KR20190086426A - 향미 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 향미 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 향미 품종 판별용 프라이머 세트는 Badh2 유전자 5' UTR의 3bp 결실로 인한 변이; 엑손 2의 7bp 결실로 인한 변이; 엑손 7의 8bp 결실로 인한 변이; 엑손 12의 3bp 결실로 인한 변이; 엑손 13의 3bp 삽입으로 인한 변이; 및 엑손 14의 1bp 삽입으로 인한 변이;로 구성된 군에선 선택된 하나 이상의 변이를 포함하는 Badh2 유전자의 변이를 특이적으로 검출할 수 있으므로, 일반 벼 품종과 향미 품종을 보다 신속, 정확하게 판별할 수 있는 효과가 있다.
또한, 엑손 14의 1bp 삽입으로 Badh2 유전자 변이를 검출할 수 있는 프라이머 세트는 인공교배로 제조된 F2 세대에서 향기 특성을 가진 품종을 정확하게 판별할 수 있으므로, 향미 품종의 개량에 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 엑손 14의 1bp 삽입으로 Badh2 유전자 변이를 검출할 수 있는 프라이머 세트는 인공교배로 제조된 F2 세대에서 향기 특성을 가진 품종을 정확하게 판별할 수 있으므로, 향미 품종의 개량에 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 향미(香米) 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 향미 품종에서 베타인 알데히드탈수소효소 유전자(Betaine aldehyde dehydrogenase gene; badh2)의 기능성 대립유전자(functional alleles)에 염기의 치환, 결실 및 삽입에 의해 발생한 변이를 특이적으로 검출하는 프라이머 세트, 이를 이용한 향미 품종 판별방법 및 향미 품종 판별 키트에 관한 것이다.
벼는 밀 다음으로 세계 제2의 식량작물이며 세계 인구의 절반 이상이 쌀을 주식으로 하고 있는 작물로서 아시아에서 90%이상 생산되고 대부분이 아시아에서 소비되고 있다. 한국도 다른 아시아 국가들과 같이 쌀을 주식으로 하고 있으며 또한 해마다 15∼20 품종씩 신품종이 육성, 보급되고 있으나 국내에 보급되고 있는 품종들은 대부분이 특정 품종으로 소개되고 있어 국내 소비자의 대부분은 이들 품종에 대한 확인이 불가능한 실정이다.
또한 수출입 개방에 따라 일부 유통업자들은 수입 쌀을 국내산으로 또는 국내산에 수입 쌀을 혼합하여 공급하고 있으며 이러한 불법 유통을 방지하기 위하여 정부에서는 원산지 표기를 제도화하고 있으나 실제 원산지 허위 표기의 적발에는 유통경로의 추적 및 원산지 확인 등의 복잡한 절차를 거쳐야 하는 등 매우 어려움을 겪고 있는 실정이다. 더구나 최근 일부 농촌지역에서 발생하는 수확물의 도난사건 등 벼 품종과 관련된 고소, 고발 사건에 대한 보다 과학적인 수사기법이 필요한 실정이므로 국내에서 육성되어 재배되고 있는 벼 품종들을 신속하고 간편하게 판별할 수 있는 방법이나 기술의 확립이 절실하다고 하겠다.
최근 벼 유전자원은 유용 형질 보존 및 신품종 창출에 매우 중요한 재료로 이용되고 있는바, 국내 고유 자원과 국외 자원의 수집과 함께 수집된 유전자원의 신속한 종간 및 아종간 품종 판별은 정확한 유전자원관리 및 보호를 위하여 매우 중요하다.
최근에 여러 가지 DNA 마커를 이용하여 벼 품종을 식별하기 위한 많은 연구가 진행되었다. 지금까지, RAPD(random amplified polymorphic DNA), AFLP(amplified fragment length polymorphism)와 마이크로세틀라이트(microsatellite) 방법이 품종을 식별하는데 사용되어 왔다. 예를 들어, Wang 등은 RFLP(restricted fragment length polymorphism) 마커를 이용하여 품종을 식별하였고(Wang, Z.Y., Tanksley, S.D. 1989 L. Genome. 32, 1113-1118), Ryu는 단백질 모세관 전기영동 방법을 이용하여 품종을 식별하였다(Ryu, D.J. 1998 J. food science and nutrition. 3, 43-347). RAPD, 마이크로세틀라이트, STS(sequence tagged site), 그리고 PCR (polymerase chain reaction) 방법으로 국내산 40개 품종을 식별하고, 각 방법의 장단점을 비교하여 보고된 바가 있다(Jeong O.Y. et al., Korean 1998 J. Breed. 30, 136-137). RAPD와 마이크로세틀라이트를 이용하여 31개 벼 품종의 식별을 보여주었고(Kwon, S.J. et al., 1999 Korean J Crop Science 44, 112-116), 화상분석기술을 이용한 벼 품종의 식별 방법을 보고하였다(Kwon, S.J. et al., 1998 Korean J Crop Science 43, 33-34).
한편, 향기나는 벼(이하 향미; aromatic rice, fragrant rice)은 밥을 지을 때 옥수수를 튀기거나 콩을 삶을 때처럼 진한 냄새를 풍기는 쌀로, 향미라고 불리우기도 하는 향기나는 쌀의 구수한 냄새는 갓 찧은 쌀이나 현미 상태에서도 나고 벼의 잎이나 줄기, 꽃가루에서도 강하게 난다. 향미는 파키스탄, 인도, 스리랑카, 네팔, 타이, 필리핀, 중국 등 아시아 여러 나라에서 오랫동안 재배해 왔다. 이슬람교 국가에서는 종교적 행사의식이 있을 때 향미를 쓰기도 한다. 향미 벼는 타이나 일본의 재래벼에서도 발견되는데 재래 품종에서는 거의 자취를 감추었다. 최근에는 우리나라에서도 육종연구진에 의해 '향미벼 1호'라는 품종을 시작으로 '향남벼', '향미벼 2호'가 개발되어 보급되었다. 향미로 술을 만들면 발효과정 중에 향기가 증발하지만 식혜의 경우엔 식혜 맛과 구수한 숭늉 같은 맛이 조화되어 독특한 맛을 연출한다. 또한 향미 중에는 찹쌀 품종이나 유색미 품종이 있어서 식품으로서의 활용도가 매우 다양하다.
향기가 나는 벼의 주요한 방향 화합물은 2-아세틸-1-피롤린(2-acetyl-1-pyrroline; 2AP)인 것으로 알려져 있으며, 상기 화합물은 벼(rice)의 염색체 8(chromosome 8)에 존재하는 베타인 알데히드탈수소효소 유전자(Betaine aldehyde dehydrogenase gene; Badh2)의 염기의 치환, 결실 및 삽입 등으로 인한 변이가 발생하여 기능을 상실했기 때문인 것으로 조사되었다 (미국등록특허 제7847083호).
종래 기술 중의 하나인 미국등록특허 제731918호에서는 2-아세틸-1-피롤린의 발현을 증가시키기 위해 Os2AP 유전자의 발현을 감소시킨 형질전환 벼를 제조하기도 하였으며, 한국등록특허 제1054459호에서는 향미벼1호, 향미벼 2호, 향남벼 및 미향벼 등의 향미 품종을 포함하는 다양한 벼 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공하고 있다.
또한, 중국등록특허 제101736018호 및 중국공개특허 제103725778호 등 대다수의 문헌에서는 염기의 결실 또는 삽입에 의해 발생한 Badh2 유전자 변이를 검출하는 프라이머 세트에 대해 개시하고 있지만, Badh2 유전자에 존재하는 많은 수의 기능적 돌연변이로 입증된 단상형(haplotype)의 대다수는 일반적인 PCR 기반 마커에 의해 검출되지 못하는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 Badh2 유전자에 존재하는 기능적 돌연변이로 입증된 단상형(haplotype)을 효과적으로 검출하는 프라이머를 선별하여 향미 품종을 효과적으로 판별하기 위해 예의 노력한 결과, Badh2 유전자 5' UTR의 3bp 결실부분, 엑손 2의 7bp 결실부분, 엑손 7의 8bp 결실부분, 엑손 12의 3bp 결실부분, 엑손 13의 3bp 삽입부분 및 엑손 14의 1bp 삽입부분이 포함된 염기부분을 특이적으로 검출할 수 있는 5개의 프라이머 세트를 선별하였으며, 그 중 엑손 14의 1bp 삽입부분을 검출하는 프라이머 세트는 F2 세대에서 향기 특성을 가진 품종을 정확하게 판별할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는 향미 품종 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 향미 품종 판별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 해결하려는 과제는 상기 향미 품종 판별용 프라이머 세트를 포함하는 향미 품종 판별용 키트를 제공하는 것이다.
상술한 본 발명의 첫번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트;로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 향미 품종 판별용 프라이머 세트를 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 향미 품종 판별용 프라이머 세트는 벼의 염색체 8번에 존재하는 베타인 알데히드탈수소효소 유전자(Betaine aldehyde dehydrogenase gene; Badh2)(genbank accession no. AB096083 또는 서열번호 11)의 염기 결실(deletion) 또는 삽입(insertion)으로 인해 발생한 변이를 특이적으로 검출 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트는 서열번호 11(genbank accession no. AB096083)로 표시되는 Badh2 유전자의 19 번째 염기 내지 181 번째 염기를 특이적으로 증폭시켜, Badh2 유전자 5' UTR 부분의 3bp(base pair)가 결실된 변이를 검출할 수 있으며,
상기 증폭된 염기서열의 길이는 일반 벼 품종의 경우 163bp, 향미 품종의 경우 160bp일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트는 서열번호 11(genbank accession no. AB096083)로 표시되는 Badh2 유전자의 414 번째 염기 내지 491 번째 염기를 특이적으로 증폭시켜, Badh2 유전자 엑손 2 부분의 7bp가 결실된 변이를 검출할 수 있으며,
상기 증폭된 염기서열의 길이는 일반 벼 품종의 경우 78bp, 향미 품종의 경우 71bp일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트는 서열번호 11(genbank accession no. AB096083)로 표시되는 Badh2 유전자의 2933 번째 염기 내지 3083 번째 염기를 특이적으로 증폭시켜, Badh2 유전자 엑손 7 부분의 8bp가 결실된 변이를 검출할 수 있으며,
상기 증폭된 염기서열의 길이는 일반 벼 품종의 경우 151bp, 향미 품종의 경우 143bp일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트는 서열번호 11(genbank accession no. AB096083)로 표시되는 Badh2 유전자의 5206 번째 염기 내지 5397 번째 염기를 특이적으로 증폭시켜, Badh2 유전자 엑손 12 부분의 3bp가 결실된 변이 또는 엑손 13 부분의 3bp가 삽입된 변이를 검출할 수 있으며,
상기 증폭된 염기서열의 길이는 일반 벼 품종의 경우 192bp, 향미 품종의 Badh2 유전자 엑손 12 부분에 변이가 존재하는 경우 189bp, 향미 품종의 Badh2 유전자 엑손 13 부분에 변이가 존재하는 경우 195bp일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트는 서열번호 11(또는 genbank accession no. AB096083)로 표시되는 Badh2 유전자의 5715 번째 염기 내지 5979 번째 염기를 특이적으로 증폭시켜, Badh2 유전자 엑손 14 부분의 1bp가 삽입된 변이를 검출할 수 있으며,
상기 증폭된 염기서열의 길이는 일반 벼 품종의 경우 265bp, 향미 품종의 경우 266bp일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트는 RFLP(restricted fragment length polymorphism) 마커이며, 상기 프라이머 세트에 의해 증폭된 증폭 산물에 제한효소 BslⅠ 처리하여 반응시킬 경우, 일반 벼 품종의 경우 60bp 및 205bp, 향미 품종의 경우 266bp의 증폭산물이 생성될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트는 RFLP(restricted fragment length polymorphism) 방법을 사용하여 인공적으로 교배한 F2 세대에서 향미 품종의 유전자형(genotype)을 구별할 수 있으며,
향미 품종의 경우 266bp, 일반 벼 품종의 경우 205bp, 이형접합(heterozygous) 일반 벼 품종의 경우 205bp 및 266bp 길이의 증폭산물을 생성시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 일반 벼 품종 또는 향미 품종의 시료에서 DNA를 분리하고, 증폭반응을 수행하여 벼의 염색체 8번에 위치하는 베타인 알데히드탈수소효소 유전자(Betaine aldehyde dehydrogenase gene; Badh2)를 증폭하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 증폭된 Badh2 유전자를 주형(template)으로 하고, 상기 향미 품종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 증폭반응에 의해 생성된 증폭산물의 염기서열 길이를 분석하여 염기 결실 또는 삽입에 의한 변이를 검출하는 단계;
를 포함하는 향미의 품종 판별 방법을 포함한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계에서 Badh2 유전자는 서열번호 12 및 서열번호 13의 프라이머 세트; 서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머 세트; 서열번호 16 및 서열번호 17의 프라이머 세트; 서열번호 18 및 서열번호 19의 프라이머 세트; 서열번호 20 및 서열번호 21의 프라이머 세트; 서열번호 22 및 서열번호 23의 프라이머 세트; 서열번호 24 및 서열번호 25의 프라이머 세트; 서열번호 26 및 서열번호 27의 프라이머 세트; 서열번호 28 및 서열번호 29의 프라이머 세트; 서열번호 30 및 서열번호 31의 프라이머 세트;로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 (b) 단계에서 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트를 사용하여 증폭반응을 수행하는 경우, 증폭산물의 염기서열 길이는 일반 벼 품종의 경우 163bp, 향미 품종의 경우 160bp이며,
서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 사용하여 증폭반응을 수행하는 경우, 증폭산물의 염기서열 길이는 일반 벼 품종의 경우 78bp, 향미 품종의 경우 71bp이며,
서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트를 사용하여 증폭반응을 수행하는 경우, 증폭산물의 염기서열 길이는 일반 벼 품종의 경우 151bp, 향미 품종의 경우 143bp이며,
서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트를 사용하여 증폭반응을 수행하는 경우, 증폭산물의 염기서열 길이는 일반 벼 품종의 경우 192bp, 향미 품종의 경우 189bp 또는 195bp이며,
서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트를 사용하여 증폭반응을 수행하는 경우, 증폭산물의 염기서열 길이는 일반 벼 품종의 경우 265bp, 향미 품종의 경우 266bp일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 (b) 단계에서 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하는 경우, 증폭 반응에 의해 생성된 증폭산물에 제한효소 BslⅠ을 처리하여 반응시키는 단계;를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 제한효소 처리에 의해 일반 벼 품종의 경우 60bp 및 205bp, 향미 품종의 경우 266bp의 증폭산물이 생성될 수 있다.
두번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트;로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 향미 품종 판별용 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 을 포함하는 향미 품종 판별용 키트를 포함한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP); DNA 중합효소; 및 완충액(buffer solution);으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 향미 품종의 Badh2 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트;를 더 포함할 수 있으며,
상기 프라이머 세트는 서열번호 12 및 서열번호 13의 프라이머 세트; 서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머 세트; 서열번호 16 및 서열번호 17의 프라이머 세트; 서열번호 18 및 서열번호 19의 프라이머 세트; 서열번호 20 및 서열번호 21의 프라이머 세트; 서열번호 22 및 서열번호 23의 프라이머 세트; 서열번호 24 및 서열번호 25의 프라이머 세트; 서열번호 26 및 서열번호 27의 프라이머 세트; 서열번호 28 및 서열번호 29의 프라이머 세트; 서열번호 30 및 서열번호 31의 프라이머 세트;로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명의 향미 품종 판별용 프라이머 세트는 Badh2 유전자 5' UTR의 3bp 결실로 인한 변이; 엑손 2의 7bp 결실로 인한 변이; 엑손 7의 8bp 결실로 인한 변이; 엑손 12의 3bp 결실로 인한 변이; 엑손 13의 3bp 삽입으로 인한 변이; 및 엑손 14의 1bp 삽입으로 인한 변이;로 구성된 군에선 선택된 하나 이상의 변이를 포함하는 Badh2 유전자의 변이를 특이적으로 검출할 수 있으므로, 일반 벼 품종과 향미 품종을 보다 신속, 정확하게 판별할 수 있는 효과가 있다.
또한, 엑손 14의 1bp 삽입으로 Badh2 유전자 변이를 검출할 수 있는 프라이머 세트는 인공교배로 제조된 F2 세대에서 향기 특성을 가진 품종을 정확하게 판별할 수 있으므로, 향미 품종의 개량에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 분석한 향미 품종을 포함하는 45개의 벼 품종의 유래를 표시한 모식도이다.
도 2는 15개의 엑손(녹색 박스)과 14개의 인트론(회색 박스)로 구성되어 있는 기능 badh2 유전자의 7가지의 대립 유전자에 대한 모식도이다(a : badh2-UTR-E7/ 엑손7에 8bp의 결실과 5' UTR에 3bp의 결실을 가짐 , b : badh2-E2/ 엑손2에 7bp의 결실을 가짐, c : badh2-E7/ 엑손7에 8bp의 결실을 가짐, d : badh2-E12/ 엑손12에 3bp의 결실을 가짐, e : badh2-E13/ 엑손 13에 3bp의 삽입을 가짐, f : badh2-E13.2/ 엑손13에 하나의 C/T SNP를 가짐, g : badh2-E14/ 엑손14에 1bp의 삽입을 가짐).
도 3은 도 2는 badh2와 badh2-E12의 아미노산 서열을 정렬하여 나타낸 것이다.
도 4는 도 3은 5개의 기능 마커를 이용하여 향미 9품종(4-12 레인)과 일반 벼 3품종(1-3 레인)에 대하여 유전자형 분석을 실시한 사진이다(A : FMU1-2 마커를 이용하여 4-5 레인 5'UTR에서 3bp 결실을 확인, B : FME2-7 마커를 이용하여 6-7 레인 엑손2에서 7bp 결실을 확인, C : FME7 마커를 이용하여 4-5 및 8-9 레인 엑손 7에서 8bp 결실을 확인, D : FME12-3 마커를 이용하여 10레인 엑손 12의 3bp 결실 및 11-12 레인 엑손 13에서 3bp의 삽입을 확인, E : CAPs 마커 FME14Ⅰ 및 제한효소 BslⅠ을 이용하여 13-14레인 엑손 14의 1bp 삽입을 확인).
도 5는 향기가 나지 않는 일반미와 Ar-30 품종(badh2-E14 대립 유전자를 가짐) 사이에서 그리고 동진-wx(야생형)과 몽돈재래(엑손 12에 3bp 결실)사이에서 교배되어 얻어진 F2의 유전자형을 각각 분석하기 위하여, 기능 마커 FME14Ⅰ(서열번호 9 및 10)과 FME12-3(서열번호 7 및 8)를 사용하여 PCR을 수행한 후 각각의 PCR 산물을 전기영동한 사진이다(A: 향기나지 않는 일반미와 Ar-30 를 교배한 F2에 대하여 FME14Ⅰ프라이머로 유전자형을 분석한 사진, B : 동진-wx(야생형)과 몽돈재래(엑손 12에 3bp 결실)를 교배한 F2에 대하여 FME12-3 프라이머로 유전자형을 분석한 사진).
도 2는 15개의 엑손(녹색 박스)과 14개의 인트론(회색 박스)로 구성되어 있는 기능 badh2 유전자의 7가지의 대립 유전자에 대한 모식도이다(a : badh2-UTR-E7/ 엑손7에 8bp의 결실과 5' UTR에 3bp의 결실을 가짐 , b : badh2-E2/ 엑손2에 7bp의 결실을 가짐, c : badh2-E7/ 엑손7에 8bp의 결실을 가짐, d : badh2-E12/ 엑손12에 3bp의 결실을 가짐, e : badh2-E13/ 엑손 13에 3bp의 삽입을 가짐, f : badh2-E13.2/ 엑손13에 하나의 C/T SNP를 가짐, g : badh2-E14/ 엑손14에 1bp의 삽입을 가짐).
도 3은 도 2는 badh2와 badh2-E12의 아미노산 서열을 정렬하여 나타낸 것이다.
도 4는 도 3은 5개의 기능 마커를 이용하여 향미 9품종(4-12 레인)과 일반 벼 3품종(1-3 레인)에 대하여 유전자형 분석을 실시한 사진이다(A : FMU1-2 마커를 이용하여 4-5 레인 5'UTR에서 3bp 결실을 확인, B : FME2-7 마커를 이용하여 6-7 레인 엑손2에서 7bp 결실을 확인, C : FME7 마커를 이용하여 4-5 및 8-9 레인 엑손 7에서 8bp 결실을 확인, D : FME12-3 마커를 이용하여 10레인 엑손 12의 3bp 결실 및 11-12 레인 엑손 13에서 3bp의 삽입을 확인, E : CAPs 마커 FME14Ⅰ 및 제한효소 BslⅠ을 이용하여 13-14레인 엑손 14의 1bp 삽입을 확인).
도 5는 향기가 나지 않는 일반미와 Ar-30 품종(badh2-E14 대립 유전자를 가짐) 사이에서 그리고 동진-wx(야생형)과 몽돈재래(엑손 12에 3bp 결실)사이에서 교배되어 얻어진 F2의 유전자형을 각각 분석하기 위하여, 기능 마커 FME14Ⅰ(서열번호 9 및 10)과 FME12-3(서열번호 7 및 8)를 사용하여 PCR을 수행한 후 각각의 PCR 산물을 전기영동한 사진이다(A: 향기나지 않는 일반미와 Ar-30 를 교배한 F2에 대하여 FME14Ⅰ프라이머로 유전자형을 분석한 사진, B : 동진-wx(야생형)과 몽돈재래(엑손 12에 3bp 결실)를 교배한 F2에 대하여 FME12-3 프라이머로 유전자형을 분석한 사진).
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 향미의 Badh2 유전자 변이를 검출하기 위해 종래 기술에서 염기의 결실 또는 삽입에 의해 발생한 Badh2 유전자 변이를 검출하는 프라이머 세트에 대해 개시하고 있지만, Badh2 유전자에 존재하는 많은 수의 기능적 돌연변이로 입증된 단상형(haplotype)의 대다수는 일반적인 PCR 기반 마커에 의해 검출되지 못하는 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트;로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 향미 품종 판별용 프라이머 세트를 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 일반 벼 품종과 향미 품종을 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 신규 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 판별방법을 제공할 수 있다.
본 발명에서 '품종'(accession)이란 품종, 종, 고세대계통 및 중간모본을 모두 아우르는 말로 사용된다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트;로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 향미 품종 판별용 프라이머 세트를 포함한다.
본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3'-hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사 효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형이 가능하다. 이러한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 당업계에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제작하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 "프라이머(primer)"는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건(4가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다.
상기 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 80 내지 500bp의 길이로 사용할 수 있다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybridcomplex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적인 것을 사용할 수 있다.
상기 "향미"에서 주요한 방향 화합물은 2-아세틸-1-피롤린(2-acetyl-1-pyrroline; 2AP)인 것으로 알려져 있으며, 상기 화합물은 벼(rice)의 염색체 8(chromosome 8)에 존재하는 베타인 알데히드탈수소효소 유전자(Betaine aldehyde dehydrogenase gene; Badh2)의 염기의 치환, 결실 및 삽입 등으로 인한 변이가 발생하여 기능을 상실했기 때문인 것으로 연구되었다 (미국등록특허 제7847083호).
Badh2 유전자의 기능성 대립유전자(functional alleles)에 발생하는 변이는 염기의 치환, 결실 및 삽입에 의해 발생하는 것으로 알려져 있으며, 방향 형성(aroma formation)과 높은 관계가 있는 약 23개의 단상형(haplotype)이 발견되었다. 이들 기능성 대립 유전자에 변이가 하나 이상 발생하게 되면, Badh2 유전자의 기능이 상실되게 되므로, Badh2 유전자에 존재하는 다양한 기능적 돌연변이로 입증된 단상형(haplotype)을 효과적으로 검출하는 것이 중요하다.
본 발명의 상기 향미 품종 판별용 프라이머 세트는 Badh2 유전자에 존재하는 다양한 기능적 돌연변이로 입증된 단상형(haplotype)을 효과적으로 검출할 수 있으며, Badh2 유전자 5' UTR의 3bp 결실로 인한 변이; 엑손 2의 7bp 결실로 인한 변이; 엑손 7의 8bp 결실로 인한 변이; 엑손 12의 3bp 결실로 인한 변이; 엑손 13의 3bp 삽입으로 인한 변이; 및 엑손 14의 1bp 삽입으로 인한 변이;로 구성된 군에선 선택된 하나 이상의 변이를 포함하는 Badh2 유전자의 변이를 특이적으로 검출할 수 있다.
상기 베타인 알데히드탈수소효소 유전자(Betaine aldehyde dehydrogenase gene; Badh2)는 기본적으로 genbank accession no. AB096083 또는 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하지만, 무수히 많이 존재하는 벼(rice)품종에 따라 염기서열의 일부가 상이하므로, 본 발명의 향미 품종 판별용 프라이머는 상기 서열번호 11의 Badh2 유전자에 존재하는 변이만 한정적으로 검출하는 것이 아닌, 서열번호 11의 염기서열과 90 내지 100 %의 상동성을 가지고 있는 벼 유래 Badh2 유전자의 기능성 대립유전자에 존재하는 다양한 변이를 검출할 수 있다.
본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트는 서열번호 11(또는 genbank accession no. AB096083)로 표시되는 Badh2 유전자의 19 번째 염기 내지 181 번째 염기를 특이적으로 증폭시켜, Badh2 유전자 5' UTR 부분의 3bp(base pair)가 결실된 변이를 검출할 수 있으며, 상기 증폭된 염기서열의 길이는 일반 벼 품종의 경우 163bp, 향미 품종의 경우 160bp일 수 있다.
본 발명의 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트는 서열번호 11(또는 genbank accession no. AB096083)로 표시되는 Badh2 유전자의 414 번째 염기 내지 491 번째 염기를 특이적으로 증폭시켜, Badh2 유전자 엑손 2 부분의 7bp가 결실된 변이를 검출할 수 있으며, 상기 증폭된 염기서열의 길이는 일반 벼 품종의 경우 78bp, 향미 품종의 경우 71bp일 수 있다.
본 발명의 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트는 서열번호 11(또는 genbank accession no. AB096083)로 표시되는 Badh2 유전자의 2933 번째 염기 내지 3083 번째 염기를 특이적으로 증폭시켜, Badh2 유전자 엑손 7 부분의 8bp가 결실된 변이를 검출할 수 있으며, 상기 증폭된 염기서열의 길이는 일반 벼 품종의 경우 151bp, 향미 품종의 경우 143bp일 수 있다.
본 발명의 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트는 서열번호 11(또는 genbank accession no. AB096083)로 표시되는 Badh2 유전자의 5206 번째 염기 내지 5397 번째 염기를 특이적으로 증폭시켜, Badh2 유전자 엑손 12 부분의 3bp가 결실된 변이 또는 엑손 13 부분의 3bp가 삽입된 변이를 검출할 수 있으며, 상기 증폭된 염기서열의 길이는 일반 벼 품종의 경우 192bp, 향미 품종의 Badh2 유전자 엑손 12 부분에 변이가 존재하는 경우 189bp, 향미 품종의 Badh2 유전자 엑손 13 부분에 변이가 존재하는 경우 195bp일 수 있다.
본 발명의 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트는 서열번호 11(또는 genbank accession no. AB096083)로 표시되는 Badh2 유전자의 5715 번째 염기 내지 5979 번째 염기를 특이적으로 증폭시켜, Badh2 유전자 엑손 14 부분의 1bp가 삽입된 변이를 검출할 수 있으며, 상기 증폭된 염기서열의 길이는 일반 벼 품종의 경우 265bp, 향미 품종의 경우 266bp일 수 있다.
상기 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트는 RFLP(restricted fragment length polymorphism) 마커로 사용할 수 있으며, 상기 프라이머 세트에 의해 증폭된 증폭 산물에 제한효소 BslⅠ 처리하여 반응시킬 경우, 일반 벼 품종의 증폭산물이 제한효소 BslⅠ에 의해 절단되어 60bp 및 205bp 크기의 증폭산물이 생성될 수 있으며, 향미 품종의 경우 266bp의 증폭산물이 생성될 수 있다.
또한, 상기 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트는 RFLP(restricted fragment length polymorphism) 방법을 사용하여 인공적으로 교배한 F2 세대에서 향미 품종의 유전자형(genotype)을 구별할 수 있으며, 향미 품종의 경우 266bp, 일반 벼 품종의 경우 205bp, 이형접합(heterozygous) 일반 벼 품종의 경우 205bp 및 266bp 길이의 증폭산물을 생성시킬 수 있다.
본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트;로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 향미 품종 판별용 세트를 사용하여 일반 벼 품종과 향미 품종을 판별할 수 있으며, 구체적인 방법은 다음과 같다:
(a) 일반 벼 품종 또는 향미 품종의 시료에서 DNA를 분리하고, 증폭반응을 수행하여 벼의 염색체 8번에 위치하는 베타인 알데히드탈수소효소 유전자(Betaine aldehyde dehydrogenase gene; Badh2)를 증폭하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 증폭된 Badh2 유전자를 주형(template)으로 하고, 상기 향미 품종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 증폭반응에 의해 생성된 증폭산물의 염기서열 길이를 분석하여 염기 결실 또는 삽입에 의한 변이를 검출하는 단계;
를 포함하는 향미의 품종 판별 방법을 포함한다.
먼저, (a) 단계는 일반 벼 품종 또는 향미 품종의 시료에서 DNA를 분리하고, 증폭반응을 수행하여 벼의 염색체 8번에 위치하는 베타인 알데히드탈수소효소 유전자(Betaine aldehyde dehydrogenase gene; Badh2)를 증폭하는 단계이다.
본 발명에서는 일반 벼 품종과 향미 품종의 판별을 위해 25개의 향미 품종 및 전체 295개 품종(accession)에 대해서 전체 게놈 시퀀싱을 실시하였다. 벼 품종은 다양한 나라 유래의 품종으로부터 선택하였다.
본 발명의 일실시예에서는 각각의 벼에서 지노믹 DNA(genomic DNA)를 분리하기 위해 필드에서 성장한 벼의 묘목(seedling)의 잎 조직을 수득한 다음, CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide) 방법으로 DNA를 분리하여 사용하였다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서 Badh2 유전자는 서열번호 12 및 서열번호 13의 프라이머 세트; 서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머 세트; 서열번호 16 및 서열번호 17의 프라이머 세트; 서열번호 18 및 서열번호 19의 프라이머 세트; 서열번호 20 및 서열번호 21의 프라이머 세트; 서열번호 22 및 서열번호 23의 프라이머 세트; 서열번호 24 및 서열번호 25의 프라이머 세트; 서열번호 26 및 서열번호 27의 프라이머 세트; 서열번호 28 및 서열번호 29의 프라이머 세트; 서열번호 30 및 서열번호 31의 프라이머 세트;로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 증폭시킬 수 있다.
상기 프라이머 세트(표 2)는 25개의 향미 품종 및 5개의 일반 벼 품종의 Badh2 유전자를 특이적으로 증폭시킬 수 있으며 이전에 공지된 프라이머를 사용한 것으로, 벼의 Badh2 유전자 전체를 완전하게 증폭시킬 수 있는 프라이머를 제한 없이 사용할 수 있다. 295개의 코어 에세션의 유전자형(genotype)은 리시퀀싱 시스템(resquencing system)에 의해 제작하여 사용하였다.
상기 리시퀀싱 시스템은 기본적으로 시퀀싱이 완료되어 데이터베이스로 공개되어 있는 표준 유전체 데이터를 사용하여, 시퀀싱 하는 서열 단편들을 맞추어서 길게 이어나가는 방식이다.
본 발명에서는 전체 295개 품종(accession)의 유전자형을 분석하였으며, 벼의 Badh2 유전자의 엑손 변이에 기초하여 품종을 선별하였다. 도 2는 벼의 Badh2 유전자의 엑손 변이에 기초한 하플로타이핑(Haplotyping)을 수행하여 나타낸 모식도로, 초록색 블록은 엑손 부분을 의미한다.
다음으로, (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 증폭된 Badh2 유전자를 주형(template)으로 하고, 상기 향미 품종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하는 단계이다.
본 발명의 다른 일실시예에서, Badh2 유전자의 기능성 대립유전자에 포함된 변이를 검출하기 위해 총 5개의 프라이머 세트를 제작하였다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트는 각각 FMU1-2; FME2-7; FME7; FME12-3; 및 FME14Ⅰ;으로 명명하였으며, 상기 프라이머 세트는 각각 5' UTR 부분의 3bp(base pair)가 결실된 Badh2 유전자 변이; 엑손 2 부분의 7bp가 결실된 Badh2 유전자 변이; 엑손 7 부분의 8bp가 결실된 Badh2 유전자 변이; 엑손 12 부분의 3bp가 결실된 Badh2 유전자 변이 또는 엑손 13 부분의 3bp가 삽입된 Badh2 유전자 변이; 및 엑손 14 부분의 1bp가 삽입된 Badh2 유전자 변이;를 검출할 수 있다.
마지막으로, (c) 단계는 상기 증폭반응에 의해 생성된 증폭산물의 염기서열 길이를 분석하여 염기 결실 또는 삽입에 의한 변이를 검출하는 단계이다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트를 사용하여 증폭반응을 수행하는 경우, 증폭산물의 염기서열 길이는 일반 벼 품종의 경우 163bp, 향미 품종의 경우 160bp로,
도 4 A에 나타난 바와 같이, 전기영동으로 증폭산물의 크기를 확인한 결과, 일반 벼 품종과 향미 품종의 증폭산물의 크기가 상이한 것을 확인하였으며, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 이용하여 향미 품종의 판별이 가능한 것을 확인하였다.
상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 사용하여 증폭반응을 수행하는 경우, 증폭산물의 염기서열 길이는 일반 벼 품종의 경우 78bp, 향미 품종의 경우 71bp로,
도 4 B에 나타난 바와 같이, 전기영동으로 증폭산물의 크기를 확인한 결과, 일반 벼 품종과 향미 품종의 증폭산물의 크기가 상이한 것을 확인하였으며, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 이용하여 향미 품종의 판별이 가능한 것을 확인하였다.
상기 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트를 사용하여 증폭반응을 수행하는 경우, 증폭산물의 염기서열 길이는 일반 벼 품종의 경우 151bp, 향미 품종의 경우 143bp로,
도 4 C에 나타난 바와 같이, 전기영동으로 증폭산물의 크기를 확인한 결과, 일반 벼 품종과 향미 품종의 증폭산물의 크기가 상이한 것을 확인하였으며, 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트를 이용하여 향미 품종의 판별이 가능한 것을 확인하였다.
상기 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트를 사용하여 증폭반응을 수행하는 경우, 증폭산물의 염기서열 길이는 일반 벼 품종의 경우 192bp, 향미 품종의 경우 189bp 또는 195bp로,
도 4 D에 나타난 바와 같이, 전기영동으로 증폭산물의 크기를 확인한 결과, 일반 벼 품종과 향미 품종의 증폭산물의 크기가 상이한 것을 확인하였으며, Badh2 유전자 엑손 12 부분이 변이가 발생한 향미 품종 및 Badh2 유전자 엑손 13 부분이 변이가 발생한 향미 품종의 판별도 가능한 것으로 확인하였다.
상기 (b) 단계에서 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하는 경우, 증폭 반응에 의해 생성된 증폭산물에 제한효소 BslⅠ을 처리하여 반응시키는 단계;를 더 포함할 수 있으며, 제한효소 처리에 의해 일반 벼 품종의 경우 60bp 및 205bp, 향미 품종의 경우 266bp의 증폭산물이 생성될 수 있다.
도 4 E에 나타난 바와 같이, 전기영동으로 증폭산물의 크기를 확인한 결과, 일반 벼 품종과 향미 품종의 증폭산물의 크기가 상이한 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 서열번호 7 및 8 또는 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트를 이용하여 F2 세대의 향미 품종의 유전자형을 판별할 수 있는지 확인 하였다. F2 세대에서 14종을 선별하여 벼의 지노믹 DNA 추출 및 Badh2 유전자의 증폭은 실시예 2의 방법과 동일한 방법으로 수행하였으며, 각각의 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 증폭산물에 제한효소 BslⅠ을 처리하여 반응시킨 다음, 전기영동하여 증폭산물의 크기를 측정하였다.
즉, 본 발명의 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트를 이용하여 인공교배로 제조된 F2 세대에서 향기 특성을 가진 품종을 정확하게 판별할 수 있는 것을 확인하였으며, 이는 본 발명의 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트는 향미 품종의 개량에 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.
따라서, 본 발명의 향미 품종 판별용 프라이머 세트는 Badh2 유전자 5' UTR의 3bp 결실로 인한 변이; 엑손 2의 7bp 결실로 인한 변이; 엑손 7의 8bp 결실로 인한 변이; 엑손 12의 3bp 결실로 인한 변이; 엑손 13의 3bp 삽입으로 인한 변이; 및 엑손 14의 1bp 삽입으로 인한 변이;로 구성된 군에선 선택된 하나 이상의 변이를 포함하는 Badh2 유전자의 변이를 특이적으로 검출할 수 있으므로, 일반 벼 품종과 향미 품종을 보다 신속, 정확하게 판별할 수 있는 효과가 있는 것을 확인하였다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트;로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 향미 품종 판별용 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 을 포함하는 향미 품종 판별용 키트를 포함한다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 통상적으로 품종 판별용 키트에 포함되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), DNA 중합효소 및 완충액(buffer solution) 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함할 수 있다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.
상기 키트에 포함되는 프라이머 세트는 일반 벼 품종과 향미 품종의 Badh2 유전자의 기능적 대립유전자에 발생하는 변이를 특이적으로 검출할 수 있는 향미 품종 판별용 프라이머 세트이며, 상기 키트에 포함되는 프라이머 세트는 본 발명의 향미 품종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 당업자가 용이하게 디자인할 수 있으며, 이와 같이 디자인된 프라이머 세트는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 바람직하게는, Badh2 유전자 5' UTR의 3bp 결실로 인한 변이; 엑손 2의 7bp 결실로 인한 변이; 엑손 7의 8bp 결실로 인한 변이; 엑손 12의 3bp 결실로 인한 변이; 엑손 13의 3bp 삽입으로 인한 변이; 및 엑손 14의 1bp 삽입으로 인한 변이;로 구성된 군에선 선택된 하나 이상의 변이를 포함하는 Badh2 유전자의 변이를 토대로 프라이머 세트를 디자인할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 키트는 향미 품종의 Badh2 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트;를 더 포함할 수 있으며,
상기 프라이머 세트는 서열번호 12 및 서열번호 13의 프라이머 세트; 서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머 세트; 서열번호 16 및 서열번호 17의 프라이머 세트; 서열번호 18 및 서열번호 19의 프라이머 세트; 서열번호 20 및 서열번호 21의 프라이머 세트; 서열번호 22 및 서열번호 23의 프라이머 세트; 서열번호 24 및 서열번호 25의 프라이머 세트; 서열번호 26 및 서열번호 27의 프라이머 세트; 서열번호 28 및 서열번호 29의 프라이머 세트; 서열번호 30 및 서열번호 31의 프라이머 세트;로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트일 수 있다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 벼 품종 선발
본 발명에서는 일반 벼 품종과 향미 품종의 판별을 위해 25종의 향미 품종 및 5종의 보통 벼 품종을 선별하였다. 상기 벼 품종들은 2012년 벼 재배기간 동안 공주대학교에서 재배된 것이다. 2013년 동안, '동지-wx'와 '몽돈재래(엑손 12에 3bp 결실)'의 교배를 통해 F2를 얻었으며, 이때 얻은 F2 씨앗은 2014년에 심어 재배하였다. 또 다른 F2는 향기나지 않는 일반 벼와 A30(엑손 14에 1bp 삽입) 사이에서의 교배를 통해 얻었다.
실시예
2. 향미에 대한 관능 평가
어린 잎 향기에 대한 평가는 Sood와 Siddiq(Sood B, Siddiq E et al., Indian Journal of Genetics and Plant Breeding, 38(2):268-275, 1978)의 방법에 따라, 실험자의 관능 평가로 실시되었다. 어린 잎의 약 2g을 15ml 용량의 튜브에 넣고, 1.7%의 KOH 수용액 10ml를 혼합하였다. 다음으로 튜브를 10분 동안 30°C 수조에 넣고 배양한 후, 향기를 맡아 평가하였다.
향기 관능성 평가에 따르면, 30 종(accession) 중 25 종이 향미로 관찰되었고, 나머지 5 종은 향기가 나지 않는 일반미였다. 또한, 295 벼 품종 중 13종이 향미로 관찰되었다(표 1 참조).
| Alleles | Sample ID | Fragrant |
| Badh2* | A01~A05 | - |
| badh2-UTR-E7 | A09, A10 | + |
| badh2-E2 | A06, A07, A08 | + |
| badh2-E7 | A11~A23, RWG-042, RWG-061, RWG-064, RWG-069, RWG-179, RWG-201, RWG-236, RWG-272, RWG-295 | + |
| badh2-E12 | RWG-031 | + |
| badh2-E13 | A24, A25, RWG-038 | + |
| badh2-E13.2 | A26, A27, A28, RWG-088, RWG-191, RWG-197 | + |
| badh2-E14 | A29, A30 | + |
*: Wide type +/-: Yes/No
실시예 3. 벼 badh2 유전자의 엑손 염기 다형성 분석
본 발명에서는 전체 295개 품종(accession)의 유전자형을 분석하였으며, 벼의 Badh2 유전자의 엑손 변이에 기초한 30개 품종을 선별하였다.
각각의 품종에서 지노믹 DNA(genomic DNA)를 분리하기 위해 필드(수원, 한국)에서 성장한 벼의 묘목(seedling)의 잎 조직을 수득한 다음, CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide) 방법으로 DNA를 분리하여 사용하였다.
벼 품종의 Badh2 유전자를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머는 이전에 공지된 논문(shi et al., Mol. Breed, 22:185, 2008)을 참고로 제작하였다(표 2 참조). PCR 증폭을 위해 10X 버퍼 2㎕, dNTP 4㎕, taq polymerase 0.2㎕, 10ppm 프라이머 0.5㎕ 및 50ng 지노믹 DNA로 구성되는 20㎕의 PCR 반응액을 제조하여, 각 벼 품종의 Badh2 유전자 부분을 증폭시켰다(Thermal Cycler S1000, bio-red).
| Primer name | Primer sequence(5'-3') | annealing temperature (℃） | Products size (bp) | |
| P1 | F : GTCTCTCCTCCAACATGCTC | 서열번호 12 | 61 | 995 |
| R : GTGGTGTCAGGTGTGGAGTG | 서열번호 13 | |||
| P2 | F: CCGAAGTCCGTACCAACTGC | 서열번호 14 | 58 | 972 |
| R: CAATCAGCCATGCTTCCAAC | 서열번호 15 | |||
| P3 | F: GTGCGTATCCTCTGTTCTGG | 서열번호 16 | 50 | 855 |
| R: CAAGCGTCTCTAGTCTAGCC | 서열번호 17 | |||
| P4 | F : CTGAGCTGGCTAGACTAGAG | 서열번호 18 | 58 | 1025 |
| R : CCATCAGGAGAGGATAGTTC | 서열번호 19 | |||
| P5 | F : CCTCCGTGTTAATGCAGCTC | 서열번호 20 | 61 | 1026 |
| R : CATAGCAAGTGGCATGTACC | 서열번호 21 | |||
| P6 | F : GGTTGGTCTTCCTTCAGGTG | 서열번호 22 | 50 | 926 |
| R : GTCCTTCCTAACTGCCTTCC | 서열번호 23 | |||
| P7 | F : CCAGACGAGCAGGATGCAAG | 서열번호 24 | 61 | 984 |
| R : CATGGTCAGGAGCAAGAAGC | 서열번호 25 | |||
| P8 | F : GTGGCAAGGAAGGCAGTTAG | 서열번호 26 | 61 | 912 |
| R : GCAATAAGGCTTGGAAGGAC | 서열번호 27 | |||
| P9 | F : TTTCAGCTTCTTGCTCCTGA | 서열번호 28 | 50 | 1023 |
| R : CAGTTAATCTCTGGCATCGC | 서열번호 29 | |||
| P10 | F : GGCCAACGATACTCAGTGAG | 서열번호 30 | 50 | 1083 |
| R : CCGGTCATCAGCTAACTTCC | 서열번호 31 | |||
295 품종의 badh2 염기서열은 295 전체 게놈을 다시 시퀀싱한 데이터를 IRGSP-1.0 기준 게놈 맵핑을 수행하여 얻을 수 있었다(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/download/archive/irgsp1/IRGSP-1.0_genome.fasta.gz).
이후, 염기서열 정렬(alignment)을 실시하였고, 이를 통해 본 발명자들은 다섯 대립 유전자를 발견하였다(표 3 참조).
| Alleles | Location | Sequence divergences | Marker development | Segregation test |
| badh2-p-5'UTR | 5' UTR | 3-bp deletion | N | - |
| badh2-E1.1 | Exon 1 | 2-bp deletion | N | - |
| badh2 -E1.2 | Exon1 - intron1 junction | G/A snp | Y | Y |
| badh2 -E2.1 | Exon 2 | 7-bp deletion | Y | Y |
| badh2-E2.2 | Exon 2 | 75-bp deletion | N | - |
| badh2-E4-5.1 | Exon4 to exon5 | 806-bp deletion | N | - |
| badh2-E4-5.2 | Exon4 to exon5 | 803-bp deletion | Y | N |
| badh2 -E7 | Exon 7 | 8-bp deletion | Y | Y |
| badh2-E8 | Exon 8 | 7-bp insertion | N | - |
| badh2-E10.1 | Exon 10 | 1-bp insertion | N | - |
| badh2-E10.2 | Exon 10 | 1-bp deletion | N | - |
| badh2-E10.3 | Exon 10 | G/T snp | N | - |
| badh2-E10.4 | Exon 10 | G/A snp | N | - |
| badh2 -E12* | Exon 12 | 3-bp deletion | Y | Y |
| badh2 -E13.1 | Exon 13 | 3-bp insertion | Y | Y |
| badh2-E13.2 | Exon 13 | C/T snp | N | - |
| badh2-E14.1 | Exon 14 | 1-bp insertion | Y | N |
| badh2-E14.2 | Exon 14 | G/T snp | N | - |
*: Discovered in this study
25 종의 향미 중 13 종은 엑손 7에 8bp 결실, 3 종은 엑손 2에 7bp 결실, 3 종은 엑손 13에 C/T SNP를 하나 가지며, 2 종은 엑손 13에 3bp 삽입 그리고 2 종은 엑손 14에 1bp의 삽입을 가진다. 이러한 결과는 이전에 이미 보고된 것이었다. 하지만, 이 중 2 종은 5' UTR의 3bp 결실과 엑손7의 8bp가 결실된 것이었고, 이는 처음 보고되는 것이다.
우리는 295 품종의 전체 게놈을 재시퀀싱한 데이터로부터 신규한 badh2 대립 유전자를 발견하였다. 엑손 7에 8bp 결실은 9 종에서 나타났고, 엑손 13에 C/T SNP는 3 종에서 나타났다. 엑손 12에 3bp 결실을 포함하는 새로운 대립 유전자는 한국 재래종 '몽돈재래'에서 발견되었다. 3bp 결실로 하나의 아미노산이 손상되었으며, 이는 벼에 향기를 부여하였다(도 3 참조).
실시예 4. 향미 품종 검출용 프라이머 제작
우리는 5' UTR에 3bp 결실, 엑손2에 7bp 결실, 엑손 7에 8bp 결실 및 엑손 13에 3bp 삽입을 검출하기 위한 기능 마커와 엑션 14에 1bp 삽입을 검출하기 위한 CAP 마커를 설계하였다. 새롭게 발견된 대립 유전자 badh2-E12에 대하여 본 발명자는 측면 순서에 따라 여러가지 마커를 설계하였다. 그 후 명확하고 적당한 크기의 PCR 산물을 생성하는 최적의 프라이머를 선정하였다.
Badh2 유전자의 엑손 14에 기능적 삽입을 표지하는 절단 증폭 다형성 염기서열(CAPS) 마커는 Primer Premier v. 5.0 소프트웨어(Lalitha 2000)와 NEBcutter v. 2.0을 이용하여 개발되었다. 나머지 4개의 프라이머는 Primer Premier v.5.0 소프트웨어를 이용하여 개발되었다.
그 결과, 총 5개의 프라이머 세트를 제작하였다(표 4 참조). 4개의 프라이머 FMU1-2, FME2-7, FME7-1 및 FME14는 잘 알려진 대립 유전자로부터 선택하였다. 또한, 새로운 형질인 엑손 12에 3bp 삽입을 검출하기 위한 최적의 프라이머로 FME12-3을 선택하였다. FME12-3 마커는 엑손 13에 3bp 결실 또한 검출할 수 있다. FME12-3은 엑손 12에 3bp 결실 및 엑손 13에 3bp 삽입 형질에서 142bp 영역을 증폭할 수 있다.
| Primer | Sequencing(5'-3') | Product size | Start | End | Target region | |
| FMU1-2 | F: TCCCACCACCACTCCACA | 서열번호 1 | 163/160 | 19 | 181 | 3bp deletion in 5'UTR |
| R: ACGAAGAGCTGCCGCTGC | 서열번호 2 | 163/160 | 19 | 181 | 3bp deletion in 5'UTR | |
| FME2-7 | F : ACGAAGAGCTGCCGCTGC | 서열번호 3 | 78/71 | 414 | 491 | 7bp deletion in exon 2 |
| R: GCGATTGCGCGGAGGTACT | 서열번호 4 | 78/71 | 414 | 491 | 7bp deletion in exon 2 | |
| FME7 | F: TCCTGTAATCATGTATACCC | 서열번호 5 | 151/143 | 2933 | 3083 | 8bp deletion in exon 7 |
| R: AATTTGGAAACAAACCTT | 서열번호 6 | 151/143 | 2933 | 3083 | 8bp deletion in exon 7 | |
| FME12-3 | F: TTGGTCCAGTGCTCTGTGTG | 서열번호 7 | 192/189 | 5206 | 5397 | 3bp deletion in exon 12 |
|
|
R: AGCACCAGCCAGACCATAAC | 서열번호 8 | 192/195 | 5206 | 5397 | 3bp insertion in exon 13 |
| FME14I | F:TCGATGCCGGAATTATCTGGGTGA | 서열번호 9 | 265/266(또는 60, 205/266) | 5715 | 5979 | 1bp insertion in exon 14 |
| R:TCCCCACGGCTCATCGGAG | 서열번호 10 | 60, 205/266 | 5715 | 5979 | 1bp insertion in exon 14 | |
FMU1-2 프라이머는 일반미/향미에서 각각 163/160bp PCR 산물을 생성하고, FME2-7 프라이머와 FME7 프라이머는 각각 78/71, 151/143bp의 PCR 산물을 생성한다. FME14Ⅰ는 일반미에서 265bp, 향미에서 266bp의 PCR 산물을 생성하고, 여기에 BslⅠ 제한효소를 처리하면 향기나지 않는 일반미는 205bp 및 60bp 단편으로 분리되며, 향미는 266bp의 단편이 검출된다. 마지막으로 FME12-3 프라이머는 엑손 12(badh2-E12)의 대립 유전자에 대하여 192/189bp의 PCR 산물을 생성하고, 엑손 13(badh2-E13)의 대립 유전자에 대하여 192/195bp의 PCR 산물을 생성한다.
실시예 5. 벼의
Badh2
유전자 변이 검출
DNA는 CTAB 절차(doyle 1991)에 따라, 벼 잎으로부터 추출하였다. 총 20㎕부피의 PCR 반응은 10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 0.1% Triton X-100, 1.8 mM MgCl2, 0.1 mM dNTPs, 0.2 mM 프라이머, 1U Taq DNA 폴리머레이즈 및 50 ng의 게놈 DNA를 포함한다. 엑손 2가 높은 GC 함량을 보이기 때문에, 10㎕당 1㎕의 DMSO를 PCR 반응에 첨가하였다.
PCR 반응은 Thermal Cycler S1000으로 수행하였으며, 94℃에서 5분간 초기 변성을 실시하고, 이어서, 94℃에서 30초, 50 - 61℃에서 30초 그리고 72℃에서 1분을 한 싸이클로 하여, 총 30사이클을 실시하였다. 그 후, 최종 신장 과정을 72℃에서 10분간 실시하였다.
서열번호 9 및 서열번호 10의 E14I 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행한 경우, 생성된 증폭산물에 제한효소인 BslⅠ을 BioLabs에서 제공하는 메뉴얼에 따라 처리하였다. 1㎍ DNA에 1U 효소를 첨가하여 전체 반응 부피가 50㎕이 되도록 한 다음 55℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
상기 5개의 프라이머 세트에 의해 증폭된 PCR 증폭산물 중 FME2-7, FME7 및 FME14I의 PCR 산물은 3% 아가로스 겔에서 분리하였으며, FMU1-2 및 FME12-3의 PCR 산물은 6% 변성 폴리 아크릴 아마이드 겔에서 분리하였다.
상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 사용하여 증폭반응을 수행하는 경우, 증폭산물의 염기서열 길이는 일반 벼 품종의 경우 163bp, 향미 품종의 경우 160bp로,
도 4 A에 나타난 바와 같이, 전기영동으로 증폭산물의 크기를 확인한 결과, 일반 벼 품종과 향미 품종의 증폭산물의 크기가 상이한 것을 확인하였으며, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 이용하여 향미 품종의 판별이 가능한 것을 확인하였다.
상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 사용하여 증폭반응을 수행하는 경우, 증폭산물의 염기서열 길이는 일반 벼 품종의 경우 78bp, 향미 품종의 경우 71bp로,
도 4 B에 나타난 바와 같이, 전기영동으로 증폭산물의 크기를 확인한 결과, 일반 벼 품종과 향미 품종의 증폭산물의 크기가 상이한 것을 확인하였으며, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 이용하여 향미 품종의 판별이 가능한 것을 확인하였다.
상기 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트를 사용하여 증폭반응을 수행하는 경우, 증폭산물의 염기서열 길이는 일반 벼 품종의 경우 151bp, 향미 품종의 경우 143bp로,
도 4 C에 나타난 바와 같이, 전기영동으로 증폭산물의 크기를 확인한 결과, 일반 벼 품종과 향미 품종의 증폭산물의 크기가 상이한 것을 확인하였으며, 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트를 이용하여 향미 품종의 판별이 가능한 것을 확인하였다.
상기 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트를 사용하여 증폭반응을 수행하는 경우, 증폭산물의 염기서열 길이는 일반 벼 품종의 경우 192bp, 향미 품종의 경우 189bp 또는 195bp로,
도 4 D에 나타난 바와 같이, 전기영동으로 증폭산물의 크기를 확인한 결과, 일반 벼 품종과 향미 품종의 증폭산물의 크기가 상이한 것을 확인하였으며, Badh2 유전자 엑손 12 부분이 변이가 발생한 향미 품종 및 Badh2 유전자 엑손 13 부분이 변이가 발생한 향미 품종의 판별도 가능한 것으로 확인하였다.
도 4 E에 나타난 바와 같이, 일반 벼 품종의 증폭산물이 제한효소 BslⅠ에 의해 절단되어 60bp 및 205bp 크기의 증폭산물이 생성되는 것을 확인하였으며, 향미 품종의 경우 제한효소에 의해 절단되지 않으므로, 266bp의 증폭산물이 생성되는 것을 확인하였다.
실시예 6. F2 세대의 향미 품종 판별
향기가 나지 않는 일반미와 Ar-30 품종(badh2-E14 대립 유전자를 가짐) 사이에서 그리고 동진-wx(야생형)과 몽돈재래(엑손 12에 3bp 결실)사이에서 교배되어 얻어진 F2의 유전자형을 각각 분석하기 위하여, 기능 마커 FME14Ⅰ(서열번호 7 및 8)과 FME12-3(서열번호 9 및 10)이 사용되었다.
F2 세대에서 14종을 무작위로 선별하여 벼의 지노믹 DNA 추출 및 Badh2 유전자의 증폭은 실시예 2의 방법과 동일한 방법으로 수행하였으며, 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 증폭산물에 제한효소 BslⅠ을 처리하여 반응시킨 다음, 전기영동하여 증폭산물의 크기를 측정하였다.
본 발명자들은 향기가 나지 않는 일반미와 Ar-30품종의 교배로 얻어진 F2 세대에서 13 개체를 선정하였다. 13 개체 중 오직 하나의 개체에서 1bp 삽입이 발견되었으며, 8 개체에서 이형 접합(heterozygous)이고, 4 개체가 야생형이었다. 1bp 삽입된 개체에서 향기가 났으나, 반면 이형 접합체와 야생형에서는 향기가 나지 않았다(도 5a).
동진-wx와 몽돈재래 품종의 교배를 통해 얻어진 F2 세대(badh2/badh2-E12)에서도 밴드 패턴에 따라, 2 개체는 3bp 결실이 있었으며, 밴드 두 개를 띄는 7 개체는 이형 접합체이고, 4 개체는 야생형이었다(도 5b). 여기서 3bp가 결실된 개체는 향기가 났고, 나머지 개체는 향기가 나지 않았다. 이러한 결과는 쌀 향기에 대해서 badh2가 열성인자는 것을 의미한다.
이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> KONGJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION
<120> Primer set for Discrimination of Aromatic Rice and Use Thereof
<130> 1066007
<160> 31
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMU1-2 F primer
<400> 1
tcccaccacc actccaca 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMU1-2 R primer
<400> 2
acgaagagct gccgctgc 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FME2-7 F primer
<400> 3
acgaagagct gccgctgc 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FME2-7 R primer
<400> 4
gcgattgcgc ggaggtact 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FME7 F primer
<400> 5
tcctgtaatc atgtataccc 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FME7 R primer
<400> 6
aatttggaaa caaacctt 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FME12-3 F primer
<400> 7
ttggtccagt gctctgtgtg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FME12-3 R primer
<400> 8
agcaccagcc agaccataac 20
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FME14I F primer
<400> 9
tcgatgccgg aattatctgg gtga 24
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FME14I R primer
<400> 10
tccccacggc tcatcggag 19
<210> 11
<211> 1512
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> badh2 gene sequence
<400> 11
atggccacgg cgatcccgca gcggcagctc ttcgtcgccg gcgagtggcg cgcccccgcg 60
ctcggccgcc gcctccccgt cgtcaacccc gccaccgagt cccccatcgg cgagatcccg 120
gcgggcacgg cggaggacgt ggacgcggcg gtggcggcgg cgcgggaggc gctgaagagg 180
aaccggggcc gcgactgggc gcgcgcgccg ggcgccgtcc gggccaagta cctccgcgca 240
atcgcggcca agataatcga gaggaaatct gagctggcta gactagagac gcttgattgt 300
gggaagcctc ttgatgaagc agcatgggac atggacgatg ttgctggatg ctttgagtac 360
tttgcagatc ttgcagaatc cttggacaaa aggcaaaatg cacctgtctc tcttccaatg 420
gaaaacttta aatgctatct tcggaaagag cctatcggtg tagttgggtt gatcacacct 480
tggaactatc ctctcctgat ggcaacatgg aaggtagctc ctgccctggc tgctggctgt 540
acagctgtac taaaaccatc tgaattggct tccgtgactt gtttggagct tgctgatgtg 600
tgtaaagagg ttggtcttcc ttcaggtgtg ctaaacatag tgactggatt aggttctgaa 660
gccggtgctc ctttgtcatc acaccctggt gtagacaagg ttgcatttac tgggagttat 720
gaaactggta aaaagattat ggcttcagct gctcctatgg ttaagcctgt ttcactggaa 780
cttggtggaa aaagtcctat agtggtgttt gatgatgttg atgttgaaaa agctgttgag 840
tggactctct ttggttgctt ttggaccaat ggccagattt gcagtgcaac atcgcgtctt 900
attcttcata aaaaaatcgc taaagaattt caagaaagga tggttgcatg ggccaaaaat 960
attaaggtgt cagatccact tgaagagggt tgcaggcttg ggcccgttgt tagtgaagga 1020
cagtatgaga agattaagca atttgtatct accgccaaaa gccaaggtgc taccattctg 1080
actggtgggg ttagacccaa gcatctggag aaaggtttct atattgaacc cacaatcatt 1140
actgatgtcg atacatcaat gcaaatttgg agggaagaag tttttggtcc agtgctctgt 1200
gtgaaagaat ttagcactga agaagaagcc attgaattgg ccaacgatac tcattatggt 1260
ctggctggtg ctgtgctttc cggtgaccgc gagcgatgcc agagattaac tgaggagatc 1320
gatgccggaa ttatctgggt gaactgctcg caaccctgct tctgccaagc tccatggggc 1380
gggaacaagc gcagcggctt tggacgcgag ctcggagaag ggggcattga caactaccta 1440
agcgtcaagc aagtgacgga gtacgcctcc gatgagccgt ggggatggta caaatcccct 1500
tccaagctgt aa 1512
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P1 forward primer
<400> 12
gtctctcctc caacatgctc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P1 reverse primer
<400> 13
gtggtgtcag gtgtggagtg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2 forward primer
<400> 14
ccgaagtccg taccaactgc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2 reverse primer
<400> 15
caatcagcca tgcttccaac 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P3 forward primer
<400> 16
gtgcgtatcc tctgttctgg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P3 reverse primer
<400> 17
caagcgtctc tagtctagcc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P4 forward primer
<400> 18
ctgagctggc tagactagag 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P4 reverse primer
<400> 19
ccatcaggag aggatagttc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P5 forward primer
<400> 20
cctccgtgtt aatgcagctc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P5 reverse primer
<400> 21
catagcaagt ggcatgtacc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P6 forward primer
<400> 22
ggttggtctt ccttcaggtg 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P6 reverse primer
<400> 23
gtccttccta actgccttcc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P7 forward primer
<400> 24
ccagacgagc aggatgcaag 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P7 reverse primer
<400> 25
catggtcagg agcaagaagc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P8 forward primer
<400> 26
gtggcaagga aggcagttag 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P8 reverse primer
<400> 27
gcaataaggc ttggaaggac 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P9 forward primer
<400> 28
tttcagcttc ttgctcctga 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P9 reverse primer
<400> 29
cagttaatct ctggcatcgc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P10 forward primer
<400> 30
ggccaacgat actcagtgag 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10 reverse primer
<400> 31
ccggtcatca gctaacttcc 20
Claims (9)
- 서열번호 1 및 서열번호 2 로 표시되는 프라이머 서열을 포함하는 국산 재래 향미 품종 판별용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 향미 품종 판별용 프라이머 세트는 벼의 염색체 8번에 존재하는 베타인 서열번호 11로 표시되는 알데히드탈수소효소 유전자(Betaine aldehyde dehydrogenase gene; Badh2)의 염기 결실(deletion) 또는 삽입(insertion)으로 인해 발생한 변이를 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 하는 국산 재래 향미 품종 판별용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 11로 표시되는 Badh2 유전자의 19 번째 염기 내지 181 번째 염기를 특이적으로 증폭시켜, Badh2 유전자 5' UTR 부분의 3bp(base pair)가 결실된 변이를 검출할 수 있으며,
상기 증폭된 염기서열의 길이는 일반 벼 품종의 경우 163bp, 향미 품종의 경우 160bp인 것을 특징으로 하는 국산 재래 향미 품종 판별용 프라이머 세트.
- (a) 일반 벼 품종 또는 향미 품종의 시료에서 DNA를 분리하고, 증폭반응을 수행하여 벼의 염색체 8번에 위치하는 베타인 알데히드탈수소효소 유전자(Betaine aldehyde dehydrogenase gene; Badh2)를 증폭하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 증폭된 Badh2 유전자를 주형(template)으로 하고, 상기 청구항 제1항에 따른 향미 품종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 증폭반응에 의해 생성된 증폭산물의 염기서열 길이를 분석하여 염기 결실 또는 삽입에 의한 변이를 검출하는 단계;
를 포함하는 국산 재래 향미의 품종 판별 방법.
- 제4항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 Badh2 유전자는 서열번호 12 및 서열번호 13의 프라이머 세트; 서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머 세트; 서열번호 16 및 서열번호 17의 프라이머 세트; 서열번호 18 및 서열번호 19의 프라이머 세트; 서열번호 20 및 서열번호 21의 프라이머 세트; 서열번호 22 및 서열번호 23의 프라이머 세트; 서열번호 24 및 서열번호 25의 프라이머 세트; 서열번호 26 및 서열번호 27의 프라이머 세트; 서열번호 28 및 서열번호 29의 프라이머 세트; 서열번호 30 및 서열번호 31의 프라이머 세트;로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 증폭시키는 것을 특징으로 하는 국산 재래 향미의 품종 판별 방법.
- 제4항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 프라이머 세트를 사용하여 증폭반응을 수행하는 경우, 증폭산물의 염기서열 길이는 일반 벼 품종의 경우 163bp, 향미 품종의 경우 160bp인 것을 특징으로 하는 국산 재래 향미의 품종 판별 방법.
- 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 서열을 포함하는 향미 품종 판별용 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 을 포함하는 국산 재래 향미 품종 판별용 키트.
- 제7항에 있어서,
상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP); DNA 중합효소; 및 완충액(buffer solution);으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 국산 재래 향미 품종 판별용 키트.
- 제7항에 있어서,
상기 키트는 향미 품종의 서열번호 11로 표시되는 Badh2 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트;를 더 포함할 수 있으며,
상기 프라이머 세트는 서열번호 12 및 서열번호 13의 프라이머 세트; 서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머 세트; 서열번호 16 및 서열번호 17의 프라이머 세트; 서열번호 18 및 서열번호 19의 프라이머 세트; 서열번호 20 및 서열번호 21의 프라이머 세트; 서열번호 22 및 서열번호 23의 프라이머 세트; 서열번호 24 및 서열번호 25의 프라이머 세트; 서열번호 26 및 서열번호 27의 프라이머 세트; 서열번호 28 및 서열번호 29의 프라이머 세트; 서열번호 30 및 서열번호 31의 프라이머 세트;로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 국산 재래 향미 품종 판별용 키트.
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