CN105063176A - 一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法,属于水稻遗传改良与农业生物技术应用领域。水稻育种中,将香味和红米结合选育优质特用稻,根据香味基因fgr对香与非香的差异和红米基因Rc对红米与白米的差异,开展了分子标记引物的改良、PCR反应体系的优化,建立了能同时检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法。本发明与单个基因的标记检测方法相比,能够对水稻种质资源或育种群体中香味基因fgr和红米基因Rc进行同步鉴定,并可在水稻抽穗前选择单株,用于杂交或回交等,从而提高育种效率,且具有成本低、准确率高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法,属于水稻遗传改良与农业生物技术应用领域。
背景技术
特种稻是具有特殊遗传性状和特殊用途的水稻,近年来成为研究开发的热点。特种稻香型红米品种,有补血、滋阴、开胃和中等功效,素称米中珍品,古代是地方官呈贡皇家的贡米。李时珍《本草纲目》记载:“糯稻,……其性粘,可以酿酒,可以为粢,可以蒸糕,可以熬饧,可以炒食。其类亦多,其谷壳有红、白二色,或有毛,或无毛。其米亦有赤、白二色,赤者酒多糟少”;“赤者粒大而香,水浸之有味;益人温中,益气补下元也;平和五脏,补益血气,其功不莫述”,赤米即红米。现代科研证明,红米、黑米等有色米含有大量人体所需要的营养元素,丰富的蛋白质,氨基酸等,每千克含氨基酸8.4%、蛋白质8.17%、含钙137.56mg、铁79.74mg、锌18.48mg、还含有硒、黄酮、色素和多种维生素,具有颇高的营养保健价值。能清除自由基、延缓衰老;改善营养性贫血;增强免疫力;具有降血脂、抗动脉粥样硬化功能;具有耐氧化、抗疲劳等应激功能;镇定和改善睡眠,加强神经中枢的抑制,对睡眠较差的老年人有催眠效果等,是少年和老年人食用的滋补佳品,也是食品加工、酿造和提取色素的优质原料,特别是红米有着特殊的营养保健功能,具有升高血浆高密度脂肪胆固醇,提高机体抗氧化能力的作用,很适宜于老年人补钙和儿童强筋壮骨。
目前,对水稻种皮红色素已有广泛的研究,结果表明红米的形成由于原花色素在种皮中沉积而形成,属于类黄酮物质,由Rc基因调控。Rc基因被定位于第7号染色体上,在白米种皮水稻材料中,该基因第6个外显子有14bp的碱基缺失,从而导致了该基因的功能丧失。红米对于白米为显性,从形态上淘汰白米植株需要多代,并因稻米成熟后才呈现红色,而育种则需要在抽穗时选株杂交或回交,所以难于当代选株育种。
香型水稻具有独特的香味且口感好,营养价值较高,其销售价格往往比普通大米要高出许多。控制香味的基因fgr位于8号染色体上,在第7个外显子中出现了一个8bp的缺失和3bp的变异,结果导致翻译提前终止,产生无功能的截短蛋白。
在香米育种中,十分关键的问题是对香味性状的准确鉴定,育种家常采用感官鉴定或用1.7%氢氧化钾鉴定的方法以提高香米选择的效率,然而这些方法在对大的群体进行选择时具有一定的局限性。
选育红米与香味相结合的优质高产品种,是特种稻主要育种目标之一。红米基因Rc与香味基因fgr位于不同染色体,有利于分子标记辅助选择进行组合育种。
中国发明“一种鉴定水稻香味的方法及香味性状共分离的分子标记”,申请号200810015264.9公开了一种鉴定水稻香味的方法,但还是通过嗅觉来进行的,有一定的局限性,鉴定不准。为实现对水稻香味基因fgr和红米基因Rc的快速鉴定,采用分子标记进行新品种选育将会是一项非常有实用价值的发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法,以实现对水稻香味基因fgr和红米基因Rc的快速鉴定。水稻育种中,将香味和红米结合选育优质特用稻,根据香味基因fgr对香与非香的差异和红米基因Rc对红米与白米的差异,开展了分子标记引物的改良、PCR反应体系的优化,建立了能同时检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法,构建了水稻香味基因fgr和红米基因Rc分子标记的多重PCR反应体系。
为实现上述发明的目的,本发明采用的技术方案如下:
一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法:
利用PCR反应体系中,同时加入香味基因fgr和红米基因Rc的两对特异引物,并对dNTPs浓度及引物浓度进行优化,在55.5℃的退火温度,扩增出清晰的带型。
所述的香味基因fgr的特异引物如下所示:
正向引物ff序列(5'-3')为GGAGCTTGCTGATGTGTGTAAA,
反向引物fr序列(5'-3')为GGAAACAAACCTTAACCATAG;
所述引物ff/fr扩增获得的DNA片段长度267bp为香味,DNA片段长度275bp为非香;该引物可以有效鉴定水稻第8染色体上香味基因fgr中第7外显子是否有8bp区段的缺失;
所述的水稻红米基因Rc的特异引物如下所示:
正向引物Rf序列(5'-3')为CAGGCACCACACAGAGAATG,
反向引物Rr序列(5'-3')为CTCCTCTCTTTCAGCACATGG;
所述引物Rf/Rr扩增获得的DNA片段长度161bp为白米,DNA片段长度175bp为红米;该引物可以有效鉴定水稻第7染色体上红米基因Rc中第6外显子是否有14bp区段的缺失。
所述的dNTPs浓度,在20μl体系中的each2.5mMdNTPs浓度最适用量为0.8μl。
所述的引物浓度,引物ff/fr终浓度为0.1μM,引物Rf/Rr终浓度为0.07μM。
本发明的有益效果是:与单个基因的标记检测方法相比,能够对水稻种质资源或育种群体中香味基因fgr和红米基因Rc进行同步鉴定,并可在水稻抽穗前选择单株,用于杂交或回交等,从而提高育种效率,且具有成本低、准确率高等优点。
附图说明
图1香味基因引物ff/fr的PCR检测结果;
图2红米基因引物Rf/Rr的PCR检测结果;
图3红米和香味基因多重PCR体系优化结果;
图4多重PCR体系不同型条带电泳图;
图1、图2和图4中的R6、A01、R45、R55和R52均为水稻参试品系;
图3中1-5、6-10和11-15分别排列为R6、A01、R45、R55和R52;
图4中Ⅰ型为红、非香型,Ⅱ型为白、非香型,Ⅲ型为白、香型,Ⅳ型为红、香型。
具体实施方式
下面通过实例对本发明做进一步详细说明,这些实例仅用来说明本发明,并不限制本发明的范围。
实施例1
单基因PCR反应体系
1.DNA提取:在田间水稻抽穗前抽取叶片,采用CTAB法提取DNA;
2.PCR体系均建立20μl体系,含:模板DNA2μl(20-50ng),10Xbuffer2μl,25mMMg2+1.2μl,each2.5mMdNTPs0.4μl,5UTaq酶0.3μl,引物0.2μM,双蒸水补充至20μl;PCR扩增反应程序为:95℃预变性5min;然后94℃变性45s,55.5℃复性45s,72℃延伸1min,循环35个循环;最后72℃延伸7min,4℃保存;用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测;
表1本实验采用的引物
3.红米与香米基因分子标记的两对引物在55.5℃的退火温度,均能扩增出清晰的带型,见图1和图2。
实施例2
多重PCR反应体系
1.构建多重PCR时,在单基因分子标记的PCR体系中其他成分不变的情况下,加入相等的两对引物,按单基因PCR反应体系和程序进行,用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。由于dNTPs浓度不足,红米基因分子标记的引物(Rf/Rr的GC%大于ff/fr,且红米基因的产物片段小于香米基因,因此PCR反应中可优先性结合模板合成产物,经电泳而检测出条带,而香米基因则不能检测出条带,见图3中1-5泳道。
2.多重PCR体系的dNTPs浓度优化:分别在20μl体系中的each2.5mMdNTPs浓度用量梯度为0.4μl、0.8μl和1.2μl。两对引物用量比为1:1,引物终浓度0.1μM条件下,dNTPs用量为0.4μl时,结果Rc基因扩增的带非常亮,fgr基因扩增的带却较弱,见图3中1-5泳道;dNTPs用量为1.2μl时,结果Rc基因扩增的带非常亮,fgr基因扩增的主带都非常亮,副带也非常亮,见图4;多重PCR体系的dNTPs浓度用量为0.8μl最合适,各条主带较均匀,见图3中6-10泳道。
3.多重PCR体系的引物浓度优化:在多重PCR体系最佳的dNTPs浓度下,通过调节两对引物的浓度比,使两个基因的扩增产物的亮度相当。由于dNTPs浓度一定时,两对引物用量为1:1,引物终浓度0.1μM条件下,fgr基因的扩增产物比Rc基因扩增产物的带要弱,因此通过降低Rc基因引物用量来调整引物浓度比,设计两个水平的引物浓度比:水平1的fgr基因引物/Rc基因引物之比为3:2,即引物ff/fr终浓度为0.1μM,引物Rf/Rf终浓度为0.07μM;水平2的fgr引物/Rc引物之比为2:1,即引物ff/fr终浓度0.1μM,引物Rf/Rr终浓度为0.05μM。PCR产物检测结果:图3中6-10泳道为引物浓度为水平1的电泳产物检测结果,两个基因的条带亮度较一致;而11-15泳道为引物浓度为水平2的电泳产物检测结果,两个基因的条带亮度不一致。
实施例3
检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR优化体系效果验证
多重PCR的检测结果可分为4种基本带型:Ⅰ型带即红、非香型(Rc/Rc,Fgr/Fgr);Ⅱ型带即白、非香型(rc/rc,Fgr/Fgr);Ⅲ型带即白、香型(rc/rc,fgr/fgr);Ⅳ型带即红、香型(Rc/Rc,fgr/fgr),不同型条带见图4。
对32个水稻育种材料,经多重PCR的检测结果,分别扩增出Ⅰ型带14个;Ⅱ型带1个,香味基因表现为杂合型;Ⅲ型带4个和Ⅳ型带13个,其中1个表现为红米基因杂合型;未见出现香味基因和红米基因均为杂合型的材料。同时用单一分子标记PCR检测,所得结果相一致;也与田间检测方法:即抽穗时期用1.7%氢氧化钾浸泡新鲜叶片鉴定是否具有香味,并到稻穗成熟时目测鉴定种皮是否红色作比较,结果均相符。
序列表
SEQUENCELISTING
<110>广东海洋大学
<120>一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法
<160>4
<170>PatenInversion3.5
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>fgr引物ff
<400>1
GGAGCTTGCTGATGTGTGTAAA
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>fgr引物fr
<400>2
GGAAACAAACCTTAACCATAG
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Rc引物Rf
<400>3
CAGGCACCACACAGAGAATG
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Rc引物Rr
<400>4
CTCCTCTCTTTCAGCACATGG。
Claims (4)
1.一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法,其特征在于:
利用PCR反应体系中,同时加入香味基因fgr和红米基因Rc的两对特异引物,并对dNTPs浓度及引物浓度进行优化,在55.5℃的退火温度,扩增出清晰的带型。
2.根据权利要求1所述一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法,其特征在于:所述的香味基因fgr的特异引物如下所示:
正向引物ff序列(5'-3')为GGAGCTTGCTGATGTGTGTAAA,
反向引物fr序列(5'-3')为GGAAACAAACCTTAACCATAG;
所述引物ff/fr扩增获得的DNA片段长度267bp为香味,DNA片段长度275bp为非香;该引物可以有效鉴定水稻第8染色体上香味基因fgr中第7外显子是否有8bp区段的缺失;
所述的水稻红米基因Rc的特异引物如下所示:
正向引物Rf序列(5'-3')为CAGGCACCACACAGAGAATG,
反向引物Rr序列(5'-3')为CTCCTCTCTTTCAGCACATGG;
所述引物Rf/Rr扩增获得的DNA片段长度161bp为白米,DNA片段长度175bp为红米;该引物可以有效鉴定水稻第7染色体上红米基因Rc中第6外显子是否有14bp区段的缺失。
3.根据权利要求1所述一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法,其特征在于:所述的dNTPs浓度,在20μl体系中的each2.5mMdNTPs浓度最适用量为0.8μl。
4.根据权利要求1或2所述一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法,其特征在于:所述的引物浓度,引物ff/fr终浓度为0.1μM,引物Rf/Rr终浓度为0.07μM。
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