgr基因的扩增产物比Rc基因扩增产物的带要弱，因此通过降低Rc基因引物用量来调整引物浓度比，设计两个水平的引物浓度比：水平1的fgr基因引物/Rc基因引物之比为3:2，即引物ff/fr终浓度为0.1μM，引物Rf/Rf终浓度为0.07μM；水平2的fgr引物/Rc引物之比为2:1，即引物ff/fr终浓度0.1μM，引物Rf/Rr终浓度为0.05μM。PCR产物检测结果：图3中6-10泳道为引物浓度为水平1的电泳产物检测结果，两个基因的条带亮度较一致；而11-15泳道为引物浓度为水平2的电泳产物检测结果，两个基因的条带亮度不一致。

实施例3

检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR优化体系效果验证

多重PCR的检测结果可分为4种基本带型：Ⅰ型带即红、非香型（Rc/Rc，Fgr/Fgr）；Ⅱ型带即白、非香型（rc/rc，Fgr/Fgr）；Ⅲ型带即白、香型（rc/rc，fgr/fgr）；Ⅳ型带即红、香型（Rc/Rc，fgr/fgr），不同型条带见图4。

对32个水稻育种材料，经多重PCR的检测结果，分别扩增出Ⅰ型带14个；Ⅱ型带1个，香味基因表现为杂合型；Ⅲ型带4个和Ⅳ型带13个，其中1个表现为红米基因杂合型；未见出现香味基因和红米基因均为杂合型的材料。同时用单一分子标记PCR检测，所得结果相一致；也与田间检测方法：即抽穗时期用1.7%氢氧化钾浸泡新鲜叶片鉴定是否具有香味，并到稻穗成熟时目测鉴定种皮是否红色作比较，结果均相符。

序列表

SEQUENCELISTING

<110>广东海洋大学

<120>一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法

<160>4

<170>PatenInversion3.5

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>fgr引物ff

<400>1

GGAGCTTGCTGATGTGTGTAAA

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>fgr引物fr

<400>2

GGAAACAAACCTTAACCATAG

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Rc引物Rf

<400>3

CAGGCACCACACAGAGAATG

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Rc引物Rr

<400>4

CTCCTCTCTTTCAGCACATGG。

Claims (4)

1.一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法，其特征在于：

利用PCR反应体系中，同时加入香味基因fgr和红米基因Rc的两对特异引物，并对dNTPs浓度及引物浓度进行优化，在55.5℃的退火温度，扩增出清晰的带型。

2.根据权利要求1所述一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法，其特征在于：所述的香味基因fgr的特异引物如下所示：

正向引物ff序列（5'-3'）为GGAGCTTGCTGATGTGTGTAAA，

反向引物fr序列（5'-3'）为GGAAACAAACCTTAACCATAG；

所述引物ff/fr扩增获得的DNA片段长度267bp为香味，DNA片段长度275bp为非香；该引物可以有效鉴定水稻第8染色体上香味基因fgr中第7外显子是否有8bp区段的缺失；

所述的水稻红米基因Rc的特异引物如下所示：

正向引物Rf序列（5'-3'）为CAGGCACCACACAGAGAATG，

反向引物Rr序列（5'-3'）为CTCCTCTCTTTCAGCACATGG；

所述引物Rf/Rr扩增获得的DNA片段长度161bp为白米，DNA片段长度175bp为红米；该引物可以有效鉴定水稻第7染色体上红米基因Rc中第6外显子是否有14bp区段的缺失。

3.根据权利要求1所述一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法，其特征在于：所述的dNTPs浓度，在20μl体系中的each2.5mMdNTPs浓度最适用量为0.8μl。

4.根据权利要求1或2所述一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法，其特征在于：所述的引物浓度，引物ff/fr终浓度为0.1μM，引物Rf/Rr终浓度为0.07μM。